專利名稱：用于無變性制備可溶性重組干擾素蛋白的方法
用于無變性制備可溶性重組干擾素蛋白的方法優(yōu)先權(quán)聲明本申請(qǐng)根據(jù)35U.S.C. § 119(e)要求于2010年3月4日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)61/310，671的優(yōu)先權(quán)。美國專利申請(qǐng)序列號(hào)61/310，671的內(nèi)容在此通過引用全文并入。
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背景技術(shù)：
許多異源重組蛋白在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)以錯(cuò)折疊的不溶性形式(稱為包涵體)產(chǎn)生。一般地，必須使用變性試劑以溶解包涵體中的重組蛋白。然后該蛋白必須在已對(duì)于蛋白質(zhì)的適當(dāng)折疊進(jìn)行優(yōu)化的條件下復(fù)性。在優(yōu)化上花費(fèi)的努力以及緩慢的重折疊過程和降低的過程產(chǎn)率增加了重組蛋白生產(chǎn)的成本和時(shí)間。干擾素表現(xiàn)出抗病毒、抗增殖、免疫調(diào)節(jié)和其它活性。幾種不同類型的人干擾素(包括α、β和Y)已基于例如其抗病毒和抗增殖活性進(jìn)行區(qū)分。干擾素的分泌通過信號(hào)(包括病毒、雙鏈RNA、其它多核苷酸、抗原和有絲分裂原)誘導(dǎo)。干擾素_β是已在細(xì)菌中以重組形式表達(dá)的蛋白質(zhì)的實(shí)例，其中它隔離在包涵體中。人干擾素-β Ib是分子量為約22kDa和由165個(gè)氨基酸殘基組成的調(diào)節(jié)性多肽。它可以由機(jī)體中的許多細(xì)胞(特別是成纖維細(xì)胞)響應(yīng)于病毒感染或?qū)ζ渌镂镔|(zhì)的暴露而產(chǎn)生。它結(jié)合多聚的細(xì)胞表面受體。產(chǎn)生性的受體結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)事件的級(jí)聯(lián)，從而導(dǎo)致干擾素_β誘導(dǎo)基因的表達(dá)和觸發(fā)抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)活性。干擾素_β lb,具體地說Betaseron (h-IFN-β Ib C17S),已經(jīng)被用于治療疾病，包括多發(fā)性硬化(MS)、乙型肝炎和丙型肝炎感染、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和黑素瘤。干擾素-β已經(jīng)證明減少患有復(fù)發(fā)的和緩解的MS的患者遭受侵襲的次數(shù)。需要大量的干擾素_β Ib用于治療用途。重組干擾素Ib已在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以低水平生產(chǎn)，包括人成纖維細(xì)胞和CHO細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)通常受到包括更長的處理時(shí)間、容易發(fā)生培養(yǎng)物的污染、需要維持嚴(yán)格的培養(yǎng)條件和高昂的培養(yǎng)基成本的技術(shù)難題的阻礙。由于已發(fā)現(xiàn)糖蛋白成分一般對(duì)于干擾素β的活性不是必須的，研究已經(jīng)轉(zhuǎn)向在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)(大腸桿菌)中表達(dá)重組蛋白。如已經(jīng)注意到的，在大腸桿菌中生成的包涵體必須通過變性溶解，且干擾素β必須重折疊。重折疊(其為緩慢的)延長了處理時(shí)間、增加了成本且降低了產(chǎn)率。目前為止，用于在哺乳動(dòng)物或細(xì)菌宿主細(xì)胞中快速和經(jīng)濟(jì)地產(chǎn)生高水平的可溶性重組干擾素-β而無需變性和重折疊步驟的方法尚未見描述。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于在熒光假單胞菌中表達(dá)干擾素和開發(fā)使用溫和去垢劑和無需重折疊過程而從發(fā)酵產(chǎn)物提取活性蛋白的方法。特別地，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生重組I型干擾素蛋白的方法，所述方法包括通過培養(yǎng)包含表達(dá)構(gòu)建體的假單胞菌或大腸桿菌宿主細(xì)胞表達(dá)重組干擾素蛋白，該表達(dá)構(gòu)建體包含已經(jīng)針對(duì)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的編碼序列；裂解所述宿主細(xì)胞；從所述裂解步驟獲得不溶性部分和可溶性部分；通過使所述不溶性部分經(jīng)歷非變性提取條件而對(duì)其進(jìn)行提?。缓蛷乃霾蝗苄圆糠肢@得提取沉淀和提取上清液，其中在所述提取上清液中的重組蛋白以可溶性形式、活性形式或其組合形式存在而無需進(jìn)一步進(jìn)行復(fù)性或重折疊步驟。在實(shí)施方式中，所述非變性提取條件包括存在溫和去垢劑。在某些實(shí)施方式中，所述溫和去垢劑是兩性離子去垢劑。在特定實(shí)施方式中，所述兩性離子去垢劑是Zwittergent3-08、Zwittergent 3-10、Zwittergent3_12 或 Zwittergent 3-14。在實(shí)施方式中，所述非變性提取條件包括約O. 5%至約2%的Zwittergent 3_14。在某些實(shí)施方式中，所述溫和去垢劑不是N-月桂?；?肌氨酸(NLS)。在實(shí)施方式中，所述非變性提取條件包括溫和去垢劑的存在且進(jìn)一步包括離液劑和親液鹽(cosmotropic salt)。在某些實(shí)施方式中，所述離液劑是尿素或鹽酸胍,和所述親液鹽是NaCl、KCl或(NH4) 2S04。在特定實(shí)施方式中，所述非變性提取條件包括約O. 5至約2%的Zwittergent3_14 ;約O至約2M的尿素；約O至約2M的NaCl ;且pH為約6. 5至約·8.5。在實(shí)施方式中，所述非變性提取條件包括約1%的ZWittergent3-14 ；2M的尿素；2M的NaCl ;且pH為約8. 2。在其它實(shí)施方式中，所述非變性提取條件還包括約1%至約40%w/v的固形物。在某些實(shí)施方式中，所述非變性提取條件還包括約5% w/v的固形物。在實(shí)施方式中，所述重組I型干擾素蛋白是干擾素-β、干擾素-α、干擾素-K、干擾素-τ或干擾素_ω。在特定實(shí)施方式中，所述重組I型干擾素蛋白是干擾素_β或干擾素-α。在實(shí)施方式中，所述重組I型干擾素蛋白是干擾素_β，且所述干擾素選自 人干擾素-Plb和人干擾素-β Ib C17S。在實(shí)施方式中，其中所述重組I型干擾素蛋白是干擾素-α，且所述干擾素-α選自人干擾素-a 2a和人干擾素-α 2b。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所要求保護(hù)的方法進(jìn)一步包括測量所述不溶性部分和所述提取上清液部分中重組I型干擾素蛋白的量，其中所述提取上清液部分中檢測的重組干擾素蛋白的量為所述不溶性部分中檢測的重組干擾素蛋白的量的約10%至約95%。在其它實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括測量所述重組蛋白的活性，其中所述提取上清液部分中存在的重組蛋白的約40%至約100%測定為活性的。在相關(guān)的實(shí)施方式中，所述重組蛋白是干擾素_β，且所述活性重組蛋白的量通過Blue S印harose親和柱層析、受體結(jié)合分析、抗病毒活性分析或細(xì)胞病變效應(yīng)分析測定。在其它實(shí)施方式中，所述重組蛋白是干擾素-α、干擾素-K或干擾素_ω，且所述活性重組蛋白的量通過Blue Sepharose親和柱層析、受體結(jié)合分析、抗病毒活性分析或細(xì)胞病變效應(yīng)分析測定。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于產(chǎn)生重組I型干擾素蛋白的方法，所述方法包括通過培養(yǎng)包含表達(dá)構(gòu)建體的假單胞菌或大腸桿菌宿主細(xì)胞表達(dá)重組干擾素蛋白，該表達(dá)構(gòu)建體包含已經(jīng)針對(duì)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的編碼序列；裂解所述宿主細(xì)胞；從所述裂解步驟獲得不溶性部分和可溶性部分；通過使所述不溶性部分經(jīng)歷非變性提取條件而對(duì)其進(jìn)行提??；和從所述不溶性部分獲得提取沉淀和提取上清液，其中在所述提取上清液中的重組蛋白以可溶性形式、活性形式或其組合形式存在而無需進(jìn)一步進(jìn)行復(fù)性或重折疊步驟，其中所述重組蛋白是干擾素-β，且進(jìn)一步其中所述非變性提取條件使用圖4B中的信息優(yōu)化。在實(shí)施方式中，所述提取上清液中的重組蛋白以約O. 3克每升至約10克每升的濃度存在。在其它實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞在約I至20或更多升的體積中培養(yǎng)。在特定的實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞在約I升、約2升、約3升、約4升、約5升、約10升、約15或約20升的體積中培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述表達(dá)構(gòu)建體包含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在特定的實(shí)施方式中，所述表達(dá)構(gòu)建體包含Iac啟動(dòng)子衍生物且干擾素的表達(dá)通過IPTG誘導(dǎo)。在實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞生長于約25°C至約33°C的溫度下，約5. 7至約6. 5的pH下，且當(dāng)OD575達(dá)到約80至約160時(shí)添加IPTG達(dá)到約O. 08mM至約O. 4mM的終濃度。在特定實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞生長于約32°C的溫度下，約5. 7至約6. 25的pH下，且當(dāng)OD575達(dá)到約120至約160時(shí)添加IPTG達(dá)到約O. 2mM的終濃度。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述表達(dá)構(gòu)建體包含高活性核糖體結(jié)合位點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞是Ion hslUV蛋白酶缺失的菌株。在其它實(shí)施方式中，所述I型干擾素在所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。在相關(guān)的實(shí)施方式中，所述I型干擾素是人干擾 素-Plb或人干擾素-β Ib C17S，且所述人干擾素-i3 1b或人干擾素-i3 1b C17S在所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。本發(fā)明還提供用于提取重組I型干擾素蛋白的方法，其中所述重組干擾素蛋白存在于不溶性部分中，所述不溶性部分在表達(dá)所述重組干擾素蛋白的假單胞菌或大腸桿菌宿主細(xì)胞裂解后產(chǎn)生，所述方法包括使所述不溶性部分經(jīng)歷非變性提取條件；和從所述不溶性部分獲得提取沉淀，所述提取沉淀包含重組干擾素蛋白；其中所述提取沉淀中的重組干擾素蛋白在不經(jīng)歷復(fù)性或重折疊步驟的情況下為可溶性形式、活性形式或其組合的形式。在實(shí)施方式中，提取的重組I型干擾素蛋白是干擾素-β、干擾素-α、干擾素-K、干擾素-τ或干擾素_ω。在某些實(shí)施方式中，所述重組I型干擾素蛋白是干擾素_β或干擾素-α。在實(shí)施方式中，所述重組I型干擾素蛋白是干擾素_β，且所述干擾素選自人干擾素-Plb和人干擾素-β Ib C17S。在其它實(shí)施方式中，所述干擾素-α選自人干擾素-a 2a和人干擾素-a 2b。本發(fā)明進(jìn)一步包括用于產(chǎn)生包含重組I型干擾素蛋白的不溶性部分的方法，其中所述重組干擾素蛋白在假單胞菌或大腸桿菌宿主細(xì)胞中由包含與Iac衍生啟動(dòng)子可操作地連接的核酸序列的核酸構(gòu)建體表達(dá)，所述方法包括在約25°C至約33°C的溫度和約5. 7至約6. 5的pH下生長宿主細(xì)胞至約80至約160的OD6tltl ;和在約O. 08mM至約O. 4mM的IPTG濃度下誘導(dǎo)細(xì)胞；裂解所述宿主細(xì)胞并對(duì)其離心以產(chǎn)生沉淀部分；其中可溶的、活性的或可溶和活性的重組干擾素蛋白可以通過在非變性條件下提取所述沉淀部分獲得而無需后續(xù)的復(fù)性或重折疊步驟。在實(shí)施方式中，不溶性部分包含的重組I型干擾素蛋白是干擾素、干擾素-α、干擾素-K、干擾素-τ或干擾素-ω。在特定實(shí)施方式中，所述重組I型干擾素蛋白是干擾素或干擾素-α。在實(shí)施方式中，其中重組I型干擾素蛋白是干擾素_β，所述干擾素-β選自人干擾素-Plb和人干擾素-β Ib C17S。在實(shí)施方式中，其中所述I型干擾素蛋白是干擾素-α，且干擾素-α選自人干擾素-a 2a和人干擾素-a 2b。在實(shí)施方式中，在產(chǎn)生包含重組I型干擾素蛋白的不溶性部分的方法中，宿主細(xì)胞生長的溫度是約32°C，且IPTG濃度是約O. 2mM。通過引用引入
在本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)通過引用引入本文，正如各個(gè)出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)都特別地和單獨(dú)地說明通過引用引入本文一樣。附圖
簡述本發(fā)明的新穎特征在所附的權(quán)利要求書中詳細(xì)說明。參照下面給出的利用了本發(fā)明原理的說明性實(shí)施方式的詳細(xì)說明和附圖可以更好的理解本發(fā)明的特征和優(yōu)勢。圖I.從熒光假單胞菌株P(guān)S530-001回收的IFN- β的初始CGE評(píng)估。Α.在還原性條件下分析的蛋白質(zhì)。B.在非還原性條件下分析的蛋白質(zhì)。 對(duì)于A和B :道I :具有所示大小的分子量梯。
道2 :來自細(xì)胞裂解后的初始離心的沉淀物(不溶性部分)。道3-5 :來自細(xì)胞裂解后的初始離心的上清液(可溶性部分)。道6-9 :來自提取步驟后的離心的上清液。道6和7代表用PBS緩沖液提取，分別沒有或具有I %的Zwittergent 3-14,和道8和9代表用乙酸鹽提取，分別沒有或具有I %的 Zwittergent 3-14。道10-13 :來自提取步驟后的旋轉(zhuǎn)的沉淀。道10和11代表用PBS緩沖液提取，分別沒有或具有I %的Zwittergent 3-14,和道12和13代表用乙酸鹽提取，分別沒有或具有I %的 Zwittergent 3-14。圖2.用于評(píng)估使用不同去垢劑的干擾素_β提取的研究流程圖。圖3.用于評(píng)估使用不同提取條件(包括Zwittergent 3-14)的干擾素-β提取的統(tǒng)計(jì)學(xué)設(shè)計(jì)的研究流程圖。圖4.用于評(píng)估使用不同提取條件(包括Zwittergent 3-14)的干擾素-β提取的研究的結(jié)果。Α.統(tǒng)計(jì)概要。B.可用提取條件的范圍。圖5.對(duì)于重復(fù)發(fā)酵隨誘導(dǎo)后時(shí)間的不溶性IFN-β產(chǎn)生。對(duì)來自三個(gè)不同重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果繪圖。圖6.對(duì)于可選的pH和0D，隨誘導(dǎo)后時(shí)間的不溶性IFN-β產(chǎn)生。對(duì)來自三個(gè)不同重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果繪圖。圖7. IFN-β Ib 序列。A. IFN-β Ib C17S 氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。該序列顯示N-末端甲硫氨酸，其在純化的蛋白質(zhì)中不存在。B.對(duì)于熒光假單胞菌密碼子優(yōu)化的IFN-PDNA序列。這一序列編碼在圖7Α中顯示的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。C. IFN-β IbC17S氨基酸序列，沒有N-末端甲硫氨酸(SEQ ID NO 3)。圖8. IFN-a 2a序列。A. IFN-a 2a氨基酸序列(SEQ ID NO :4)。B.對(duì)于熒光假單胞菌來說密碼子優(yōu)化的IFN-a 2a DNA序列(SEQ ID NO :5)。圖9. IFN-a 2b序列。A. IFN-a 2b氨基酸序列(SEQ ID NO :6)。B.對(duì)于熒光假單胞菌來說密碼子優(yōu)化的IFN-a 2b DNA序列(SEQ ID NO :7)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于在假單胞菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生大量可溶性重組干擾素蛋白的方法。特別地，這一方法不需要通常必需的變性步驟和隨后的復(fù)性/重折疊步驟。在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生重組干擾素受到蛋白質(zhì)隔離在不溶性包涵體中的阻礙。包涵體的溶解需要變性，因而需要使用昂貴、費(fèi)時(shí)的重折疊步驟并降低了蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。本發(fā)明通過提供用于產(chǎn)生和溶解干擾素而不依賴于變性的方法消除了對(duì)于重折疊步驟的需要。提供了用于在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生可溶性的、活性的或具有這兩者的重組干擾素而不需要使蛋白質(zhì)經(jīng)歷變性步驟的方法。特別地，描述了得到可溶性干擾素蛋白的非變性提取方法。在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的干擾素一般定位于不溶性部分。在本發(fā)明的提取方法中，這種不溶性部分經(jīng)歷包括溫和去垢劑的非變性濃縮的提取條件并產(chǎn)生可溶性蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生重組干擾素蛋白的方法，其中假單胞菌宿主細(xì)胞的生長條件經(jīng)優(yōu)化以最大化可溶性重組干擾素蛋白的產(chǎn)率，特別是當(dāng)使用本發(fā)明的提取方法時(shí)。大腸桿菌生長條件對(duì)可溶性蛋白質(zhì)產(chǎn)生的影響的研究已經(jīng)進(jìn)行了報(bào)道。當(dāng)在假單胞菌中表達(dá)時(shí)，給定蛋白質(zhì)的溶解性可能與在大腸桿菌中不同。這在例如美國專利申請(qǐng)公開No. 2006/0040352, “Expression of Mammalian Proteins in Pseudomonas Fluorescens，， 中闡述，其顯示了使用大腸桿菌或熒光假單胞菌作為宿主產(chǎn)生的可溶量的幾種蛋白質(zhì)的平行(side-by-side)比較。此外，甚至在相同的宿主中不同蛋白質(zhì)的溶解性之間也存在實(shí)質(zhì)的差異，因?yàn)槿芙庑允艿降鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)例如氨基酸序列的強(qiáng)烈影響。之前報(bào)道的在大腸桿菌中產(chǎn)生IFN-β的嘗試產(chǎn)生了需要重折疊的蛋白質(zhì)。參見，例如Russell-Harde，1995, “The Use of Zwittergent 3-14 in the Purification of Recombinant HumanInterferon-β Serl7(Betaseron) et al., J.Interferon and Cytokine Res. 15 :31-37,and Ghane 等，2008, “Over Expression of Biologically Active Interferon BetaUsing Synthetic Gene in E. coli,，，J. of Sciences, Islamic Republic of Iran 19(3)203-209，這兩者都通過引用引入本文。所述方法進(jìn)一步提供優(yōu)化的生長條件，包括生長溫度、啟動(dòng)子誘導(dǎo)時(shí)的0D、誘導(dǎo)劑濃度和pH。提供的提取條件包括去垢劑類型和濃度、離液劑、親液鹽和pH。提供了特定的值和最佳參數(shù)范圍。還提供了用于使用所提供的范圍優(yōu)化提取條件的方法。細(xì)菌生長條件在本發(fā)明的實(shí)施方式中，細(xì)菌生長條件經(jīng)優(yōu)化以提高使用如本文中提供的提取方法獲得的可溶性干擾素蛋白的量。本發(fā)明的生長條件與其它提取條件(例如，在本領(lǐng)域中描述和使用的其它方法)一起使用也是可預(yù)期的。特別可用于與本發(fā)明的提取方法結(jié)合的最佳生長條件包括約25°C至約33°C的溫度、約5. 7至約6. 5的pH和當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到約80至約160的OD575時(shí)約0. 08mM至約0. 4mM的IPTG的誘導(dǎo)。培養(yǎng)物的pH可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的pH緩沖劑和方法維持。在培養(yǎng)過程中pH的控制也可以使用氨水實(shí)現(xiàn)。在實(shí)施方式中，培養(yǎng)物的pH為約5. 7至約6. 5。在某些實(shí)施方式中，pH是5·7、5·8、5·9、6·0、6· 1、6· 2、6· 3、6· 4或6. 5。在其它實(shí)施方式中，pH是
5.7至5. 9,5. 8至6. 0,5. 9至6. 1,6. O至6. 2,6. I至6. 3或6. 2至6. 5。在再其它的實(shí)施方式中，pH 是 5. 7 至 6. 0,5. 8 至 6. 1,5. 9 至 6. 2,6. O 至 6. 3,6. I 至 6. 4 或 6. 2 至 6. 5。在某些實(shí)施方式中，pH是約5. 7至約6. 25。在實(shí)施方式中，生長溫度保持在約25°C至約33°C。在某些實(shí)施方式中，生長溫度為約25°C、約26°C、約27°C、約28 V、約29 V、約30°C、約31 °C、約32°C或約33°C。在其它實(shí)施方式中，生長溫度保持在約25°C至約27°C、約25°C至約28°C、約25°C至約29°C、約25 °C至約30°C、約25°C至約31°C、約25°C至約32°C、約25°C至約33°C、約26°C至約28°C、約26 V至約29 V、約26 V至約30 V、約26 °C至約31 °C、約26 °C至約32 °C、約27 °C至約29 V、約27°C至約30°C、約27°C至約31 °C、約27°C至約32°C、約26°C至約33°C、約28°C至約30 V、約28°C至約 31°C、約 28°C至約 32°C、約 29°C至約 31°C、約 29°C至約 32°C、約 29°C至約 33°C、約30°C至約32°C、約30°C至約33°C、約31°C至約33°C、約31°C至約32°C、約30°C至約33°C或約32°C至約33 °C。誘導(dǎo)如本文中其它地方所描述的，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可用于表達(dá)構(gòu)建體中以控制重組干擾素基因的表達(dá)。在Iac啟動(dòng)子衍生物或家族成員(例如tac啟動(dòng)子)的情況中，效應(yīng)子化合物是誘導(dǎo)劑如IPTG (異丙基-β -D-I-硫代吡喃半乳糖苷，也稱為“異丙基硫代半乳糖苷”)。在實(shí)施方式中，使用Iac啟動(dòng)子衍生物，且當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到通過OD575確認(rèn)的約80至約160的水平時(shí)，干擾素表達(dá)通過添加IPTG至約O. 08mM至約O. 4mM的終濃度進(jìn)行誘導(dǎo)。 在實(shí)施方式中，培養(yǎng)物誘導(dǎo)時(shí)的OD575為約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170或約180。在其它實(shí)施方式中，OD575為約80至約100、約100至約120、約120至約140、約140至約160。在其它實(shí)施方式中，OD575為約80至約120、約100至約140或約120至約160。在其它實(shí)施方式中，OD575為約80至約140或約100至160。細(xì)胞密度可以通過其它方法測定并在其它單位表達(dá)，例如表示為細(xì)胞/單位體積。例如，突光假單胞菌培養(yǎng)物的約80至約160的OD575等同于大約SxIOki至約I. 6χ10η集落形成單位每mL或35-70g/L干細(xì)胞重量。在實(shí)施方式中，培養(yǎng)物誘導(dǎo)時(shí)的細(xì)胞密度等同于通過OD575的吸光度在本文中指定的細(xì)胞密度，而無論用于測定細(xì)胞密度的方法或測量單位。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何對(duì)于任何細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)換。在實(shí)施方式中，培養(yǎng)物的最終IPTG濃度為約O. 08mM、約O. ImM、約O. 2mM、約O. 3mM或約O. 4mM在其它實(shí)施方式中，培養(yǎng)物的最終IPTG濃度為約O. 08mM至約O. ImM、約O. ImM至約O. 2mM、約O. 2mM至約O. 3mM、約O. 3mM至約O. 4mM、約O. 2mM至約O. 4mM或約O. 08至約
O.2mM。在實(shí)施方式中，通過本領(lǐng)域中已知的和文獻(xiàn)例如美國專利No. 7，759，109，“Highdensity growth of T7 expression strains with auto-induction option，，(其通過弓I用引入本文)中描述的方法，干擾素通過使用IPTG、乳糖或異乳糖誘導(dǎo)Iac啟動(dòng)子或衍生物而表達(dá)。在其中使用非-Iac型啟動(dòng)子的實(shí)施方式中，如在本文中或在文獻(xiàn)中描述的，可以使用其它誘導(dǎo)劑或效應(yīng)物。在誘導(dǎo)開始后，培養(yǎng)物生長一段時(shí)間，通常約24小時(shí)，在這段時(shí)間內(nèi)重組干擾素蛋白進(jìn)行表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)物可以通過離心濃縮，且培養(yǎng)物沉淀重懸浮在適合于后續(xù)裂解過程的緩沖液或溶液中。在實(shí)施方式中，細(xì)胞使用用于高壓機(jī)械細(xì)胞破壞的設(shè)備(其可商購得到，例如 Microfluidics Microfluidizer> Constant Cell Disruptor、Niro-Soavi 勻衆(zhòng)器或APV-Gaulin勻漿器)進(jìn)行破壞。本領(lǐng)域已知用于裂解細(xì)胞的任何適合的方法可用于釋放不溶性部分。例如，在實(shí)施方式中，可以使用化學(xué)和/或酶細(xì)胞裂解試劑如細(xì)胞壁水解酶和EDTA。在本發(fā)明的方法中也預(yù)想使用冷凍或預(yù)先儲(chǔ)存的培養(yǎng)物。培養(yǎng)物可以在裂解前進(jìn)行OD-標(biāo)準(zhǔn)化。離心使用任何合適的設(shè)備和方法進(jìn)行。為了將可溶性部分與不溶性部分分離的目的，細(xì)胞培養(yǎng)物或裂解產(chǎn)物的離心在本領(lǐng)域中公知的。例如，裂解的細(xì)胞可以在20，800Xg下離心20分鐘(在4°C下)，且上清液使用手動(dòng)或自動(dòng)的液體操作除去。沉淀(不溶性)部分重懸浮在緩沖溶液中,例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，pH 7.4。重懸浮可以使用例如，如與懸臂式混合器、磁力攪拌棒、搖擺振動(dòng)器等連接的葉輪的設(shè)備進(jìn)行?！翱扇苄圆糠帧?，即裂解產(chǎn)物離心后獲得的可溶性上清液，和“不溶性部分”，即裂解產(chǎn)物離心后獲得的沉淀，通過裂解和離心培養(yǎng)物而得到。這兩部分也可以分別稱作第一“可溶性部分”和“第一不溶性部分”。 使用本發(fā)明的提取方法從通過在其中pH和誘導(dǎo)OD未嚴(yán)格控制的條件下(參見例如，實(shí)施例2)生長培養(yǎng)物而制備的表達(dá)培養(yǎng)物獲得可溶性IFN-β是可能的。如本文中描述的生長條件的優(yōu)化導(dǎo)致可溶性IFN-β產(chǎn)生的實(shí)質(zhì)增加。非變性提取方法已發(fā)現(xiàn)，高水平的可溶性干擾素蛋白可以使用本發(fā)明的非變性提取方法從不溶性部分獲得。確定為特別可用于產(chǎn)生高水平可溶性重組干擾素蛋白的非變性提取條件包括非變性濃度的溫和去垢劑，例如Zwittergent 3-14(0.5 to 2% w/v);離液劑，例如尿素(0-2M);和親液鹽，例如NaCl (0-2M)，6· 5至8. 5的緩沖pH和5-20% w/v的固形物濃度。在獲得可溶性部分和不溶性部分后，如上所述，可溶性重組干擾素蛋白通過在本文中描述的非變性提取條件下孵育重懸浮的不溶性部分而從不溶性部分提取。在孵育后，提取的混合物進(jìn)行離心以產(chǎn)生“提取上清液”(在提取后獲得的含溶解的重組蛋白的可溶性上清液部分)和“提取沉淀”(提取后獲得的不溶性沉淀部分)。這些部分也可以稱作“第二可溶性部分”和“第二不溶性部分”。提取條件用于提取條件的許多不同參數(shù)針對(duì)其對(duì)于提取上清液中觀察到的可溶性蛋白的量的影響進(jìn)行了評(píng)估，如本文中的實(shí)施例3中所述。據(jù)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取條件包括不同濃度下的多種不同去垢劑中的任一種時(shí)以及當(dāng)其它參數(shù)發(fā)生變化時(shí)，觀察到可溶性干擾素蛋白。但是，特定參數(shù)對(duì)于產(chǎn)生的可溶性蛋白的量具有特別顯著的效果。具體地說，包括兩性離子去垢劑(Zwittergent)的提取條件給出了最佳的可溶性蛋白產(chǎn)率。特別地，使用兩性離子去垢劑，Zwittergent 3-08、Zwittergent 3-10、Zwittergent 3-12和特別是Zwittergent 3-14,得到了最高的產(chǎn)率。N-月桂?；“彼?NLS)給出了引人注目的高產(chǎn)率,但是基于親和性分析(Sepharose blue親和柱結(jié)合)發(fā)現(xiàn)所獲得的可溶性蛋白為非活性的。因此，如本文中使用的術(shù)語“溫和去垢劑”不意圖包括N-月桂?；“彼帷Ｈス竸┰诜亲冃詽舛认聹y試。據(jù)發(fā)現(xiàn)至少O. 5% (w/v)和優(yōu)選1%的Zwittergent3-14(3-(N，N-二甲基肉豆蘧基銨基)丙磺酸鹽)濃度(遠(yuǎn)高于其O. 01%的臨界膠束濃度)提供了最有效的可溶性干擾素蛋白的提取。因此，預(yù)期使用非變性濃度的溫和去垢劑，特別是兩性離子去垢劑，更特別是Zwittergent 3-08、Zwittergent 3-10、Zwittergent 3-12 和 Zwittergent 3-14,更特別是Zwittergent 3-14,且不是NLS,用于本發(fā)明的提取條件中。在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，非變性提取條件包括約O. 5%至約2% (w/v)濃度的Zwittergent 3-14。在實(shí)施方式中,Zwittergent 3-14的w/v濃度為約O. 5%至約I %、約1%至約I. 5%、約I. 5%至約2%或約1%至約2%。在某些實(shí)施方式中，Zwittergent3-14 的 w/v 濃度為約 O. 5%、約 O. 6%、約 O. 7%、約 O. 8%、約 O. 9%、約 I. 0%、約 I. I %、約I. 2%、約 I. 3%、約 I. 4%、約 I. 5%、約 I. 6%、約 I. 7%、約 I. 8%、約 I. 9%或約 2. 0%。在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，非變性提取條件包括約O. 5%至約2% (w/v)濃度的Zwittergent 3-08>Zwittergent 3-10 或 Zwittergent 3-12。在實(shí)施方式中，Zwittergent3-08、Zwittergent 3-10 或 Zwittergent 3-12 的 w/v 濃度為約 O. 5%至約 I %、約 1% 至約I. 5%、約I. 5%至約2%或約I %至約2 %。在某些實(shí)施方式中，Zwittergent 3-08>Zwittergent 3-10 或 Zwittergent 3-12 的 w/v 濃度為約 O. 5 %、約 O. 6 %、約 O. 7 %、約
0.8%、約 O. 9%、約 I. 0%、約 I. I %、約 I. 2%、約 I. 3%、約 I. 4%、約 I. 5%、約 I. 6%、約
1.7%、約 I. 8%、約 I. 9%或約 2. 0%?！睾腿ス竸┰诘退嚼?%或更低的水平下不引起蛋白質(zhì)重折疊。例如，SDS和NLS通常被認(rèn)為是較強(qiáng)的去垢劑，因?yàn)樗鼈兛梢栽谶@些水平下使蛋白質(zhì)變性。非變性濃度表示在該濃度下蛋白質(zhì)不變性。在處理過程中不變性的蛋白質(zhì)不需要重折疊。在實(shí)施方式中，本發(fā)明的非變性提取條件包括約O. 5至約2%的Zwittergent3-14、約O至約2M的尿素、約O至約2M的NaCl，且其中pH為約6. 5至約8. 5。下表列舉了常見去垢劑的實(shí)例，包括離子、非離子和兩性離子去垢劑，及它們的性質(zhì)。去垢劑的重要特性是其臨界膠束濃度(CMC)，這一特性與其蛋白質(zhì)增溶能力以及后續(xù)從蛋白質(zhì)溶液除去去垢劑的簡易性相關(guān)。表I.去垢劑的實(shí)例去垢劑單體，MW 膠束,MW CMCCMC
__Da__Da__% (w/v)__mM
Zwittergent 3-36430,000 0.004-0.0150.1-0.4 (0.3)
14____(0.011)__
Tween-2012280.0070.059
Tween-80131076,0000.00160.012
Triton X-10065090,000 0.013-0.060.2-0.9 (0.3)
____(0.021)__
脫氧膽酸納4324^00^ 0.215
月桂?；“?2936000413J
酸納_____
NDSB195N/AN/AN/A
NP-4061790000 0.003-0.018, 0.05-0.3~
CHAPS6156,000 ~ 0.37-0.626-10
辛基-β-吡喃葡 2928,00007323
萄糖苷 ___表2.兩性離子去垢劑的物理性質(zhì)

去垢劑單體，MW膠束，MW CMCCMC
__Da__Da__% (w/v)__mM
Zwittergent 3-08 280_9.2330
Zwittergent 3-10 30812,500 0.77-1.2325-40
Zwittergent 3-12 33618,500 0.067-0.134 2-4
Zwittergent 3-14 364 30,000 0.004-0.015 0.1-0.4 (0.3)
____(0.011)__
Zwittergent 3-16 392 60,000 0.0004- 0.01-0.06__丨0.0024 _進(jìn)一步觀察到，當(dāng)非變性提取條件包括離液劑尿素、親液鹽NaCl、Zwittergent3-14和適當(dāng)?shù)木彌_范圍的組合時(shí),提取產(chǎn)率與使用單獨(dú)的Zwittergent 3_14相比提高幾倍(參見實(shí)施例3)。表3.選擇的提取成分的濃度范圍
成分允許的濃度范圍選擇的濃度—Zwittergent 3-140.5-2% (w/v)1%
尿素0-2 M2 M
NaCl0-2 M2 M
固形物濃度5-20% (w/v)5%
緩沖 pH_6.5-8.5_8^2_
離液劑破壞蛋白質(zhì)或核酸的三維結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致變性。在實(shí)施方式中，非變性提取條件包括低的、非變性濃度的離液劑，例如尿素或鹽酸胍。在實(shí)施方式中，非變性提取條件包括約O. 5M至約2M或更高濃度的尿素。我們觀察到，6M的尿素使IFN- β變性。通常，非變性濃度的尿素或鹽酸胍低于3Μ。在實(shí)施方式中，非變性提取條件包括約O. 5至約1Μ、約I至約 I. 5Μ、約 I. 5 至約 2Μ、約 I 至約 2Μ、約 O. 5Μ、約 O. 6Μ、約 O. 7Μ、約 O. 8Μ、約 O. 9Μ、約 I. 0Μ、約 I. 1Μ、約 I. 2Μ、約 I. 3Μ、約 I. 4Μ、約 I. 5Μ、約 I. 6Μ、約 I. 7Μ、約 I. 8Μ、約 I. 9Μ 或約 2. OM濃度的尿素。在其它實(shí)施方式中，非變性提取條件包括約O. 5Μ至約2Μ濃度的鹽酸胍。在實(shí)施方式中，提取條件包括O. 5至1Μ、1至I. 5Μ、1. 5至2Μ、1至2Μ、0. 5Μ、約O. 6Μ、約O. 7Μ、約 O. 8Μ、約 O. 9Μ、約 I. 0Μ、約 I. 1Μ、約 I. 2Μ、約 I. 3Μ、約 I. 4Μ、約 I. 5Μ、約 I. 6Μ、約 I. 7Μ、約I. 8Μ、約I. 9Μ或約2. OM濃度的鹽酸胍。親液鹽有助于水-水相互作用的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)。親液劑引起水分子有利地相互作用，這也使大分子如蛋白質(zhì)中的分子間相互作用穩(wěn)定。任何這種合適的試劑，如本領(lǐng)域中已 知的，可以用于本發(fā)明的提取條件中。在實(shí)施方式中，非變性提取條件包括選自NaCl、KCl和(NH4)2SO4的親液鹽。在某些實(shí)施方式中，NaCl以約O. 15M至約2M的濃度存在。在實(shí)施方式中，NaCl以約O. 15至約O. 5M、約O. 5至約O. 75M、約O. 75M至約1M、約IM至約I. 25M、約I. 25M至約I. 5M、約I. 5M至約I. 75M、約I. 75M至約2M、約O. 15M至約1M、約IM至約I. 5M、約 I. 5M 至約 2M、約 IM 至約 2M、約 O. 15M、約 O. 25M、約 O. 5M、約 O. 6M、約 O. 7M、約 O. 8M、約 O. 9M、約 I. 0M、約 I. 1M、約 I. 2M、約 I. 3M、約 I. 4M、約 I. 5M、約 I. 6M、約 I. 7M、約 I. 8M、約
I.85M、約I. 9M或約2. OM的濃度存在于提取條件中。在其它實(shí)施方式中，KCl以約O. 15至約O. 5M、約O. 5至約O. 75M、約O. 75M至約1M、約IM至約I. 25M、約I. 25M至約I. 5M、約I. 5M至約I. 75M、約I. 75M至約2M、約O. 15M至約1M、約 IM 至約 I. 5M、約 I. 5M 至約 2M、約 IM 至約 2M、約 O. 15M、約 O. 25M、約 O. 5M、約 O. 6M、約 O. 7M、約 O. 8M、約 O. 9M、約 I. 0M、約 I. 1M、約 I. 2M、約 I. 3M、約 I. 4M、約 I. 5M、約 I. 6M、約
I.7M、約I. 8M、約I. 85M、約I. 9M或約2. OM的濃度存在于非變性提取條件中。在其它實(shí)施方式中，(NH4)2SO4以約O. 15至約O. 5M、約O. 5至約O. 75M、約O. 75M至約1M、約IM至約I. 25M、約I. 25M至約I. 5M、約I. 5M至約I. 75M、約I. 75M至約2M、約
0.15M 至約 1M、約 IM 至約 I. 5M、約 I. 5M 至約 2M、約 IM 至約 2M、約 O. 15M、約 O. 25M、約 O. 5M、約 O. 6M、約 O. 7M、約 O. 8M、約 O. 9M、約 I. 0M、約 I. 1M、約 I. 2M、約 I. 3M、約 I. 4M、約 I. 5M、約
1.6M、約I. 7M、約I. 8M、約I. 85M、約I. 9M或約2. OM的濃度存在于非變性提取條件中。據(jù)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH維持在6. 5-8. 5的范圍內(nèi)時(shí)提取條件是最有效的?？捎玫膒H緩沖劑是在標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化教科書中推薦的那些(例如，這里可以使用Protein Purification Principles and Practice, by Robert Scopes (Springer, 1993)),包括 Tris、Bis_Tris、憐酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、甘氨酸、二乙醇胺、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、三乙醇胺、咪唑、組氨酸、吡啶等。許多緩沖劑已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述，且可商購得到。在實(shí)施方式中，非變性提取條件的pH為約6. 5、約6. 6、約6. 7、約6. 8、約6. 9、約7. O、約7. I、約7. 2、約7. 3、約7. 4、約7. 5、約7. 6、約7. 8、約7. 9、約8. O、約8. I、約8. 2、約8. 3、約8. 4或約8. 5。在其它實(shí)施方式中，pH為約6. 5至約6. 8、約6. 6至約6. 9、約6. 7至約7. O、約6. 8至約7. I、約6. 9至約7. 2、約7. O至約7. 3、約7. I至約7. 4、約7. 2至約7. 5、約7. 3至約7. 6、約7. 4至約7. 7、約7. 5至約7. 8、約7. 6至約7. 9、約7. 8至約8. I、約7. 9至約8. 2、約8. O至約8. 3、約8. I至約8. 4或約8. 2至約8. 5。在其它實(shí)施方式中，pH為約6. 5至約7. O、約7. O至約7. 5或約7. 5至約8. O。非變性提取條件中的固形物濃度也發(fā)生變化。這一參數(shù)代表了提取物孵育混合物中固體物質(zhì)的量。固形物濃度可以通過稱量濕沉淀(即，不溶性部分)并將該重量與提取混合物的總重量進(jìn)行比較來測定。特定固形物濃度通過濃縮和稀釋不溶性部分來實(shí)現(xiàn)。高提取產(chǎn)率在5%至40% (w/v)的整個(gè)固形物濃度范圍上觀察到。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，非變性提取條件中的固形物以約5%、 約7. 5%、約10%、約12. 5%、約15%、約17. 5%、約20%、約 22. 5%、約 25%、約 27. 5%、約 30%、約 32. 5%、約 35%、約 37. 5%或約 40%的 w/V濃度存在。在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，非變性提取條件中的固形物以約5 %至約7.5%、約 7. 5%至約 10%、約 10%至約 12. 5%、約 12. 5%至約 15%、約 15%至約 17. 5%、約 17. 5%至約20%、約20%至約22. 5%、約22. 5%至約25%、約25%至約27. 5%、約27. 5%至約30%、約 30%至約 32. 5%、約 32. 5%至約 35%、約 35%至約 37. 5%、約 37. 5%至約 40%、約5%至約10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約25%、約25%至約30%、約35%至約40%、約5%至約15%、約5%至約25%、約5%至約30%、約5%至約35%、約10%至約20%、約20%至約30%、約30%至約40%、約5%至約20%或約20%至約40%的w/v濃度存在。在實(shí)施方式中，本發(fā)明的提取方法與同時(shí)富集技術(shù)(如吸附)組合以進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)產(chǎn)率。溶解的蛋白質(zhì)可以與通過例如離心和/或色譜(如尺寸排阻、陰離子或陽離子交換、疏水相互作用或親和色譜)其它蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片分離或純化。干擾素人干擾素已經(jīng)分成三種主要類型。I型干擾素1型IFN結(jié)合稱為IFN-α受體(IFNAR)的特定細(xì)胞表面受體復(fù)合體，其由IFNARl和IFNAR2鏈組成。人I型干擾素包括 IFN-α、IFN-β、IFN-κ 及 IFN-ω 和 IFN-ε。II 型干擾素11 型 IFN(人 IFN-Y )結(jié)合IFNGR。III型干擾素111型IFN通過由IL10R2(也稱作CRF2-4)和IFNLRl (也稱作CRF2-12)組成的受體復(fù)合體發(fā)出信號(hào)。人I型干擾素表現(xiàn)為結(jié)合兩受體亞基，IFNAR-I和_2，其廣泛分布于各種細(xì)胞類型的細(xì)胞表面上。配體參與導(dǎo)致酪氨酸激酶TYK2和JAK-I (其分別與IFNAR-I和-2偶聯(lián))磷酸化的誘導(dǎo)。一旦磷酸化，STAT蛋白質(zhì)脫離受體和形成同型二聚體以及異二聚體。一旦脫離，STAT的二聚體與干擾素響應(yīng)因子9(IRF-9)( 一種DNA結(jié)合蛋白)結(jié)合，從而形成稱作IFN-刺激基因因子-3(ISGF-3)的復(fù)合體，其遷移到細(xì)胞核中。接著，ISGF-3復(fù)合體結(jié)合存在于所有IFN誘導(dǎo)基因上游的DNA元件。I型干擾素廣泛描述于文獻(xiàn)中，例如在美國專利No.7，625，555,“Recombinant human interferon-like proteins, incorporated hereinby reference，，中。I型IFN具有實(shí)質(zhì)的結(jié)構(gòu)相似性，如通過其序列和其共有的受體結(jié)合能力證明的。按照 Kontsek, P. , 1994, “Human type I interferons :structure and function,，，ActaVirol. 38(6) :345-60 (通過引用并入本文)，人I型干擾素(此時(shí)已報(bào)道了 13種)具有20%的總體序列同源性，其確定了相同的多肽二級(jí)和三級(jí)折疊。此外，Kontsek報(bào)道，三維模型表明I型IFN的球狀結(jié)構(gòu)由5個(gè)α -螺旋束(其可以形成兩個(gè)多肽結(jié)構(gòu)域)組成。二硫鍵Cys 29-Cys 139穩(wěn)定這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在生物活性構(gòu)型中。與氨基酸(aa) 30-41和120-145相關(guān)的兩個(gè)保守親水區(qū)域被認(rèn)為構(gòu)成I型IFN中受體識(shí)別位點(diǎn)的基本框架，且在人I型IFN間的不同生物效應(yīng)譜所推測是由于在片段aa 30-41和120-145及可變的親水a(chǎn)a區(qū)域23_26、68-85 和 112-121 中的細(xì)微序列異質(zhì)性。Oritani 等，2001, “Type I interferons andlimitin a comparison of structures, receptors, and functions,，，Cytokine GrowthFactor Rev 12(4) :337-48 (通過引用并入本文)的后一報(bào)道描述了家族成員IFN-a、IFN-β、IFN-3 和IFN-τ。該論文也報(bào)道，IFN-α和IFN-β具有由5個(gè)α-螺旋組成的球狀結(jié)構(gòu)，并討論了比較序列分析、原型三維結(jié)構(gòu)、單克隆抗體的分析及雜合分子的構(gòu)建和定點(diǎn)誘變。預(yù)期使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生任何I型干擾素蛋白?？梢允褂帽景l(fā)明的方法產(chǎn)生的I型干擾素蛋白包括，但不限于人IFN-a2a和2b、人IFN-β lb、人IFN-κ (例如，NM_020124, AAK63835，且由通過引用并入本文的 LaFleur 等，2001，“ Interferon-kappa，anovel type I interferon expressed in human keratinocytes,，，J. Biol. Chem. 276 (43),39765-39771描述)和人IFN- ω (例如，NM_002177，NP_002168，且在通過引用并入本文的美國專利No. 7，470，675,“Methods for treating cancer using interferon-ω-expressingpolynucleotides”中描述)。也預(yù)想使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生IFN- τ。氨基酸和核酸序列可從例如GenBank公開獲得。已經(jīng)描述了IFN-α 蛋白的 14 種亞型IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10, IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNAl7, IFNA21。IFN-α 作為治療劑合成地制備，如聚乙二醇化的干擾素a -2a和聚乙二醇化的干擾素a -2b。IFN-β (IFNB1 或 IFN-β lb)是主要的 β 亞型(參見例如，GenBankNP002167. 1，其提供了成熟的肽序列)。重組干擾素β-Ib (Betaseron)是人IFN-β的類似物(其中絲氨酸經(jīng)遺傳工程化以替代17位的半胱氨酸)，稱作IFN-β Ib C17S(描述于通過引用并入本文中的美國專利 No. 4，588，585,“Human recombinant cysteine depleted interferon- βmuteins”中)。該分子是具有單一二硫鍵的165個(gè)氨基酸的小多肽，且作為非糖基化的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。在通過引用并入本文中的美國專利No. 7，214, 367, “Orally-administeredinterferon-tau compositions and methods” 中描述了 IFN-τ 并公開了 IFN-τ 的序列。多種I型IFN已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于治療人類的疾病。下表列舉了 I型干擾素藥物的實(shí)例。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，任何這些藥物使用如所要求保護(hù)的和本文中描述的方法產(chǎn)生。表4. I型干擾素藥物的實(shí)例
權(quán)利要求
1.用于產(chǎn)生重組I型干擾素蛋白的方法，所述方法包括 通過培養(yǎng)包含表達(dá)構(gòu)建體的假單胞菌或大腸桿菌宿主細(xì)胞表達(dá)重組干擾素蛋白，該表達(dá)構(gòu)建體包含已經(jīng)針對(duì)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的編碼序列； 裂解所述宿主細(xì)胞； 從所述裂解步驟獲得不溶性部分和可溶性部分； 通過使所述不溶性部分經(jīng)歷非變性提取條件而對(duì)其進(jìn)行提取；和 從所述不溶性部分獲得提取沉淀和提取上清液； 其中在所述提取上清液中的重組蛋白以可溶性形式、活性形式或其組合的形式存在而無需進(jìn)一步進(jìn)行復(fù)性或重折疊步驟。
2.用于提取重組I型干擾素蛋白的方法，其中所述重組干擾素蛋白存在于不溶性部分中，所述不溶性部分在表達(dá)所述重組干擾素蛋白的假單胞菌或大腸桿菌宿主細(xì)胞裂解后產(chǎn)生，所述方法包括 使所述不溶性部分經(jīng)歷非變性提取條件；和 從所述不溶性部分獲得提取沉淀，所述提取沉淀包含重組干擾素蛋白； 其中所述提取沉淀中的重組干擾素蛋白為可溶性形式、活性形式或其組合的形式，而無需經(jīng)歷復(fù)性或重折疊步驟。
3.用于產(chǎn)生包含重組I型干擾素蛋白的不溶性部分的方法，其中所述重組干擾素蛋白在假單胞菌或大腸桿菌宿主細(xì)胞中由包含與Iac衍生啟動(dòng)子可操作地連接的核酸序列的核酸構(gòu)建體表達(dá)，所述方法包括 在約25°C至約33°C的溫度和約5. 7至約6. 5的pH下生長宿主細(xì)胞至約80至約160的OD600 ;和 在約O. 08mM至約O. 4mM的IPTG濃度下誘導(dǎo)所述宿主細(xì)胞； 裂解所述宿主細(xì)胞并對(duì)其離心以產(chǎn)生沉淀部分； 其中可溶性的、活性的或可溶性和活性的重組干擾素蛋白可以通過在非變性提取條件下提取所述沉淀部分獲得而無需后續(xù)的復(fù)性或重折疊步驟。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非變性提取條件包括存在溫和去垢劑。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述溫和去垢劑是兩性離子去垢劑。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述兩性離子去垢劑是Zwittergent3-08、Zwittergent 3-10、Zwittergent 3-12 或 Zwittergent 3-14。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非變性提取條件包括約O.5%至約2%的 Zwittergent 3-14。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非變性提取條件進(jìn)一步包括離液劑和親液鹽。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述離液劑是尿素或鹽酸胍，和所述親液鹽是 NaCl、KCl 或(NH4)2SO40
10.權(quán)利要求1、2和4-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非變性提取條件包括約O.5至約2%的Zwittergent 3-14 ;約O至約2M的尿素；約O至約2M的NaCl ;且其中所述pH為約6. 5至約8. 5。
11.權(quán)利要求1、2和4-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非變性提取條件包括約1%的Zwittergent 3-14 ;約2M的尿素；約2M的NaCl ;且其中所述pH為約8. 2。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非變性提取條件還包括約5%w/v的固形物。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非變性提取條件還包括約1%至約40 % w/v的固形物。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述重組I型干擾素蛋白是干擾素、干擾素-α、干擾素-K或干擾素-ω。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述重組I型干擾素蛋白是干擾素或干擾素-α。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述重組I型干擾素蛋白是干擾素，且其中所述干擾素-β選自人干擾素-Plb和人干擾素-β Ib C17S。
17.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述重組I型干擾素蛋白是干擾素-α，且其中所述干擾素-α選自人干擾素-a 2a和人干擾素-a 2b。
18.權(quán)利要求I和4-17中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括測量所述不溶性部分和所述提取上清液部分中重組I型干擾素蛋白的量，其中所述提取上清液部分中檢測的重組干擾素蛋白的量為所述不溶性部分中檢測的重組干擾素蛋白的量的約10%至約95%。
19.權(quán)利要求I和4-18中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括測量所述重組蛋白的活性，其中當(dāng)與所分析的重組蛋白的總量相比時(shí)，所述提取上清液中存在的重組蛋白的約40%至約100%確定為活性的。
20.權(quán)利要求1-16、18和19中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述重組蛋白是干擾素-β，且其中所述活性重組蛋白的量通過Blue Sepharose親和柱層析、受體結(jié)合分析、抗病毒活性分析或細(xì)胞病變效應(yīng)分析測定。
21.權(quán)利要求1-16和18-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述重組蛋白是干擾素-β，且進(jìn)一步其中所述非變性提取條件使用圖4Β中的信息優(yōu)化。
22.權(quán)利要求I和3-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述提取上清液中的重組蛋白以約O.3克每升至約10克每升的濃度存在。
23.權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞在約I至約20或更多升的體積中培養(yǎng)。
24.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞在約I升、約2升、約3升、約4升、約5升、約10升、約15升或約20升的體積中培養(yǎng)。
25.權(quán)利要求I和3-22中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述表達(dá)構(gòu)建體或核酸構(gòu)建體包含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
26.權(quán)利要求I和3-23中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述表達(dá)構(gòu)建體或核酸構(gòu)建體包含Iac啟動(dòng)子衍生物且干擾素的表達(dá)通過IPTG誘導(dǎo)。
27.權(quán)利要求1-9和12-26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞生長于 約25 °C至約33 °C的溫度下， 約5. 7至約6. 5的pH下， 且其中當(dāng)OD575達(dá)到約80至約160時(shí)添加IPTG至約O. 08mM至約O. 4mM的終濃度。
28.權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞生長于 約32 °C的溫度下， 約5. 7至6. 25的pH下， 且其中當(dāng)OD575達(dá)到約120至約160時(shí)添加IPTG至約O. 2mM的終濃度。
29.權(quán)利要求I和3-28 中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述表達(dá)構(gòu)建體或核酸構(gòu)建體包含高活性核糖體結(jié)合位點(diǎn)。
30.權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是IonhslUV蛋白酶缺失的菌株。
31.權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述I型干擾素在所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞 質(zhì)中表達(dá)。
32.權(quán)利要求14-16和18-31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述I型干擾素是人干擾素-Plb或人干擾素-β Ib C17S，且所述人干擾素-i3 1b或人干擾素-i3 1b C17S在所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。
33.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述溫度是約32°C，且所述IPTG濃度是約O.2mM。
34.權(quán)利要求4-32中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述溫和去垢劑不是N-月桂?；?肌氨酸(NLS)。
35.權(quán)利要求I和4-34中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括測量所述重組蛋白的活性，其中當(dāng)與標(biāo)準(zhǔn)樣品中的活性蛋白相比時(shí)，提取上清液中存在的重組蛋白的約75%至約100%確定為活性的，其中各樣品的相同量的蛋白質(zhì)用于該分析中。
全文摘要
本發(fā)明涉及在細(xì)菌宿主中生產(chǎn)重組蛋白的領(lǐng)域。其進(jìn)一步涉及不使用變性和不需要重折疊步驟而從不溶性部分提取可溶性的活性重組蛋白。特別是，本發(fā)明涉及用于從細(xì)菌宿主獲得高水平的可溶性重組1型干擾素蛋白的制備方法。
文檔編號(hào)C12N15/20GK102906108SQ201180021026
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月4日
發(fā)明者J·艾倫, 馮平華, A·帕特卡, K·L·黑尼, L·丘, L·L·P·森錢薩朗希 申請(qǐng)人:菲尼克斯公司