專利名稱：改進的細胞培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術的一般領域，尤其涉及細胞的培養(yǎng)及其在以エ業(yè)規(guī)模生產(chǎn)多肽中的用途。本發(fā)明提供細胞培養(yǎng)基，其適合用于培養(yǎng)具有高細胞存活率(viability)的細胞，優(yōu)選如CHO細胞的哺乳動物細胞，其特征在于它們的鈉離子與鉀離子的摩爾比。在用于尤其是通過在哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中重組表達多肽來產(chǎn)生多肽時，尤其是以エ業(yè)規(guī)模來產(chǎn)生多肽時，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基允許獲得高多肽生產(chǎn)力。
背景技術：
在過去二十年中，用重組技術制備多肽已發(fā)展為標準方法。通過克隆編碼各多肽的基因、然后用該待表達的基因轉(zhuǎn)化適宜的表達宿主、最后產(chǎn)生和純化所獲得的重組多肽
在重組DNA技術后使用生物工程領域中發(fā)展的產(chǎn)生方法，制藥產(chǎn)業(yè)中已制備了數(shù)目越來越多的藥物活性化合物。這類生物產(chǎn)物包括單克隆抗體，其已發(fā)展為包括自身免疫病、炎性障礙、免疫抑制、腫瘤學等的多種醫(yī)學領域中重要的治療選擇。這類生物來源藥物的發(fā)展需要以エ業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，從而提供大量重組多肽。優(yōu)選的表達系統(tǒng)是哺乳動物細胞培養(yǎng)物，其優(yōu)于大多數(shù)其他基于昆蟲細胞、酵母等的真核系統(tǒng)，或甚至傳統(tǒng)的原核表達系統(tǒng)。但是，尤其是在エ業(yè)規(guī)模，哺乳動物細胞培養(yǎng)包括巨大的挑戰(zhàn)。用于哺乳動物細胞培養(yǎng)的生產(chǎn)設施需要徹底優(yōu)化許多方法條件。用于控制總體產(chǎn)生方法的最重要的方法參數(shù)之一是在其中培養(yǎng)細胞并進行多肽產(chǎn)生的培養(yǎng)基。適宜的細胞培養(yǎng)基必須為細胞培養(yǎng)物提供所有必需營養(yǎng)物，這在不向培養(yǎng)基中加入動物來源的成分(如血清或蛋白質(zhì)，例如生長因子)時尤其困難。因此，研發(fā)了多種不同的細胞培養(yǎng)基。在一些情況下，焦點在一般組成上，且提出了具有多種不同物質(zhì)的培養(yǎng)基(US5 122 469,EPO 481 791,EPO 283 942)。在其他情況下，提出了用特定成分改善細胞培養(yǎng)。主要目標是改善細胞的生長或存活，或改善重組表達的多肽的數(shù)量和質(zhì)量。現(xiàn)有技術文件中提到的具體方面是特定痕量離子(例如WO 02/066603, EPO 872487，EPl 360 314 A2)、諸如抗壞血酸的維生素(例如US6 838 284)、糖類(EPl 543 106)或特定氨基酸的含量與其他特征組合(例如EPO 501 435，US5 830 761，US7 294 484)的貢獻等。細胞培養(yǎng)基中的主要離子及其濃度基本保持恒定，且未被考慮和改變。所有經(jīng)典的培養(yǎng)基類型(例如DMEM、DMEM/F12、BME或RPMI 1640)都使用濃度范圍相對窄且固定的大量離子(一般而言)及單價陽離子Na+和K+(具體而言)。這與以下事實一致，大量離子(一般而言)及單價陽離子Na+和K+(具體而言)的離子平衡是幾乎所有哺乳動物細胞的普遍特性。更具體而言，鈉離子和鉀離子的跨膜梯度是哺乳動物細胞的基本特性，細胞內(nèi)具有高濃度的鉀離子，而細胞外具有高濃度的鈉離子。鈉鉀泵是細胞膜的主要離子泵之一，其是生電泵，且有助于建立和維持鈉和鉀的跨膜離子梯度(Kaplan, Membrane cationtransport and control of proliferation of mammalian ceils. Annu Rev Physiol. ；40 19-41(1978))。該泵使用約30%的細胞能量，是細胞的主要耗能過程之一。許多基本的生物化學過程與鈉離子的電化學梯度偶聯(lián)，例如Na+/Ca+交換或氨基酸轉(zhuǎn)運入細胞。因此，細胞外的鈉離子和鉀離子濃度是具有重要意義的參數(shù)，其影響這些離子的跨膜梯度和細胞的基本狀態(tài)。根據(jù)哺乳動物細胞內(nèi)部和外部的典型鈉離子濃度(Alberts等，MolecularBiology of the Cell (1994)),大多數(shù)情況下,選擇約145mM的鈉濃度，同時選擇約5mM的鉀離子濃度。對于大多數(shù)培養(yǎng)基類型，這導致鈉離子和鉀離子之間的比值在約20-30的范圍內(nèi)(見下文表I和例如US5135866)。 只有很少的現(xiàn)有技術文件在描述適合用于哺乳動物細胞培養(yǎng)或重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生的細胞培養(yǎng)基時提到了鈉離子與鉀離子的具體比值。這些文件提出了具有特別高的比值的培養(yǎng)基組合物，US 5232848中在約30. 7的高范圍內(nèi)，或在約25和35之間的范圍內(nèi)，從而達到甚至更高的值(EP0 283 942，EPO 389 786)。其他培養(yǎng)基，如HAM’ s_F12或US2008/0261259中提出的確定成分的動物細胞培養(yǎng)基也明確提出了更高的值(例如在US2008/0261259中為27. 9至57. 5)。只有非常少的文件公開了具有低于20的鈉鉀離子比的培養(yǎng)基，如11. 5-30 (US7 294 484)或約15的比值(US6 180 401)。這些文件仍使用高于10的比值，且未將具體優(yōu)勢分配給將該參數(shù)變?yōu)樗岬降闹怠３伺c特定離子間的離子平衡相關的作用外，還應考慮主要離子對培養(yǎng)基的總體重量摩爾滲透壓濃度的貢獻。大多數(shù)常規(guī)培養(yǎng)基(例如DMEM、MEM a或Fischer’s培養(yǎng)基)的特征在于高量的氯化鈉。WO 02/101019研究培養(yǎng)基中高含量的葡萄糖與利用更高重量摩爾滲透壓濃度的組合。通過減少或甚至徹底去除諸如氯化鈉的物質(zhì)，從而維持重量摩爾滲透壓濃度在給定水平，達到了約2-40g/l之間的高葡萄糖濃度。鑒于以上挑戰(zhàn)和現(xiàn)有不足，エ業(yè)生物技術領域中存在對改進的培養(yǎng)基的持續(xù)需要，該培養(yǎng)基允許以エ業(yè)規(guī)模產(chǎn)生重組多肽。發(fā)明概述本發(fā)明提供具有降低的Na+/K+比(即，低于約10的值的Na+/K+比)的細胞培養(yǎng)基。這是通過減少總鈉離子數(shù)目和増加總鉀離子含量的方式達到的。已發(fā)現(xiàn)，這種低比值產(chǎn)生了幾種有益作用，尤其是改善哺乳動物細胞的存活率、生長和生產(chǎn)力。因此，本發(fā)明提供用于哺乳動物細胞的培養(yǎng)及多肽產(chǎn)生的優(yōu)化細胞培養(yǎng)基，其特征在于鈉離子與鉀離子(測量為摩爾含量)的比值在約10 I和約I : I之間，備選地在約8 I和約6 I之間。此特征的實現(xiàn)可以包括約50mM和約90mM之間的鈉離子濃度及約8mM和約12mM之間的鉀離子濃度。在另一方面，該細胞培養(yǎng)基的優(yōu)化包括選擇約40mM和約IOOmM之間、備選地約50mM和約IOOmM之間的總氨基酸含量。此特征可以與總離子濃度和總氨基酸濃度之間約I.9至約4的特別低的摩爾比組合。在另一方面，本發(fā)明提供用本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)哺乳動物細胞來產(chǎn)生希望的重組多肽的方法。該方法涉及在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動物細胞，并表達重組多肽。該方法的一些實施包括培養(yǎng)條件，其中在培養(yǎng)期間變動溫度和/或培養(yǎng)基的pH至少一次。作為另ー選擇，通過補料分批方法來完成流加。希望的多肽產(chǎn)物包括糖基化的多肽，且尤其是抗體和抗體片段。用于本發(fā)明的方法的哺乳動物細胞優(yōu)選選自CHO細胞、HEK細胞和SP2/0細胞。在另一方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基的方法，其中，將不同的成分相互混合。具體而言，向培養(yǎng)基組合物加入的氯化鈉的濃度可以在約7mM和約15mM之間。向培養(yǎng)基組合物加入的氯化鉀的濃度可以在約8mM和約12mM之間。
附圖
簡述參考以下實施例和附圖將可以更好地理解本發(fā)明。但是，實施例并非旨在限制本發(fā)明的范圍。圖I作為培養(yǎng)時間的函數(shù)顯示搖瓶培養(yǎng)物中產(chǎn)生mAbl的CHO細胞克隆的活細胞密度(見實施例I)，使用本發(fā)明所述具有降低的Na+/K+比的培養(yǎng)基。此外，還描繪了恒定溫度對溫度變動的作用。圖2顯示使用具有降低的Na+/K+比的培養(yǎng)基的產(chǎn)生mAbl的CHO細胞的存活率(見實施例I)，及第3天恒定溫度對溫度變動的作用。圖3作為培養(yǎng)時間的函數(shù)顯示具有溫度變動和無溫度變動的產(chǎn)生mAbl的CHO細胞克隆的搖瓶培養(yǎng)物的產(chǎn)物效價(見實施例I)。細胞培養(yǎng)在本發(fā)明的具有降低的Na+K+比的培養(yǎng)基中。圖4顯示產(chǎn)生mAb2的克隆中乳酸濃度隨培養(yǎng)時間的變化(見實施例2)。細胞培養(yǎng)在本發(fā)明的具有降低的Na+/K+比的培養(yǎng)基中。圖5作為培養(yǎng)時間的函數(shù)顯示具有CHO細胞克隆的300L生物反應器中的活細胞密度。培養(yǎng)條件包括溫度梯度(第5天)及由具有設定點和死區(qū)的pH調(diào)節(jié)引起的兩次pH變動(也見實施例2)。細胞培養(yǎng)在本發(fā)明的具有降低的Na+/K+比的培養(yǎng)基中。圖6作為培養(yǎng)時間的函數(shù)顯示具有CHO細胞克隆的300L生物反應器中的產(chǎn)物效價。該方法將溫度變動與兩次PH變動組合(也見圖5和實施例2)。細胞培養(yǎng)在本發(fā)明的具有降低的Na+/K+比的培養(yǎng)基中。發(fā)明詳述本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基用于培養(yǎng)哺乳動物細胞，優(yōu)選CHO細胞、HEK細胞和SP2/0細胞，且用于以這類細胞產(chǎn)生重組多肽。尤其優(yōu)選CHO細胞。術語細胞培養(yǎng)基指營養(yǎng)物的水溶液，其可以用于培養(yǎng)細胞延長的時間。通常，細胞培養(yǎng)基包含以下成分能量來源，其通常將是糖類化合物，優(yōu)選葡萄糖；氨基酸，優(yōu)選堿性組的氨基酸，包括所有必需氨基酸；維生素和/或以低濃度需要的其他有機化合物；游離脂肪酸；和無機化合物，包括痕量元素，無機鹽；緩沖化合物；及核苷和堿基。本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基可以用于多種細胞培養(yǎng)方法?？梢砸再N壁培養(yǎng)，例如以單層培養(yǎng)，或優(yōu)選以懸浮培養(yǎng)來進行細胞的培養(yǎng)。由于安全性和污染問題，細胞培養(yǎng)基在制藥エ業(yè)領域中，例如在產(chǎn)生治療活性重組多肽中的用途一般不允許使用任何生物來源的材料。因此，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基優(yōu)選是無血清和/或無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基。術語“無血清和/或無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基”表示化學成分完全確知的培養(yǎng)基，其不包含來自動物來源的添加剤，如組織水解物，例如胎牛血清等。此外,還優(yōu)選不向本發(fā)明的細胞培養(yǎng)物中加入蛋白質(zhì)，尤其是生長因子，如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白等。優(yōu)選地，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基也不補充水解蛋白質(zhì)來源，如大豆、小麥或稻蛋白胨或酵母水解物等。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的重量摩爾滲透壓濃度和pH至允許細胞生長的值為例如約pH 6. 8和約pH 7. 2之間的值。開始培養(yǎng)時，培養(yǎng)基的重量摩爾滲透壓濃度通常在約280m0sm和約365m0sm之間，但也可以在培養(yǎng)及加入流加溶液期間逐漸增加至低于600m0sm/kg或約600m0sm/kg的值。優(yōu)選地,本發(fā)明的培養(yǎng)基具有約285m0sm/kg和約365m0sm/kg之間的初
始重量摩爾滲透壓濃度。在細胞存活和生長的范圍內(nèi)選擇細胞培養(yǎng)的溫度。用于細胞培養(yǎng)的典型溫度在約30°C和約38°C之間。例如，細胞最初在約36°C至約37°C的溫度下培養(yǎng)，該溫度最適于CHO 細胞。但是，精確的溫度可以調(diào)節(jié)至細胞的需要，且還可以在培養(yǎng)期間改變，以允許它們最佳的存活率、生長或產(chǎn)生。本發(fā)明的第一方面涉及細胞培養(yǎng)物中鈉離子和鉀離子之間的離子平衡。本發(fā)明描述了鈉離子與鉀離子的摩爾比，其在約10 I和約I : I之間。在本發(fā)明的其他實施中，在約9 I和約5 I之間選擇該比值。備選地，該比值在約8 I和約6 I之間。此處通過它們的摩爾含量來定義鈉離子和鉀離子的濃度及它們的比值。通過在加入各種鹽并使其溶解在培養(yǎng)基溶液中之后計算生長培養(yǎng)基中這些離子的總數(shù)目來確定鈉離子和鉀離子的濃度。為了達到所需的鈉濃度，通常向培養(yǎng)基中加入不同的鹽。常用的鈉鹽是例如NaCl、磷酸ニ氫鈉或磷酸氫ニ鈉鹽、碳酸鈉、檸檬酸鈉、痕量離子(例如亞硒酸鈉)，但不限于這些實例。為調(diào)節(jié)PH而向培養(yǎng)基中加入的堿氫氧化鈉(NaOH)對鈉離子的總含量也有貢獻。在這方面，術語離子指解離狀態(tài)。因此，計算離子的摩爾含量意味著考慮該離子的化合價。因此，向培養(yǎng)基中加入ImM氯化鈉(NaCl)將貢獻ImM的鈉離子，而ImM磷酸氫ニ鈉(Na2HPO4)將相應地貢獻2mM的鈉離子。根據(jù)本發(fā)明，用于培養(yǎng)基的鈉濃度在約50mM和約90mM之間。備選地，選擇鈉離子濃度為約65mM至約85mM。用于培養(yǎng)基的鉀鹽通常是KCl，但也可以包括例如K2SO4或磷酸ニ氫鉀(KH2PO4)。鉀鹽不限于這些具體實例。備選地，用于培養(yǎng)基的鉀濃度在約SmM和約12mM之間，或約10. 7mM0表I顯示傳統(tǒng)上用來培養(yǎng)哺乳動物細胞的培養(yǎng)基的實例。這些經(jīng)典培養(yǎng)基(如DMEM、DMEM/F12、BGJ等)具有特別高的Na/K離子比。本發(fā)明的培養(yǎng)基的特征在于低于約10 I的特別低的Na/K比(見表2)。本發(fā)明的培養(yǎng)基適合用于培養(yǎng)CHO及其他哺乳動物細胞，且顯示改善的細胞生長和/或允許改善的多肽產(chǎn)生。這類培養(yǎng)基的兩個實例顯示在表3中，其描述了兩個培養(yǎng)基實例的組成及可以如何達到低Na/K比。鈉離子與鉀離子的低比值與其他培養(yǎng)基特征之間的協(xié)同效應對細胞生長和重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生甚至具有附加的有利作用。除鈉離子和鉀離子的具體濃度及其具體比值外，本培養(yǎng)基的特征還在于向培養(yǎng)基成分的混合物中加入濃度特別低的氯化鈉(NaCl)。優(yōu)選地,使用約7mM至約15mM的濃度。此低量的氯化鈉是不常見的。在本發(fā)明的一些實施中，氯化鈉濃度(以mM表示)甚至低于所加入的各鉀鹽的濃度(以mM表示)。此外，本發(fā)明的培養(yǎng)基通常顯示低總含量的氯離子。如表2的實例所示，這導致初始氯濃度在約36mM和46mM之間。大多數(shù)情況下，諸如NaCl或CaCl2的無機鹽促成此值，但諸如氯化膽堿或氨基酸(例如L-組氨酸鹽酸或L-賴氨酸鹽酸)的培養(yǎng)基成分也可以增加其總濃度。
本發(fā)明的培養(yǎng)基組合物的另ー優(yōu)勢是低Na/K摩爾比與約40mM(備選地約50mM)和約IOOmM之間的起始氨基酸濃度組合在一起。經(jīng)典培養(yǎng)基使用相對低的氨基酸濃度和/或高Na/K比。兩種特征的組合可以提供有利于細胞生長和多肽產(chǎn)生的附加作用。表2顯示本發(fā)明的這些參數(shù)的不同實施。除它們的總氨基酸含量外，針對細胞生長優(yōu)化的本發(fā)明的適宜培養(yǎng)基優(yōu)選包含以下范圍的初始氨基酸濃度。
氨基酸濃度(mmol/L)
精氨酸，游離堿4. 0-6.0，優(yōu)選I 5-5.5
天冬酰胺一水合物3. 0-6.0，優(yōu)選10-5.5
天冬氨酸2. 5-4. 0，優(yōu)選3. 0-3. 6
甘氨酸0.3-0.8，優(yōu)選0.5-0. 7
組氨酸，HCl H2O0. 6-1. 0，優(yōu)選 0. 7-0. 9
異亮氨酸2.0-5.0，優(yōu)選2. 9-4.0
亮氨酸3.0-7.0，優(yōu)選3. 5-6.0
賴氨酸 HCl2.0-4.0，優(yōu)選 2. 5-3. 5
甲硫氨酸I. 0-1. 5，優(yōu)選I. 2-1. 4
苯丙氨酸I. 0-2. 0，優(yōu)選I. 3-1. 8
脯氨酸2. 5-6.0，優(yōu)選3.0-5. 5
絲氨酸3.0-8.0，優(yōu)選4.0-7.0
蘇氨酸2.0-3. 5，優(yōu)選2. 5-3. I
色氨酸0. 4-1. 0，優(yōu)選0. 5-0. 8
纈氨酸2. 5-5. 0，優(yōu)選3. 0-4. 權利要求
1.用于培養(yǎng)哺乳動物細胞的細胞培養(yǎng)基，其特征在于鈉離子與鉀離子的摩爾比在約10 I和約I : I之間。
2.權利要求I的細胞培養(yǎng)基，其中所述鈉離子與鉀離子的摩爾比在約8 I和約6 I之間。
3.權利要求I或2的細胞培養(yǎng)基，其中鈉離子的濃度在約50mM和約90mM之間。
4.前述權利要求中任一項的細胞培養(yǎng)基，其中鉀離子的濃度在約8mM和約12mM之間。
5.前述權利要求中任一項的細胞培養(yǎng)基，其中總氨基酸濃度在約40mM和約IOOmM之間。
6.前述權利要求中任一項的細胞培養(yǎng)基，其中總離子濃度與總氨基酸濃度間的摩爾比在約I. 9和約4之間。
7.用于產(chǎn)生重組多肽的方法，其包括在權利要求I至6任一項中定義的培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動物細胞，并表達所述重組多肽。
8.權利要求7的方法，其中所述培養(yǎng)條件包括至少一次溫度變動和/或至少一次pH變動。
9.權利要求7或8的方法，其中通過補料分批方法來進行培養(yǎng)。
10.權利要求7至9中任一項的方法，其中所述產(chǎn)生的多肽是糖基化的。
11.權利要求10的方法，其中所述多肽是抗體或抗體片段。
12.權利要求7至11中任一項的方法，其中所述哺乳動物細胞選自CHO細胞、HEK細胞和SP2/0細胞。
13.用于產(chǎn)生權利要求I的細胞培養(yǎng)基的方法，其中將不同的成分相互混合。
14.權利要求13的方法，其中按約7mM和約15mM之間的濃度加入氯化鈉。
15.權利要求13或14的方法，其中按約8mM和約12mM之間的濃度加入氯化鉀。
全文摘要
本發(fā)明描述用于哺乳動物細胞培養(yǎng)以及多肽產(chǎn)生的優(yōu)化培養(yǎng)基。該細胞培養(yǎng)基的特征在于低鈉鉀離子比，本發(fā)明還涉及用這類細胞培養(yǎng)基產(chǎn)生多肽的方法。在另一方面，該多肽產(chǎn)生方法還可以包括溫度變動和/或pH變動來進一步優(yōu)化生長和產(chǎn)物產(chǎn)率。
文檔編號C12N5/00GK102858952SQ201180021024
公開日2013年1月2日 申請日期2011年4月25日 優(yōu)先權日2010年4月26日
發(fā)明者C·萊斯特, P·邁斯納, J·施密特 申請人:諾瓦提斯公司