專利名稱：誘導肝干細胞及其制造方法、以及該細胞的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在安全性試驗，毒性試驗，代謝試驗，藥物相互作用試驗，抗病毒活性試驗，高脂血癥藥、 高血壓治療藥、低分子化合物藥物、抗體藥物等藥物的篩選試驗，新藥發(fā)現(xiàn)革巴標篩選，動物模型制作，肝臟合成蛋白(hepatocyte-produced proteins)的生產及再生醫(yī)療中有用的誘導肝干細胞，特別涉及特征在于具有肝細胞的性質、以與胚胎干細胞同等的量表達胚胎干細胞的標志基因群且能夠長期增殖繼代培養(yǎng)的誘導肝干細胞、其制造方法及該細胞的用途。
背景技術：
制藥企業(yè)的新藥研究開發(fā)均存在研究開發(fā)周期長且研究開發(fā)費用高的問題。并且，現(xiàn)狀是雖然存在多個預期將來將成為新藥的候補，但隨著研究開發(fā)的進展而產生有效性、安全性的問題，其中的大半不得不放棄開發(fā)。通常，開發(fā)新藥需要長達9 17年的較長時間和數(shù)十億元 數(shù)百億元的巨額研究開發(fā)費用，因此可以說，若存在能夠在臨床前等早期階段縮小候補化合物范圍的新藥發(fā)現(xiàn)工具，則能夠減少其開發(fā)費用。然而，在目前的非臨床試驗中，在藥物的安全性、毒性等的評價中，必須使用動物進行試驗，這也是開發(fā)費居高不下的原因之一。此外，由于人和動物的種間差異，有時藥物在生物體內的動態(tài)是不同的，因而有時無法對安全性進行充分評價，進入臨床試驗階段才獲知候補化合物具有毒性而放棄開發(fā)。因此，非常希望建立在研究開發(fā)的早期階段對候補化合物在人活體內的動態(tài)等進行預測及評價的評價體系，目前已經開展了以構建使用人肝細胞的評價系統(tǒng)來代替具有“種間差異壁壘”的界線的動物實驗為目標的研究。這樣的評價系統(tǒng)由于能夠在藥物開發(fā)的早期階段準確地篩出安全性高的候補藥，因此在制藥企業(yè)中存在較大需求。目前的使用人培養(yǎng)細胞的非臨床試驗中，使用的是外國人的原代培養(yǎng)肝細胞或已有細胞株等。然而，原代培養(yǎng)肝細胞存在供體稀缺、批次差異非常大的問題。尤其是，日本人的原代培養(yǎng)肝細胞由于倫理問題及法律限制而非常難獲得，無法實現(xiàn)穩(wěn)定供給。進而，肝臟中表達的藥物代謝酶發(fā)揮著催化多種藥物代謝的重要作用，但存在基因多態(tài)性且其表達量及活性也存在較大個體差異，因此使得上述非臨床試驗中的問題更加嚴峻。此外，為了應對數(shù)量龐大的個體的差異，希望能夠以囊括這些差異的來自多個供體的原代培養(yǎng)肝細胞作為代表細胞而重復用于各種試驗。然而，即使在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)原代培養(yǎng)肝細胞，也幾乎無法進行增殖培養(yǎng)，因此還存在實際中無法對該肝細胞進行繼代培養(yǎng)并反復用于各種試驗的問題。另一方面，現(xiàn)有細胞株大多是發(fā)生了核型異常的細胞，此外，也不存在囊括數(shù)量龐大的個體的差異的多個細胞株。進而，通過現(xiàn)有方法長期繼代培養(yǎng)的現(xiàn)有細胞株由于未顯示出與原代培養(yǎng)肝細胞同樣的藥物代謝酶活性、轉運蛋白誘導能力，因此無法由其結果預測臨床中對人的安全性、代謝等。由上述諸多情況可知，雖然期待具有肝細胞的性質、能夠長期繼代培養(yǎng)的細胞，但尚未報道從囊括數(shù)量龐大的個體的差異的多個供體發(fā)現(xiàn)這樣的細胞。此外，設想存在肝臟的干細胞、即具有分化為肝細胞能力的肝干細胞。然而，還不存在發(fā)現(xiàn)如胚胎干細胞及誘導多能性干細胞那樣表達自我復制基因、具有能夠長期在生物體外繼代培養(yǎng)的性質的肝干細胞的報道。因此，在生物體外，理論上能夠分化為所有組織的體細胞、生殖細胞的保持分化多能性且能夠以未分化的狀態(tài)幾乎無限地自我復制的胚胎干細胞(Embryonic stem cells,ES細胞)(本說明書中以下記為“胚胎干細胞”。)是否不僅能夠用于再生醫(yī)療而且可以用于 新藥發(fā)現(xiàn)領域還在研究之中。胚胎干細胞是指由屬于動物的發(fā)生初期階段的囊胚期的胚的一部分的內部細胞塊制備的干細胞株，取英語的頭一個字母時也被稱為ES細胞。為了建立胚胎干細胞，需要受精卵或由受精卵進一步發(fā)生至囊胚階段的初期胚。在人的情況下，由于使用受精卵作為材料，認為存在使生命的萌芽消滅這一倫理問題。因此，存在著不允許制作和研究人胚胎干細胞的國家，此外，即使在認為具有治療帕金森病等神經退行性疾病、脊髓損傷等目前無法根治的疾病的可能性而允許對其進行研究的國家，對人胚胎干細胞的操作也加以嚴格的限制。因此，胚胎干細胞的基礎研究、應用研究中倫理問題是一個較大的障礙。此外，實際中為了使用胚胎干細胞，需要使胚胎干細胞分化為某種特定細胞，積極地開發(fā)了分化為肝細胞、神經細胞、心肌細胞、胰島β細胞等的方法。然而，這樣分化為特定細胞較為困難，特別是難以誘導分化為肝細胞。目前尚未建立高效分化誘導為能夠用于新藥發(fā)現(xiàn)研究的高品質成熟肝干細胞的方法。目前報告的所有分化誘導法均需要3周左右的較長時間，花費了較高費用、勞力、時間而高度分化誘導的肝細胞樣細胞幾乎無法增殖。最近報道了 通過導入0CT3/4基因(0CT3/4為基因名，有時也記作0CT3或4，在本說明書中以下記作POUFI基因。)、S0X2基因、KLF4基因及c_MYC基因(專利文獻I)或在堿性成纖維細胞生長因子存在下導入P0U5F1基因、S0X2基因及KLF4基因(非專利文獻I )，從而能夠由人等的體細胞制作稱為誘導多能性干細胞的與胚胎干細胞同樣的未分化細胞(專利文獻2)。已知的是，人的誘導多能性干細胞(induced Pluripotent Stem Cells;iPS細胞)(本說明書中，以下記為“誘導多能性干細胞”。)具有如下兩個特征(1)分化多能性能夠分化為形成個體的所有細胞的三胚層，(2)自我復制能力在特定的條件下，能夠維持其未分化性狀態(tài)地在培養(yǎng)皿中無限地繼代培養(yǎng)。并且，該人誘導多能性干細胞在形態(tài)、基因表達、細胞表面抗原、長期自我復制能力、畸胎瘤(良性腫瘤)形成能力方面與人胚胎干細胞非常類似(非專利文獻2、非專利文獻3)，進而，報道指出HLA的基因型與其來源細胞即體細胞完全相同(非專利文獻3)。通常認為，在該誘導多能性干細胞的制作中，僅僅向細胞中導入P0U5F1基因、S0X2基因、KLF4基因、c-MYC基因這4個基因或P0U5F1基因、S0X2基因、KLF4基因這3個基因，即可使已經分化的體細胞“初始化·復位”成未分化的多能性干細胞。然而，人細胞的情況下，用4個基因時僅能以O. 1%-0. 01 %、用3個基因時僅能以O. 01%-0. 001%的效率由體細胞制作誘導多能性干細胞。因此，99. 9%-99. 999%的細胞無法通過基因導入而復位為誘導多能性干細胞。
進而，在胚胎干細胞中特異性表達的NANOG基因、P0U5F1基因、S0X2基因、ZFP42基因、SALL4基因、LIN28基因及TERT基因等為對維持多能性干細胞的未分化性而言很重要的因子，可以認為其抑制了細胞的分化。因此，在已分化的細胞中，隨著分化基因(分化細胞的性質)的表達，作為對維持未分化性而言很重要的因子的NANOG基因、P0U5F1基因、S0X2基因、ZFP42基因、SALL4基因、LIN28基因及TERT基因的表達則消失。也即，通常認為，使對維持未分化性而言很重要的因子NANOG基因、P0U5F1基因、S0X2基因、ZFP42基因、SALL4基因、LIN28基因及TERT基因以及分化細胞的多種性質(多個分化基因的表達)一起進行表達的細胞是無法制作的?，F(xiàn)有技術文獻專利文獻 專利文獻I :日本特開2008-283972
專利文獻2 日本特開2008-307007非專利文獻非專利文獻I Nakagawa M et al. , Nat Biotechnol. , 2008, 26, 101-6非專利文獻2 :Takahashi K, Yamanaka S et al.，Cell, 2007，131，861-872非專利文獻3 =Masaki H, Ishikawa T et al.，Stem Cell Res.，2008，I, 105-115因此，本發(fā)明人等對于能否制作使對維持未分化性而言很重要的基因和肝細胞的多種性質共存的細胞進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)能夠獲得不僅表達胚胎干細胞特異性基因而且表達肝細胞特異性基因的誘導肝干細胞，并且發(fā)現(xiàn)該誘導肝干細胞在安全性試驗，毒性試驗，代謝試驗，藥物相互作用試驗，抗病毒活性試驗，高脂血癥藥、高血壓治療藥、低分子化合物藥物、抗體藥物等藥物的篩選試驗、新藥發(fā)現(xiàn)靶標篩選、動物模型的制作、肝臟合成蛋白的生產、及再生醫(yī)療中有用，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內容
發(fā)明要解決的問題因此，本發(fā)明的第I目的在于提供不僅表達胚胎干細胞特異性基因而且表達肝細胞特異性基因的誘導肝干細胞。本發(fā)明的第2目的在于提供不僅表達胚胎干細胞特異性基因而且表達肝細胞特異性基因的誘導肝干細胞的制作方法。本發(fā)明的第3目的在于提供使用本發(fā)明的誘導肝干細胞的安全性試驗方法、毒性試驗方法、代謝試驗方法、藥物相互作用試驗方法、抗病毒活性試驗方法、高脂血癥藥、高血壓治療藥、低分子化合物藥物、抗體藥物等藥物的篩選試驗方法、新藥發(fā)現(xiàn)靶標篩選方法、動物模型制作方法、肝臟合成蛋白的生產方法、及再生醫(yī)療等方法。用于解決問題的方案S卩，本發(fā)明的第I發(fā)明為特征在于至少具備下述(I) (3)的特征的誘導肝干細胞(權利要求I)。(I)表達選自作為胚胎干細胞的標志基因的下述表I的基因群中的至少15種基因。[表 I]
權利要求
1.一種誘導肝干細胞，其特征在于，其至少具備下述(I) (3)的特征，(I)表達選自作為胚胎干細胞的標志基因的下述表I的基因群中的至少15種基因，[表I]
2.根據權利要求I所述的誘導肝干細胞，在前述誘導肝干細胞中表達的前述(I)胚胎干細胞的標志基因的表達量與在胚胎干細胞中表達的基因的表達量相比為1/81倍。
3.根據權利要求2所述的誘導肝干細胞，在前述誘導肝干細胞中表達的前述(I)胚胎干細胞的標志基因的表達量與在胚胎干細胞中表達的基因的表達量相比為1/Γ4倍。
4.根據權利要求I 3中任一項所述的誘導肝干細胞，其特征在于，其表達作為前述(I)胚胎干細胞的標志基因的NANOG基因、P0U5F1基因、S0X2基因、ZFP42基因及SALL4基因。
5.根據權利要求I 4中任一項所述的誘導肝干細胞，其表達作為前述(2)肝細胞的性質的相關基因的選自下述表2的基因群中的15種以上。
[表2]
6.根據權利要求I 5中任一項所述的誘導肝干細胞，其表達作為前述(2)肝細胞的性質的相關基因的AFP基因、TTR基因、TF基因、AP0A2基因、AP0A4基因、AHSG基因、FGA基因、AGT基因、FABPl基因、SERPINA1基因及RBP4基因。
7.根據權利要求I 6中任一項所述的誘導肝干細胞，其還選自中內胚層系干細胞及/或內胚層系干細胞特異性的表達S0X17基因、F0XA2基因、GSC基因、EOMES基因、TCF2基因中的至少I種基因。
8.根據權利要求I 7中任一項所述的誘導肝干細胞，進而，在受試物質作用下，抑制或誘導選自下述表3的基因群中的至少I種基因的表達，或者促進或抑制該基因的基因產物的活性。
[表3]
9.根據權利要求I 8中任一項所述的誘導肝干細胞，其能夠增殖培養(yǎng)或繼代培養(yǎng)I個月以上。
10.根據權利要求I所述的誘導肝干細胞的制造方法，其特征在于，所述誘導肝干細胞的制造方法包括將哺乳動物細胞誘導為誘導肝干細胞的エ序，該エ序為如下エ序使前述哺乳動物細胞處于存在用于誘導誘導肝干細胞所必需的P0U5F1基因、KLF4基因及S0X2基因的基因產物且使得P0U5F1基因的基因產物的細胞內存在比率大于S0X2基因的基因產物的狀態(tài)。
11.根據權利要求10所述的誘導肝干細胞的制造方法，其特征在于，前述エ序為如下エ序使用前述用于誘導誘導肝干細胞所必需的P0U5F1基因、KLF4基因及S0X2基因或它們的基因產物，P0U5F1基因或該基因的基因產物與S0X2基因或該基因的基因產物的使用比率大于I。
12.根據權利要求11所述的誘導肝干細胞的制造方法，前述的用于誘導誘導肝干細胞所必需的P0U5F1基因、KLF4基因及S0X2基因的使用比率滿足P0U5F1基因> KLF4基因>S0X2基因的關系。
13.根據權利要求12所述的誘導肝干細胞的制造方法，前述的用于誘導誘導肝干細胞所必需的P0U5F1基因、KLF4基因及S0X2基因的使用比率為4 :2 :1。
14.根據權利要求10 13中任一項所述的誘導肝干細胞的制造方法，前述哺乳動物細胞為來源于成體的細胞、來源于新生仔的細胞、來源于新生仔皮膚的細胞、罹患癌癥個體的細胞、胚胎干細胞、誘導多能性干細胞、或由胚胎干細胞或誘導多能性干細胞分化的細胞。
15.根據權利要求10 14中任一項所述的誘導肝干細胞的制造方法，前述哺乳動物是人。
16.ー種使用權利要求I所述的誘導肝干細胞的試驗方法，其特征在干，該試驗方法為選自安全性試驗方法、毒性試驗方法、代謝試驗方法、藥物相互作用試驗方法、抗病毒活性試驗方法、藥物的篩選試驗方法中的試驗方法。
17.根據權利要求16所述的試驗方法，前述藥物的篩選試驗方法為高脂血癥藥、高血壓治療藥、低分子化合物藥物或抗體藥物的篩選試驗方法。
18.一種新藥發(fā)現(xiàn)靶標篩選方法，其特征在于，使用權利要求I所述的誘導肝干細胞。
19.一種動物模型制作方法，其特征在于，使用權利要求I所述的誘導肝干細胞。
20.一種肝臟合成蛋白的生產方法，其特征在干，使用權利要求I所述的誘導肝干細胞。
21.ー種以哺乳動物對象的治療方法，其特征在于，使用權利要求I所述的誘導肝干細胞。
全文摘要
本發(fā)明為在安全性試驗，毒性試驗，代謝試驗，藥物相互作用試驗，抗病毒活性試驗,高脂血癥藥、高血壓治療藥、低分子化合物藥物、抗體藥物等藥物的篩選試驗，新藥發(fā)現(xiàn)靶標篩選，動物模型制作，肝臟合成蛋白的生產及再生醫(yī)療中有用的下述誘導肝干細胞、其制造方法及該細胞的用途。一種誘導肝干細胞，其特征在于，至少具備下述(1)～(3)的特征，(1)表達選自作為胚胎干細胞的標志基因的特定基因群中的至少15種基因，(2)具有肝細胞的性質，(3)能夠增殖培養(yǎng)或繼代培養(yǎng)3天以上。
文檔編號C12N5/071GK102858958SQ20118001800
公開日2013年1月2日 申請日期2011年2月3日 優(yōu)先權日2010年2月3日
發(fā)明者石川哲也, 萩原啟太郎, 落谷孝廣 申請人:日本國立癌癥研究中心