專利名稱：檢測生物相關(guān)分子及其相互作用性質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測分析物微粒、并在復(fù)雜介質(zhì)中確定其相互作用性質(zhì)的方法。更具體地，本發(fā)明涉及擴(kuò)散免疫測定及其功能等同物。
2.相關(guān)背景技術(shù)描述生物相關(guān)分子例如蛋白質(zhì)和核酸，是與生物系統(tǒng)廣泛相關(guān)的，這些生物相關(guān)分子形成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，從而完成相應(yīng)的任務(wù)，例如細(xì)胞復(fù)制、新陳代謝、自身調(diào)節(jié)、細(xì)胞間信號傳導(dǎo)(intercellular signaling),以及免疫響應(yīng)。疾病使這些網(wǎng)絡(luò)發(fā)生畸變,對于疾病的早期檢測和利用藥物治療對畸變進(jìn)行的化學(xué)修復(fù)而言，理解這些畸變是最基本的。存在很多鑒定和表征這些大分子以獲得對相互作用網(wǎng)絡(luò)理解的現(xiàn)有技術(shù)，但是這些技術(shù)的每一個(gè)都受到特定的限制。這些技術(shù)用于核酸(例如DNA)已經(jīng)廣泛成功，歸因于核酸的分析上的有利性質(zhì)，但是蛋白質(zhì)則在物理和化學(xué)上都是多變的。這種就是由須集中在較窄范圍內(nèi)的分析技術(shù)導(dǎo)致的，而較寬范圍的技術(shù)更有利于表征復(fù)雜的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。而且，蛋白質(zhì)即使在檢測不到的濃度下也具有顯著的功能，不能夠像核酸那樣容易地進(jìn)行擴(kuò)增，因此具有較高固有敏感度的技術(shù)的必需的。遺傳學(xué)方法蛋白質(zhì)的相互作用可以通過經(jīng)典遺傳學(xué)研究。將不同的變異結(jié)合到相同的細(xì)胞或有機(jī)體中，然后觀察所得的表現(xiàn)型。這能夠保證蛋白質(zhì)的相互作用發(fā)生于接近其理想的原位環(huán)境(native environment)0不幸的是，所述方法只能用于小組的蛋白質(zhì)，不能用于探究整個(gè)蛋白質(zhì)組。進(jìn)一步地，與基因變異有關(guān)的許多原因都能導(dǎo)致表現(xiàn)型的變化，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果所顯示的蛋白質(zhì)相互作用需要在生化水平上進(jìn)行證實(shí)。生物信息學(xué)方法蛋白質(zhì)的相互作用可以通過使用蛋白質(zhì)功能注釋(Functional annotation)的比較基因組學(xué)來研究。目前，存在三種主要的技術(shù)。第一種技術(shù)稱為域融合(Domain Fusion)或羅賽塔石碑軟件(Rosetta Stone)，該技術(shù)假設(shè)蛋白質(zhì)域結(jié)構(gòu)上和功能上獨(dú)立的單元，該單元作為離散的多肽發(fā)揮作用。第二種技術(shù)是基于細(xì)菌基因的操縱子組織，其中所述基因通常功能相關(guān)，即使它們實(shí)際的序列是不同的。第三種技術(shù)使用系統(tǒng)發(fā)育學(xué)數(shù)據(jù)，充分利用特定功能所涉及的基因的進(jìn)化保育(evolutionary conservation)。不幸的是,這種生物信息學(xué)方法需要完整的基因組序列，并且一般地被限制為操縱子已經(jīng)充分鑒定的細(xì)菌或其它有機(jī)體。另外，得到的結(jié)果并不能為特定蛋白質(zhì)相互作用提供有力的證據(jù)，需要在生化水平上進(jìn)行證實(shí)。
基于親和力的方法蛋白質(zhì)的相互作用可以在生化水平上通過直接測定蛋白質(zhì)與待選的相互作用對象之間的親和力進(jìn)行研究，例如在免疫測定中進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)固定在靜止相或平板玻璃的表面，用有潛力的互補(bǔ)配體浸沒該固定的蛋白質(zhì)。通過化學(xué)連接到配體上的熒光或放射探針隨后顯像來對結(jié)合(Binding)進(jìn)行指示。不幸的是，固定操作嚴(yán)重地限制了蛋白質(zhì)的功能。一種相關(guān)技術(shù)中，對蛋白質(zhì)本身進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記，然后使之浸沒包覆有被固定的配體的表面。然而，這種操作經(jīng)受這樣的事實(shí)，不能以相同的效率對蛋白質(zhì)進(jìn)行均一標(biāo)記，并且標(biāo)記的化學(xué)連接會(huì)干擾蛋白質(zhì)相互作用的范圍。另外，標(biāo)記的連接會(huì)給蛋白質(zhì)溶解度帶來不利影響，而且熒光探針可能由于連接而淬滅。還可以通過電化學(xué)電流測定法(例如美國專利US 7，297，312)進(jìn)行檢測，但是仍然存在缺陷。擴(kuò)散免疫測定中使用在毛細(xì)管通道中的一對相鄰的液體流體(例如美國專利US 6，541，213，US 7，271，007，US 7，306，672，US 7，060，446，US7, 704·322 和美國專利申請 US 2010/0263732， US 2008/0182273， US 2003/0096310， US2009/0053732 和 US2003/0234356)，或其功能等價(jià)物，其中兩個(gè)液體中的組分之間在流體界面處的相互作用會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)散性質(zhì)的變化，從而影響液體界面附近的濃度數(shù)據(jù)。對濃度數(shù)據(jù)的檢測可以提供相互作用的信息。這避免了與穩(wěn)定相相關(guān)的難題。但是仍然優(yōu)選使用標(biāo)記法，并且每個(gè)樣品只有一種測量值是實(shí)用的(即，是不可循環(huán)的(non-cyclable))。使用多價(jià)的反應(yīng)物(例如US7，550，267)允許以差異較大的擴(kuò)散系數(shù)使用組分，但是仍存在標(biāo)記法和不可循環(huán)所導(dǎo)致的缺陷。使用多孔性膜的相關(guān)設(shè)備(例如US 5，212，065)也具有同樣的缺點(diǎn)。在一列電化學(xué)傳感器上使用薄聚合物層(例如US7，144，553)，能夠利用充滿聚合物的時(shí)間延遲來確定擴(kuò)散性質(zhì)。但是不能將分析物集中到狹窄的孔中(從而加強(qiáng)敏感性)，并且也難以控制分析物隨著液體流循環(huán)接近和遠(yuǎn)離傳感器?？梢酝ㄟ^光學(xué)追蹤一個(gè)分析物系統(tǒng)來測量擴(kuò)散(例如US 2008/0145856),但是這樣做的缺點(diǎn)是優(yōu)選使用標(biāo)記技術(shù)。也可以通過檢測水凝膠中的穿透深度來測量擴(kuò)散(例如US 2008/0145856)，但是這樣做的缺點(diǎn)是優(yōu)選使用標(biāo)記技術(shù)。微通道電導(dǎo)測定法測量蛋白質(zhì)分子通過微通道時(shí)的橫向電導(dǎo)，并且已有描述說明這種方法在無標(biāo)記的蛋白質(zhì)相互作用檢測中非常有用(例如US2005/0109621)。然而，該方法只能間接測定擴(kuò)散性質(zhì)，而難以循環(huán)進(jìn)行測量。電導(dǎo)測量法也可用于無標(biāo)記的細(xì)胞培養(yǎng)監(jiān)測(例如US 7，732，127和US7，192，752)，但是沒有對蛋白質(zhì)及其相互作用的直接測量方法。使用納米間隙(例如US 2005/0136419)可以避免電化學(xué)測量的某些雙層問題，但是這樣做得缺點(diǎn)是優(yōu)選鏈接(Tethering)技術(shù)。物理方法蛋白質(zhì)相互作用可以在物理水平上進(jìn)行研究。X射線結(jié)晶學(xué)和核磁共振(NMR)技術(shù)來確定分子中的蛋白質(zhì)微粒，并且得到的三維圖可以用來建議哪些其它分子可能適合于這種結(jié)構(gòu)或電荷分布。不幸的是，X射線結(jié)晶學(xué)需要使每個(gè)要研究的蛋白質(zhì)發(fā)生蛋白質(zhì)結(jié)晶的生長，這個(gè)過程非常困難而且費(fèi)時(shí)，而且結(jié)晶環(huán)境與蛋白質(zhì)發(fā)揮其功能的水性環(huán)境非常不同。NMR需要大量的純化蛋白質(zhì)，并且對于所得的復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行的分析并沒有足夠的說服力。表面等離子共振技術(shù)中，使用連接在金屬膜上的蛋白質(zhì)，但是這將給蛋白質(zhì)功能帶來不利影響。
突光共振能量轉(zhuǎn)移(FluorescenceResonance Energy Transfer,FRET)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是能量轉(zhuǎn)移能夠發(fā)生在附近的熒光團(tuán)之間，這時(shí)一個(gè)熒光的發(fā)射光譜與另一個(gè)熒光的激發(fā)相重疊。通過用一種熒光標(biāo)記一個(gè)待選的相互作用對象，而用另一種熒光標(biāo)記另一個(gè)待選的相互作用對象，從而相互作用可以通過熒光的此消彼長來指示。這種方法甚至適合于瞬時(shí)的相互作用。但不幸的是，這種方法需要將熒光團(tuán)化學(xué)連接到每一蛋白質(zhì)上，這將給蛋白質(zhì)的功能帶來不利影響。原子力顯微鏡技術(shù)用于樹突分離(Dendron-Isolated)的分析物(例如US6, 645，558，US 2008/0113353, US 2009/0048120 和 US 2010/0261615)，可以檢測單個(gè)的分析物分子，但是需要鏈接(Tether)鍵并制備大量的樣品。標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)文庫蛋白質(zhì)相互作用可以通過使用cDNA文庫來研究，其中cDNA產(chǎn)生誘餌蛋白，誘餌蛋白可以被標(biāo)記并用作探針。典型地，誘餌蛋白通過使用噬菌體微粒來產(chǎn)生。這種技術(shù)允許誘餌蛋白與其相應(yīng)的cDNA結(jié)合，但是主要的缺點(diǎn)是生產(chǎn)能力低下；需要對每個(gè)誘餌蛋白進(jìn)行篩選。另外，由于誘餌蛋白并不是在原位條件下產(chǎn)生，因此可能出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊和假負(fù)值。 相位間相互作用的顯示蛋白質(zhì)的相互作用可以通過使用表達(dá)式克隆戰(zhàn)略來研究。將cDNA序列插入噬菌體蛋白的外殼基因，并在細(xì)菌細(xì)胞中培養(yǎng)。接著噬菌體在其外殼上表達(dá)出新的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可用于蛋白質(zhì)相互作用分析。如果這些噬菌體的混合物在小孔中與被固定標(biāo)記的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，則可以沖洗小孔以棄除相互所用的噬菌體，以及形成這種噬菌體的cDNA序列。再通過細(xì)菌感染對該cDNA序列進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增。這種技術(shù)可以很容易進(jìn)行自動(dòng)平行篩選。但不幸的是，與標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)文庫一樣，蛋白質(zhì)沒有在原位環(huán)境下形成。并且，這種技術(shù)也限于能形成于噬菌體表面上的短肽。酵母雙雜交系統(tǒng)蛋白質(zhì)相互作用可以通過使用酵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行研究，酵母細(xì)胞是相對于體外而言更加原位的環(huán)境。所研究的蛋白質(zhì)在單倍體酵母細(xì)胞中表達(dá)，作為轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合。另一個(gè)蛋白在另一個(gè)單倍體酵母細(xì)胞中表達(dá)，作為同樣的轉(zhuǎn)錄因子與反式激活結(jié)構(gòu)域的融合。使兩個(gè)酵母菌株交配，得到二倍體菌株，使得兩者的蛋白質(zhì)能夠相互作用。如果不發(fā)生相互作用，則轉(zhuǎn)錄因子將會(huì)聚集，使得測試基因被激活。這種技術(shù)易于進(jìn)行大規(guī)模篩選，但是存在幾點(diǎn)缺陷。實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性很低，顯示出對于環(huán)境條件的不規(guī)律的敏感性，或篩選不全面。已有許多利用其它更特定的技術(shù)檢測人們熟知的相互作用失敗的例子，說明假負(fù)值的概率很高。最后，許多所檢測的相互作用都在進(jìn)一步分析中被確定為無效，說明假正值的概率很高。本文中所提及的所有公開物在不發(fā)生相互矛盾的前提下，以引用的方式整體并入本文中。

發(fā)明內(nèi)容
本文所述方法是用了現(xiàn)有技術(shù)，包括球狀體、磁場、熒光、光、過濾技術(shù)、凝膠技術(shù)、化學(xué)、電化學(xué)、色譜學(xué)以及基質(zhì)輔助激光解析電離(Matrix-Assisted Laser DesorptionIonization, MALDI),來檢測和表征分析物微粒(例如生物相關(guān)分子),從而表征分析物微粒的任何結(jié)構(gòu)變化，以及定義它們的相互作用。在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方法中，分析物微粒通過例如溶劑流體或電場的方法而被捕捉于離子環(huán)境(例如水性鹽溶液)下的微池中。一旦被捕捉，則捕捉過程終止，隨著分析物微粒擴(kuò)散到池外，測量池中的電導(dǎo)率。通過電導(dǎo)率來測量離子流的容易程度。由于離子流受到分析物微粒的限制，因而電導(dǎo)率隨著分析物微粒擴(kuò)散到池外而下降。通過電導(dǎo)率下降的時(shí)間段可以測量分析物微粒的擴(kuò)散系數(shù)。而通過擴(kuò)散系數(shù)可以測量分析物微粒的性質(zhì)，例如尺寸和形狀。使用電場來補(bǔ)充或抑制擴(kuò)散的操作也可以用來研究分析物微粒的電荷性質(zhì)。另外，兩個(gè)呈現(xiàn)結(jié)合相互作用的分析物微粒會(huì)表現(xiàn)出擴(kuò)散系數(shù)與單個(gè)分析物微粒相關(guān)地下降；通過這種下降可以測量結(jié)合相互作用。分析物微粒擴(kuò)散到池外后，重新被捕捉到池中，因而可以以連續(xù)的循環(huán)來重復(fù)測量。在與第一個(gè)方法相似的另一個(gè)方法中，使用熒光代替電導(dǎo)率來測量分析物微粒的擴(kuò)散系數(shù)。熒光的使用方式是，可以通過在電場中限制微粒流從而延遲熒光的開始，或者通過限制熒光微粒流本身。
進(jìn)一步的方法設(shè)計(jì)將分析物微粒物理地捕捉于池中，從而可以將這個(gè)池移動(dòng)到質(zhì)譜儀的真空室中并同時(shí)保持水性環(huán)境。然后可以使用激光燒蝕來使分析物微粒的水性基質(zhì)汽化，從而質(zhì)譜樣品的分子裂解得到更好的控制。本發(fā)明的方法可以對于尺寸差異較大的分析物微粒，在一個(gè)或多個(gè)參與者分析物微粒處于液體環(huán)境中的條件下，發(fā)現(xiàn)二者間、三者間或更多者間的相互作用。這種方法可能在生物標(biāo)記物開發(fā)，藥物開發(fā)以及藥物評估得以廣泛應(yīng)用。本發(fā)明方法相比于現(xiàn)有方法的強(qiáng)有力的優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明方法無標(biāo)記且無鏈接(Tether)，保證了分析物微粒在沒有化學(xué)連接標(biāo)記物或鏈接物的情況下在其原位狀態(tài)發(fā)生相互作用；標(biāo)記物或鏈接物仍然可以使用，但是不是必須的。本發(fā)明方法還高度不依賴于PH或其它溶液性質(zhì)，可以用于非常復(fù)雜的水性混合物，且只使用很小的樣品體積，并且允許循環(huán)(即，重復(fù))測量以增強(qiáng)敏感度。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種檢測分析物微粒的存在、性質(zhì)及相互作用的方法，包括提供由具有多個(gè)通孔的材料構(gòu)成的薄片，所述通孔具有基本上相近的直徑；在所述材料的至少一個(gè)面上，限制所述孔的開口 ；將分析物微粒插入到所述孔的子群中；施加電場，貫通含有所述分析物微粒的所述通孔；測量電流隨時(shí)間的變化，所述變化能夠指示出所述分析物微粒的擴(kuò)散速率；并且其中，通過所述分析物微粒的所述擴(kuò)散速率來測量所述分析物微粒的存在、性質(zhì)及相互作用。所述片材料包括聚碳酸酯；徑跡蝕刻的聚碳酸酯；鉆有多個(gè)孔的聚合物；化學(xué)蝕刻有多個(gè)孔的聚合物；鉆有多個(gè)孔的玻璃；有孔的聚合物薄膜；有孔的單層薄膜；或有孔的多層薄膜。典型地，所述材料是電絕緣且基本上化學(xué)惰性的。所述片材的厚度可以在500nm至IOOOOOOnm的范圍內(nèi)?；蛘?，所述片材的厚度在Inm至IOnm的范圍內(nèi)。所述通孔的直徑為IOnm至5000nm。或者,所述通孔的直徑為Inm至1cm。在一種設(shè)定中，所述通孔的內(nèi)表面是化學(xué)衍生的。或者，所述通孔的外表面是化學(xué)衍生的。所述通孔可以由凝膠填充。在一個(gè)實(shí)施方式中，利用與所述片材的表面接觸的凝膠層，來限制所述孔的所述開口。所述凝膠包括明膠；瓊脂糖；聚丙烯酰胺；聚丙烯酸酯；滲透性聚合物；滲透性共聚物；淀粉；氣凝膠；火棉膠；透析膜；與所述分析物微?；|(zhì)不混溶的液體；以上所列任一種材料的化學(xué)改性形式；嵌入有微粒的以上所列任一種材料；及它們的組合。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用球狀體限制所述孔的開口，所述球狀體具有的直徑設(shè)置為能夠基本上限制通過所述孔的液體流。通過以下的方式，使所述球狀體位于固定在位置上重力；向心力 ’離心力;動(dòng)水壓；靜水壓；化學(xué)鍵或使用凝膠基質(zhì)。使用凝膠基質(zhì)使所述球狀體位于固定位置上時(shí)，所述方法進(jìn)一步包括從所述凝膠基質(zhì)上移除所述球狀體。有利地，通過安培計(jì)來測量所述電流，所述安培計(jì)能夠以對于被測的擴(kuò)散速率足夠大的速率，測量通過所述片的選定區(qū)域的電流。所述選定區(qū)域通過以下方式來選定使用絕緣管，所述絕緣管的一端與所述片材料物理接觸；使用具有孔的絕緣片，所述絕緣片應(yīng)用于所述片材料的表面；或使用絕緣、與水不混溶的液體，所述液體應(yīng)用于所述片材料的表面。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于檢測分析物微粒的存在、性質(zhì)及相互作用的方法，其包括提供具有多個(gè)通孔的片材料，所述通孔具有基本上相近的直徑；在所述 材料的至少一個(gè)面上，限制所述孔的開口 ；將分析物微粒插入到所述孔的子群中；傳遞遷移力，軸向上貫通含有所述分析物微粒的所述通孔；測量熒光隨時(shí)間的變化，所述變化指示出所述分析物微粒的擴(kuò)散速率；其中，通過所述分析物微粒的所述擴(kuò)散速率提供了對所述分析物微粒的存在、性質(zhì)及相互作用的測量。優(yōu)選地通過測光系統(tǒng)來測量熒光，所述測光系統(tǒng)能夠以對于被測的擴(kuò)散速率足夠大的速率，測量所述片的選定區(qū)域的熒光。根據(jù)本發(fā)明的另一方面提供了一種鑒定分析物微粒的方法，包括提供具有多個(gè)通孔的片材料，所述通孔具有基本上相近的直徑；在所述材料的至少一個(gè)面上，限制所述孔的開口 ；將分析物微粒插入到所述孔的子群中；基本上關(guān)閉所述孔的所述開口 ；將所述片材料插入到質(zhì)譜儀中；燒蝕所述片材料的選定區(qū)域；使燒蝕的結(jié)果產(chǎn)物離子化；測量結(jié)果離子的質(zhì)荷比；并且其中，通過所述質(zhì)荷比來鑒定所述分析物微粒。本方法還可以進(jìn)一步包括將所述球狀體壓進(jìn)所述孔的開口，來基本上關(guān)閉所述開口，從而限制所述孔的開口。


為了更好地理解本發(fā)明，現(xiàn)通過實(shí)施例的方式，參考附圖對本發(fā)明的方法進(jìn)行描述。其中圖IA表不本發(fā)明方法中所使用的有孔材料的不意圖；圖IB表示圖IA的有孔材料沿線x-x的截面?zhèn)纫晥D；圖2表示圖I的有孔材料的單個(gè)孔的放大圖；圖3表示可控厚度的雙層材料的產(chǎn)物；圖4表示用于形成丙烯酰聚胺凝膠的已知化學(xué)方法；圖5表示圖3的雙層材料的放大圖；圖6表示肽鍵合成的已知化學(xué)方法；圖7表不位置接近的圖I的有孔材料以及圖3的雙層材料的不意圖；圖8表示圖I的有孔材料以及圖3的雙層材料由肽鍵結(jié)合而產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)的示意圖9表示圖8結(jié)構(gòu)的示意圖，其中雙層中的外層被去除，凝膠層固定在有孔材料上；圖10表示圖9的變化的示意圖，其中熒光團(tuán)或表面活性劑化學(xué)結(jié)合到凝膠的外表面上；圖11表示圖9的變化的示意圖，其中在結(jié)構(gòu)聚集之前，球狀體填塞所述有孔材料中孔的一端，并保留出縫隙；圖12表示力的反填塞作用，所述力例如來自通過移動(dòng)圖11的球狀體的位置導(dǎo)致的磁場梯度；圖13表示圖9的變化的示意圖，其中在結(jié)構(gòu)聚集之前，球狀體填塞所述有孔材料中孔的一端，并不保留出縫隙；圖14表示圖9的變化的示意圖，其中球狀體填塞所述有孔材料中孔的兩端； 圖15表示由于移除圖14球狀體中的一個(gè)而產(chǎn)生的凝膠中的裂口 ；圖16表示圖9的變化的示意圖，其中球狀體填塞所述有孔材料的孔的一端，通過例如磁場梯度等帶來的力被固定位置；圖17表示通過圖9結(jié)構(gòu)中的孔的液體流的示意圖；圖18表示圖9結(jié)構(gòu)的孔中分析物微粒聚集的示意圖；圖19表不由電場E誘導(dǎo)的突光團(tuán)遷移的不意圖；圖20表不由磁場梯度nabla B誘導(dǎo)的突光團(tuán)遷移的不意圖；圖21表不由重力場G誘導(dǎo)的突光團(tuán)遷移的不意圖；圖22表不由電場E誘導(dǎo)的電解質(zhì)遷移的不意圖；圖23表示由電場J誘導(dǎo)的電解質(zhì)遷移導(dǎo)致的電容器形成；圖24表示與圖23的電容器相關(guān)的電場；圖25表電荷向圖23的突光團(tuán)轉(zhuǎn)移；圖26表示分子障礙物周圍的熒光團(tuán)遷移，其中a)無障礙物，b)小障礙物和c)實(shí)質(zhì)障礙物；圖27表示分子障礙物周圍的電解質(zhì)遷移，其中a)無障礙物，b)小障礙物和c)實(shí)質(zhì)障礙物；圖28表示帶電分子障礙物周圍的電解質(zhì)遷移，其中a)無障礙物，b)小障礙物和
c)實(shí)質(zhì)障礙物；圖29表示遷移的熒光團(tuán)受到紫外光的激發(fā)及其發(fā)射的可見光的示意圖；圖30表示帶電的熒光團(tuán)受到紫外光的激發(fā)及其發(fā)射的可見光的示意圖；圖31表示電流流向電極的示意圖；圖32表示如何將分析物微粒裝載到圖9所示結(jié)構(gòu)的孔中；圖33A表示如何以分析上有用的方式檢測電流的示意圖；圖33B表示圖33A中遞送分析物微粒的管線頂端的放大圖；圖33C表示由圖33A產(chǎn)生的電導(dǎo)率圖的視圖；圖34A表示如何以分析上有用的方式檢測熒光的示意圖；圖34B表不由圖34A廣生的照片影像的視圖；圖35表示當(dāng)施加電場時(shí)隨時(shí)間變化的電導(dǎo)率圖36表示當(dāng)施加遷移力時(shí)隨時(shí)間變化的照片影像；圖37表示一小組孔中的電流的垂直(增加)變化，不存在蛋白質(zhì)分子和存在蛋白質(zhì)分子的狀況；圖38表示一小組孔中的熒光的水平(暫時(shí))變化，不存在蛋白質(zhì)分子和存在蛋白質(zhì)分子的狀況；圖39表示一小組孔中存在蛋白質(zhì)分子以及不存在蛋白質(zhì)分子時(shí)的重復(fù)A電流測量;圖40表示一小組孔中存在蛋白質(zhì)分子以及不存在蛋白質(zhì)分子時(shí)的重復(fù)A時(shí)間測量;圖41表不一小組孔中蛋白質(zhì)發(fā)生_■級反應(yīng)以及另一小組孔蛋白質(zhì)分子不發(fā)生而 家反應(yīng)時(shí)的重復(fù)△電流測量；圖42表不一小組孔中蛋白質(zhì)發(fā)生_■級反應(yīng)以及另一小組孔蛋白質(zhì)分子不發(fā)生而家反應(yīng)時(shí)的重復(fù)A時(shí)間測量；圖43表示圖9有孔材料中大數(shù)量的孔的示意圖；圖44表示有孔材料中分子種類持久捕獲的第一階段的示意圖；圖45表示有孔材料中分子種類持久捕獲的第二階段的示意圖；圖46表示有孔材料中持久捕獲的分子種類的示意圖；圖47表示有孔材料的孔中持久捕獲的分子種類通過激光而發(fā)光的示意圖；圖48表示圖43捕獲的分子種類表現(xiàn)出蒸發(fā)的示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施方式以特有的方式使用現(xiàn)有技術(shù)的組合。這些現(xiàn)有技術(shù)包括球狀體，磁場，熒光，光學(xué)；濾光技術(shù)，化學(xué)，電化學(xué)，色譜學(xué)和基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization,MALDI)。將分別對它們進(jìn)行概述,然后描述根據(jù)本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方式的方法。在整篇專利說明書中，相同的附圖標(biāo)記表示相同的部件。球狀體球狀體可由商業(yè)途徑從很多廠商處獲得，比如從ttp://www.microspheres-nanospheres. com/ 獲得。球狀體具有在50nm至5000nm范圍內(nèi)的高精確的直徑，可以由各種材料制成，例如聚苯乙烯或聚苯乙烯/三聚氰胺共聚物。另外，球狀體可以灌注磁活性材料或灌注熒光材料。進(jìn)一步，這些微?？梢砸匝苌谋砻鎭砩a(chǎn)，比如氨基(NH2)或羧基(C00H)，利用周知的化學(xué)方法可以使許多配體連接到微粒上。它們廣泛地用于蛋白質(zhì)純化過程，其中特定的蛋白質(zhì)與表面配體結(jié)合，然后能夠磁性地從本體溶液(Bulk Solution)中提取出來。磁場在磁場梯度下，具有磁矩的微粒例如氧化鐵微粒，會(huì)受到朝向電場匯集處的力，力的大小為磁矩M和梯度納波拉(nabla) B的乘積。磁場梯度可以由簡單的帶電線圈產(chǎn)生。典型的線圈的最大磁場梯度點(diǎn)恰好位于線圈末端的外部，總是指向線圈的中心。一對相反的線圈，每個(gè)線圈都具有電流的補(bǔ)償正弦波，能夠用于產(chǎn)生任意強(qiáng)度和極性的磁場梯度。熒光熒光材料吸收短波光，釋放出長波光的能量。存在許多可商業(yè)獲得的熒光染料，在生物技術(shù)領(lǐng)域具有廣泛的用途。一個(gè)例子是突光素鈉(Sodium Fluoresceinate),其吸收紫外光，放射黃綠光。其自然形態(tài)，熒光黃(Fluorescein)是非熒光性的。除了熒光分子以夕卜，一種新型的稱為量子點(diǎn)(Quantum Dots)的材料也是突光的。其由半導(dǎo)體(例如硫化鎘(CdS)或碲化鎘(CdTe))微粒組成。其非常小，以幾納米的直徑排列，并且熒光性極強(qiáng)。微粒表面可以衍生有多種材料，例如氨基(NH2)或羧基(C00H)，利用周知的化學(xué)方法可以使許多配體連接到微粒上。它們廣泛地用于顯微染色。光學(xué)可以通過以短波光(例如紫外光)激發(fā)熒光并收集激發(fā)的長波光(例如可見光)，利用光電傳感器來檢測熒光。紫外光源例如是汞蒸氣泵和LED激光。對于近紫外而言，尤其 便于使用普遍用于藍(lán)光光碟的405nm LED激光。激發(fā)的熒光可用光學(xué)鏡或光管來收集，并被引導(dǎo)至光電傳感器中。光電傳感器例如是光電倍加管和數(shù)碼相機(jī)。光電倍加管具有較高的靈敏度和速度，數(shù)碼相機(jī)可以檢測較大的區(qū)域。濾光技術(shù)獨(dú)特類型的有孔材料10包括徑跡蝕刻的聚碳酸酯(Track-etchedPolycarbonate, TEPC),該有孔材料10可以商業(yè)購得并用于濾光，例如從密理博(Millipore)公司和華特門(Whatman)公司購得。TEPC包括具有平坦、玻璃狀表面的聚碳酸酯材料12的片，不規(guī)則地制有非常均勻的通孔14。圖IA和圖IB示意性示出了這樣的有孔材料10。這些孔14在尺寸為直徑IOnm至5000nm且材料厚度為6000nm至IlOOOnm時(shí)是可獲得的。有孔材料10通過對專有的聚碳酸酯材料進(jìn)行生產(chǎn)。孔14是基本平行的。該材料顯示出較小等級的熒光，但是可染黑色。該材料較強(qiáng)地吸收紫外光。具體地，用聚乙烯吡咯烷酮處理其表面使其具有親水性，能夠通過在乙醇中浸泡而除去。根據(jù)孔的密度，偶然會(huì)存在孔的重疊。凝膠技術(shù)技術(shù)上，凝膠由填充有液體的開放交聯(lián)結(jié)構(gòu)構(gòu)成，然而，這里所使用的定義“凝膠”并不限于其嚴(yán)格的技術(shù)定義，而是普遍地指與限制分析物擴(kuò)散有關(guān)的任何材料。普通凝膠是由明膠、瓊脂糖或丙烯酰胺組成。其開放交聯(lián)結(jié)構(gòu)的密度可以通過調(diào)節(jié)凝膠形成材料的濃度而容易地控制。有一些凝膠，例如明膠或瓊脂糖，具有低于凝膠結(jié)構(gòu)形成溫度的熔點(diǎn)。其他凝膠，例如由丙烯酰胺制成的凝膠，能夠利用化學(xué)誘導(dǎo)的聚合反應(yīng)或紫外線誘導(dǎo)的聚合反應(yīng)來形成。這些凝膠經(jīng)常在生物技術(shù)領(lǐng)域中很流行的稱為凝膠電泳的技術(shù)中用于分離復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物。在這個(gè)技術(shù)中，蛋白質(zhì)混合物的濃縮等分被注射到凝膠薄片的中央，然后在薄片的每一側(cè)對凝膠施加電場。凝膠的開放交聯(lián)結(jié)構(gòu)基本上是孔的集合，蛋白質(zhì)分子通過這些孔。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子典型地具有特有電荷和直徑，因此會(huì)在電場中以特定的速率遷移，通過凝膠的孔。因?yàn)槊糠N蛋白質(zhì)類型都具有獨(dú)特的電荷和直徑，因此蛋白質(zhì)混合物會(huì)物理分離成各個(gè)組分。如果凝膠的開發(fā)交聯(lián)結(jié)構(gòu)具有足夠的密度，則只有小分子能夠通過所述孔，而大分子完全從注射點(diǎn)開始進(jìn)行遷移。上述無法遷移的分子尺寸通常被認(rèn)為是凝膠的排阻限(Exclusion Limit)。對于聚丙烯酰胺來說,排阻限可以小于大多數(shù)的典型蛋白質(zhì)?；瘜W(xué)丙烯酰胺共聚是周知的反應(yīng)，普遍用于產(chǎn)生凝膠電泳用的凝膠。通過將丙烯酰胺單體與交聯(lián)劑例如N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(雙)，并使用自由基進(jìn)行催化來制備,所述自由基例如是來自過硫酸鹽離子以及引發(fā)劑例如脂肪叔胺N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺(TEMED)。也可以用核黃素和長波紫外光來進(jìn)行聚合。額外的反應(yīng)及例如尿素，可以用來降低凝膠的多孔性。另外，也可以包括其他的聚合物，例如聚丙烯酸酯，來輔助層壓化學(xué)作用。羧酸鹽衍生和氨衍生的過程中，基質(zhì)例如分子或表面會(huì)與水性試劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致羧酸鹽或氨部分(Moiety)連接到基質(zhì)上。例如，羧酸鹽表面的衍生是通過用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)疊氮化物處理以產(chǎn)生主要的氨部分，或使用強(qiáng)堿將聚乙烯吡咯烷酮的表面打開以形成羧酸鹽部分。一般地，這些部分基本上暴露于本體溶液中，且接下來能夠用于多種用途， 用于連接的化學(xué)作用高度依賴于基質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)。肽鍵合成是周知的反應(yīng)，普遍地用于肽合成。用I-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)處理羧酸鹽部分以生成不穩(wěn)定的反應(yīng)性0-?；愲艴?0-acylisoureaester).該酯能夠與主要的氨部分發(fā)生反應(yīng)，形成未定的氨鍵。然而呢，由于該酯的反應(yīng)性如此的強(qiáng)，因此也會(huì)與溶劑(水)發(fā)生反應(yīng)，再生成羧酸鹽部分。這降低了反應(yīng)效率?？梢酝ㄟ^將該酯與N-羥基硫代琥珀酸亞胺(硫代-NHS)反應(yīng)來進(jìn)行改善，形成半穩(wěn)態(tài)的氨反應(yīng)性NHS酯。后者的酯不與水反應(yīng)，僅與主要的氨部分反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵。電化學(xué)如果兩個(gè)電極放置與水性溶液中，且在兩個(gè)電極間產(chǎn)生一個(gè)電勢差，則會(huì)在水性溶液中形成電場。水自然地分成H3O+和0H_離子。由于這種分離產(chǎn)物帶電荷，因此會(huì)遷移到電極表面，在電極表面金屬會(huì)提供或提取電子，完成一個(gè)電流的回路。添加到水中的離子鹽類例如氯化鈉，會(huì)引入更高濃度的離子，允許非常高流量的電流。如果水性溶液中存在多種離子鹽類(每種鹽類都具有這樣的化學(xué)性質(zhì)使得能夠容易的實(shí)現(xiàn)電遷移過程)，則在檢測電流的同時(shí)掃描電勢，提供離子鹽類在水溶液中的表征。經(jīng)常地，在電化學(xué)領(lǐng)域中，在困難的電轉(zhuǎn)移過程中添加離子鹽類是非常有用的；這樣的離子鹽類普遍地作為“支持電解質(zhì)”。金屬電極表面的電場結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，因?yàn)楦鞣N離子在金屬表面附件形成層裝。色譜學(xué)色譜學(xué)對液體介質(zhì)中的組分進(jìn)行物理分離，之后采用適當(dāng)?shù)臋z測方法。典型地，一種復(fù)雜混合物的濃縮塞通過載體流(“流動(dòng)相”)沖至穿過窄管(“柱”)，窄管中充滿微粒(“固定相”)，微粒覆蓋有與混合物組分弱結(jié)合的材料。當(dāng)組分流過固定相時(shí)，一些組分比其他組分更強(qiáng)地結(jié)合，會(huì)更慢地向外洗提。因此，來自柱的洗提液會(huì)首先包括非結(jié)合組分，然后是一系列結(jié)合強(qiáng)度遞增的組分。用檢測器監(jiān)測組分的一些普遍性質(zhì)，例如紫外吸收，這種普遍性質(zhì)能夠在組分流出柱子時(shí)指示其存在。洗提液可用閥分開，從而收集每個(gè)組分。在生物技術(shù)領(lǐng)域，凝膠色譜廣泛應(yīng)用于分離和檢測蛋白質(zhì)的復(fù)雜組合物。然而，該技術(shù)從某種意義上不夠普遍，且需要相當(dāng)大體積的蛋白質(zhì)。最近，這項(xiàng)技術(shù)開始被“多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)(Multidimensional Protein Identification)”(也成為 MudPIT)所取代。該技術(shù)使用具有不同性質(zhì)的柱的組合，以及一組流體閥，以達(dá)到優(yōu)于凝膠電泳的蛋白質(zhì)分離。使用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(Capillary Zone Electrophoresis)也能夠降低所用蛋白質(zhì)的體積?；|(zhì)輔助激光解吸電離離子源(MALDI)在傳統(tǒng)的用途中，MALDI涉及將微觀量的生物樣品散步在玻璃或硅片上，并將其與可揮發(fā)的化合物混合。將硅片干燥，然后放入質(zhì)譜儀的腔室內(nèi)。聚焦的激光脈沖使每個(gè)樣品氣化，得到的氣態(tài)的離子化并且加速穿過質(zhì)譜儀的主腔室。氣化過程中，生物樣品嚴(yán)重裂解，并從質(zhì)譜數(shù)據(jù)中提取裂解圖案。這種程序廣泛應(yīng)用于工業(yè)中，使用斯奎諾姆(Sequenom)和其他廠商制造的裝置。第一實(shí)施方式概述特別構(gòu)建的層狀材料形成一組載有多種空間分離的分析物離子的池，所述層狀材料用電化學(xué)探針進(jìn)行掃描。由此得到多種分析物微粒性質(zhì)的圖，能提供關(guān)于生物樣品的有
用信息。 根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的方法在根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的方法中，有孔材料(例如TEPC濾紙)具有限制開口的孔。將受控基質(zhì)中的均勻或不均勻的分析物微粒群體載入TEPC濾紙的孔中，且使用電流測量向外的擴(kuò)散，由此測量分析物微粒的存在、性質(zhì)及相互作用?，F(xiàn)結(jié)合圖I至圖43對本發(fā)明的方法進(jìn)行描述。參考圖1A、圖IB和圖2，TEPC濾紙I具有不均勻尺寸孔的隨機(jī)分布。圖IA示出了頂視圖，而圖IB示出了截面圖。TEPC濾紙I可能具有由羧酸鹽部分3化學(xué)衍生的外表面。也可以用其他具有相似性質(zhì)的材料代替。參考圖3、圖4和圖5，雙層材料可能通過以下過程形成，第一，均勻尺寸的球狀體4的稀釋懸浮物形成于凝膠前體(例如丙烯酰胺和融化的瓊脂糖)基質(zhì)中。然后將懸浮物施加到薄塑料片5上并包在光滑圓柱體6的周圍，光滑圓柱體6具有疏水表面。凝膠7通過化學(xué)、熱或光聚合形成?；瘜W(xué)聚合的例子示出圖4中。間隔微粒4使凝膠7具有均勻的已知厚度。聚合以后，薄塑料片5從光滑圓柱體6上剝?nèi)?，形成由凝膠7層和塑料5層組成的雙層材料8。這種雙層材料的放大圖示于圖5中；球狀體4沒有在該放大圖中示出，因?yàn)橐呀?jīng)充分稀釋。選擇雙層材料8的界面9的化學(xué)性質(zhì)，使得薄塑料片5層將來能夠容易地通過物理或化學(xué)手段除去。凝膠7的外表面可以化學(xué)衍生有氨基部分10，但是聚丙烯酰胺原位的。對于所述雙層材料，可替代地，將凝膠前體夾在兩個(gè)疏水平坦平板中間，允許聚合和干燥。這形成堅(jiān)固干燥的、可容易地處理的凝膠膜，然后當(dāng)使用時(shí)進(jìn)行水合。對于所述雙層材料，可替代地，使用透析膜，該透析膜可以從很多提供商處購得，例如 Millipore 或 Whatman。參考圖6、圖7和圖8，雙層材料8可化學(xué)結(jié)合到TEPC濾紙I上?；瘜W(xué)結(jié)合機(jī)制的例子示于圖6中，其中羧酸鹽部分和氨部分化學(xué)結(jié)合以形成肽鍵11。也可以由其他化學(xué)作用替代。圖7示出了 TEPC濾紙I和雙層材料8相接近，且羧酸鹽衍生表面3和氨衍生表面10彼此相對。圖8示出了 TEPC濾紙I和雙層材料8以肽鍵11化學(xué)結(jié)合在一起。參考圖8和圖9，薄塑料片5可以通過物理或化學(xué)手段被除去，僅剩下凝膠7層固定與TEPO濾紙I。對于化學(xué)結(jié)合，可替代地，凝膠7層和TEPC濾紙I可通過沒有化學(xué)鍵合的物理力簡單壓縮在一起，例如通過包住圓柱體周圍并拉緊外部TEPC濾紙I層。對于化學(xué)結(jié)合，可替代地，TEPC濾紙I可放置于傳導(dǎo)液體表面，其中傳導(dǎo)液體與含有分析物微?；|(zhì)的液體不混溶。對于圖9所示的示意圖可以用多種變化，其例子示于圖10、圖11、圖12、圖13、圖14、圖15和圖16中。雖然本方法其余的部分主要講述圖9的簡單事例，但是應(yīng)當(dāng)理解這些變化都是可行的。參考圖10，凝膠7的外表面可用熒光團(tuán)12、表面活性劑13、其他材料或材料的任意組合進(jìn)行化學(xué)衍生。類似地，凝膠7的內(nèi)表面(面向孔2)或孔2的內(nèi)表面也可以進(jìn)行化學(xué)衍生。參考圖11、圖12和圖13，可在形成肽鍵11之前，使球狀體14暫位于孔2的開口中。該球狀體14可具有稍大于孔2直徑的直徑。凝膠7層可由于球狀體14的存在而凹回?？墒褂昧?6 (例如由磁場梯度、電場、重力場或動(dòng)水壓流產(chǎn)生)來將球狀體14從其在孔2開 口的位置上提起，在球狀體14表面和孔2的開口之間制造出一個(gè)小縫隙17?？臻e體積15可通過短暫加熱球狀體14以熔化周圍的凝膠7來除去，或者通過用凝膠前體使之飽和并隨后進(jìn)行化學(xué)聚合。所產(chǎn)生的結(jié)果示于圖13中。參考圖14和圖15，孔2的兩端都用球狀體14蓋起。如果凝膠7足夠柔順，則其中一個(gè)球狀體14可通過例如由磁場梯度產(chǎn)生的力被除去。這將在凝膠7中留出一個(gè)小裂口18。這種特定的配置在沒有有效保留機(jī)制的情況下對于孔2中的材料保留將非常有用。參考圖16，可不使用凝膠，而將球狀體14通過例如由磁場梯度16產(chǎn)生的力固定在位置上。關(guān)于圖9的簡單實(shí)例，這種結(jié)構(gòu)可以用于收集和濃縮孔2中的分析物微粒。圖17表示從孔2的開口端通過孔2并隨后通過凝膠7的液體流19的示意圖。如果凝膠7具有充分緊密的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，則懸浮于液體流19中的分析物微粒通過凝膠7被過濾。這種分析物微粒的例子是蛋白質(zhì)20、氨基酸、病毒、原生質(zhì)結(jié)構(gòu)，量子點(diǎn)、大熒光團(tuán)21、大電解質(zhì)陽離子、大電解質(zhì)陰離子和大氧化還原劑?？梢酝ㄟ^在形成時(shí)將微粒包含在凝膠7中從而降低凝膠7的滲透性。能夠穿過凝膠7的微粒的例子是水分子、小電解質(zhì)陽離子22、小電解質(zhì)陰離子23和小氧化還原劑。圖18表示孔2中聚集的分析物微粒的結(jié)果的示意圖。一旦孔2中有聚集的分析物微粒，則可停止液體流19。這時(shí)，分析物微粒會(huì)開始向外擴(kuò)散，最終騰空孔2。然后可恢復(fù)液體流19，重復(fù)聚集/擴(kuò)散的循環(huán)。可將微弱限制擴(kuò)散的凝膠放于孔2的出口，以使循環(huán)變得更好?？蓪⑽⑷跸拗茢U(kuò)散的凝膠放于孔中，以延長擴(kuò)散時(shí)間。擴(kuò)散時(shí)，孔2中的分析物微粒將具有與離子微粒交切的移動(dòng)通道。由于微?；ハ啻┻^，因此會(huì)圍繞彼此運(yùn)動(dòng)，從而降低離子微粒移動(dòng)通道的速度。這種速度降低取決于分析物微粒存在及其結(jié)合過程，因而形成了本方法的基礎(chǔ)。擴(kuò)散時(shí)，孔2中的分析物微粒在擴(kuò)散意外還由遷移力(例如，由電場產(chǎn)生的遷移力)軸向驅(qū)動(dòng)。這種過程適合于循環(huán)的聚集部分，而分析是通過額外的液體流19的力完成。在循環(huán)的擴(kuò)散或聚集部分，液體流19將被高頻軸向地?cái)[動(dòng)，用于更改微粒的移動(dòng)。例如，圖15中的球狀體14具有磁矩且被磁性地?cái)[動(dòng)以將分析物微粒泵抽穿過裂口 18。另外一個(gè)例子，圖9中的凝膠7的外(內(nèi))表面會(huì)受到壓力脈動(dòng)，使得分析物微粒在孔2中同樣地?cái)[動(dòng)。存在許多這樣的機(jī)制，即孔2在擴(kuò)散之外由力而被軸向驅(qū)動(dòng)。圖22示出了這些機(jī)制的一個(gè)例子。參考圖22，能夠穿過凝膠7的電解質(zhì)或氧化還原試劑通過工作電極(-W)、極板(C+)和參考電極(R)產(chǎn)生的電場而被移動(dòng)穿過凝膠7。在這些孔2中的微粒在擴(kuò)散之外還由力而被軸向驅(qū)動(dòng)的機(jī)制的每一個(gè)例子中，移動(dòng)通道本身可能通過幾種不同的機(jī)制被減速。一些這樣機(jī)制的例子示于圖27和圖28中。參考圖27，小電解質(zhì)陽離子22和小電解質(zhì)陰離子23可由電場而被在一條直線上移動(dòng)，如果路徑上沒有障礙物的話。然而，如果存在障礙物，例如分析物微粒20和分析物微粒27，則陰離子22和陰離子23將需要圍繞分析物微粒運(yùn)動(dòng)，降低離子軸向移動(dòng)的速度。如 果分析物微粒具有結(jié)合相互作用，則會(huì)形成大復(fù)合物28，導(dǎo)致離子軸向運(yùn)動(dòng)速度降低得更多。例如，典型的蛋白質(zhì)，例如牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)具有4nm x 4nmx 14nm的尺寸。使用TEPC濾紙I的50nm直徑的孔2，單獨(dú)的BSA蛋白會(huì)阻礙孔2的橫截面的很大一部分(0. 8%至2. 9%)，因而顯著降低離子微粒流的速度。參考圖28，障礙物29、30和31本身帶電荷。施加電場后，它們以復(fù)雜的方式與電解質(zhì)或氧化還原試劑的移動(dòng)相互影響。電解質(zhì)分子或氧化還原試劑移動(dòng)通過凝膠7，這種移動(dòng)取決于孔2中障礙物的性質(zhì)，提供了一種高敏感度的測量障礙物性質(zhì)的方法。圖31示出了應(yīng)用工作電極、極板和參考電極的電場。粒子微粒流將在電極中產(chǎn)生電流，且電流受到障礙物和凝膠7的阻抗，但是由于凝膠7的阻抗是相對不變的，因此可通過循環(huán)測定減去該阻抗。圖32示出了樣品載入狀態(tài)下的整個(gè)裝置。分析物微粒的液體流，例如從色譜柱32中洗提出的序列復(fù)雜的蛋白質(zhì)，被引導(dǎo)流入TEPC濾紙I的特定區(qū)域。在另一側(cè)施加較低的壓力使得溶劑和其他小分子通過TEPC濾紙I和凝膠7，使分析物微粒聚集在TEPC濾紙I的孔2中。由于分析物微粒從色譜柱32中洗提出來，因此TEPC濾紙I的表面以掃描的方式移動(dòng)。所洗提的不同分析物微粒被捕獲在TEPC濾紙I中空間上不同的位置。按照這樣的操作，可以對從色譜柱32中洗提的不同分析物微粒進(jìn)行第二次掃描，在TEPC濾紙I的區(qū)域上產(chǎn)生大量的特有二級混合物(其比例是可以控制的)。進(jìn)一步的掃描可以用來對孔2中的群增加更多的復(fù)雜性。這與用于降低蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)問題的“夾心陣列(Sandwich Array)”技術(shù)在功能上是等同的。還可以在孔2中使用液體膠束、膠體、固定材料或噬菌體抗體展示技術(shù)，使得留存的分析物微粒與環(huán)境發(fā)生相互作用。并且，還可以從一組孔2中提取出分析物微粒并添加到另一組孔2中。圖33示出了測量狀態(tài)的整個(gè)裝置。通過表面例如TEPC濾紙I的標(biāo)間，掃描電極33或多個(gè)電極，并測定電流。關(guān)于電極位置和電流的信息進(jìn)入電導(dǎo)率圖34中。這種電極結(jié)構(gòu)的例子包括由絕緣體包圍的暴露金屬表面，以及由到點(diǎn)液體填充的管。參考圖35，測量結(jié)果為一組基本一致的電導(dǎo)率圖34。大部分區(qū)域一致地具有導(dǎo)電性，例外是幾個(gè)具有明顯遷移障礙物(例如分析物微粒)的低導(dǎo)電性區(qū)域。這種低導(dǎo)電性區(qū)域的性質(zhì)與一致性的導(dǎo)電區(qū)域相關(guān)，是分析信號的基礎(chǔ)。參考圖33，對欲測區(qū)域的限制可以通過填充有導(dǎo)電液體的絕緣管來實(shí)現(xiàn)，絕緣管的一端與所述材料薄片物理接觸，將具有孔的絕緣薄片應(yīng)用于所述材料薄片的表面，或?qū)⒔^緣的與水不混溶的液體應(yīng)用于所述材料薄片的表面。在后者的情況下，在向TEPC濾紙I的凝膠側(cè)施壓后，孔中的水表面張力沿著TEPC濾紙I的另一個(gè)表面形成孤立的水性凸起，用填充有導(dǎo)電性液體的絕緣管進(jìn)行掃描。參考圖37，電導(dǎo)率通過存在蛋白質(zhì)的區(qū)域以及不存在蛋白質(zhì)的另一區(qū)域的時(shí)間函數(shù)進(jìn)行圖表化。啟動(dòng)電場E以后，蛋白質(zhì)的存在導(dǎo)致電流i級別的垂直(增加)變化，可以通過測量A電流i來量化。參考圖39，比較存在蛋白質(zhì)與不存在蛋白質(zhì)的理論結(jié)果。在循環(huán)中電場E重復(fù)被激活，得到重復(fù)的A電流i測量值。在更長的時(shí)間規(guī)模中，動(dòng)水壓P也在循環(huán)中重復(fù)啟動(dòng)。當(dāng)增加的壓力導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，則A電流增大。當(dāng)解除壓力，則蛋白質(zhì)向外擴(kuò)散，A電流減少。循環(huán)啟動(dòng)靜水壓使得得到一系列連續(xù)的△電流峰，求其平均值以用作蛋白質(zhì)存在的敏感度檢測。
參考圖41，比較蛋白質(zhì)結(jié)合存在的理論結(jié)果。與其他蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的位阻效應(yīng)，成為較大的障礙物且具有較低的擴(kuò)散速率；由此得到一系列連續(xù)的△電流i峰，其幅度較大。不與其他蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)具有較弱的位阻效應(yīng)，不會(huì)成為較大的障礙物且不會(huì)具有較低的擴(kuò)散速率；由此得到一系列連續(xù)的△電流峰，其幅度較小。注意到由于存在多重蛋白，因此會(huì)具有多個(gè)較小幅度的峰。圖43總結(jié)性示出了測量結(jié)果。通過測量得到穿過PETC濾紙I區(qū)域的分析物微粒性質(zhì)的圖。某區(qū)域38將具有執(zhí)行本方法的科學(xué)人員感興趣的測量性質(zhì)。對這些區(qū)域中內(nèi)容物的鑒定可以通過多種技術(shù)來進(jìn)行，例如質(zhì)譜，或者利用原始傳遞該內(nèi)容物的色譜系統(tǒng)的信息。通過使用相似的結(jié)構(gòu)，例如有孔的單層膜，來代替TEPC/凝膠結(jié)構(gòu)，會(huì)得到基本上相同的功能，其中擴(kuò)散時(shí)徑向的而不是軸向的。第二實(shí)施方式概述特別構(gòu)建的層狀材料形成一組裝載有多重空間分離的分析物顆粒的池，且所述多層材料用于熒光放射成像。結(jié)果得到多種分析物微粒的性質(zhì)的圖，能提供關(guān)于生物樣品的
有用信息。根據(jù)本發(fā)明第二實(shí)施方式的方法在根據(jù)本發(fā)明第二實(shí)施方式的方法中，有孔材料(例如TEPC濾紙)具有限制開口的孔。將受控基質(zhì)中的均勻或不均勻的分析物微粒群體載入TEPC濾紙的孔中，且使用熒光測量向外的擴(kuò)散，由此測量分析物微粒的存在、性質(zhì)及相互作用?，F(xiàn)結(jié)合圖I至圖43對本發(fā)明的方法進(jìn)行描述。參考圖1A、圖IB和圖2，TEPC濾紙I具有不均勻尺寸孔的隨機(jī)分布。圖IA示出了頂視圖，而圖IB示出了截面圖。TEPC濾紙I可能具有由羧酸鹽部分3化學(xué)衍生的外表面。也可以用其他具有相似性質(zhì)的材料代替。參考圖3、圖4和圖5，雙層材料可能通過以下過程形成，第一，均勻尺寸的球狀體4的稀釋懸浮物形成于凝膠前體(例如丙烯酰胺和融化的瓊脂糖)基質(zhì)中。然后將懸浮物施加到薄塑料片5上并包在光滑圓柱體6的周圍，光滑圓柱體6具有疏水表面。凝膠7通過化學(xué)、熱或光聚合形成?；瘜W(xué)聚合的例子示出圖4中。間隔微粒4使凝膠7具有均勻的已知厚度。聚合以后，薄塑料片5從光滑圓柱體6上剝?nèi)?，形成由凝膠7層和塑料5層組成的雙層材料8。這種雙層材料的放大圖示于圖5中；球狀體4沒有在該放大圖中示出，因?yàn)橐呀?jīng)充分稀釋。選擇雙層材料8的界面9的化學(xué)性質(zhì)，使得薄塑料片5層將來能夠容易地通過物理或化學(xué)手段除去。凝膠7的外表面可以化學(xué)衍生有氨基部分10，但是聚丙烯酰胺原位的。對于所述雙層材料，可替代地，將凝膠前體夾在兩個(gè)疏水平坦平板中間，允許聚合和干燥。這形成堅(jiān)固干燥的、可容易地處理的凝膠膜，然后當(dāng)使用時(shí)進(jìn)行水合。對于所述雙層材料，可替代 地，使用透析膜，該透析膜可以從很多提供商處購得，例如 Millipore 或 Whatman。參考圖6、圖7和圖8，雙層材料8可化學(xué)結(jié)合到TEPC濾紙I上。化學(xué)結(jié)合機(jī)制的例子示于圖6中，其中羧酸鹽部分和氨部分化學(xué)結(jié)合以形成肽鍵11。也可以由其他化學(xué)作用替代。圖7示出了 TEPC濾紙I和雙層材料8相接近，且羧酸鹽衍生表面3和氨衍生表面10彼此相對。圖8示出了 TEPC濾紙I和雙層材料8以肽鍵11化學(xué)結(jié)合在一起。參考圖8和圖9，薄塑料片5可以通過物理或化學(xué)手段被除去，僅剩下凝膠7層固定與TEPO濾紙I.對于化學(xué)結(jié)合，可替代地，凝膠7層和TEPC濾紙I可通過沒有化學(xué)鍵合的物理力簡單壓縮在一起，例如通過包住圓柱體周圍并拉緊外部TEPC濾紙I層。對于化學(xué)結(jié)合，可替代地，TEPC濾紙I可放置于傳導(dǎo)液體表面，其中傳導(dǎo)液體與含有分析物微粒基質(zhì)的液體不混溶。對于圖9所示的示意圖可以用多種變化，其例子示于圖10、圖11、圖12、圖13、圖14、圖15和圖16中。雖然本方法其余的部分主要講述圖9的簡單事例，但是應(yīng)當(dāng)理解這些變化都是可行的。參考圖10，凝膠7的外表面可用熒光團(tuán)12、表面活性劑13、其他材料或材料的任意組合進(jìn)行化學(xué)衍生。類似地，凝膠7的內(nèi)表面(面向孔2)或孔2的內(nèi)表面也可以進(jìn)行化學(xué)衍生。參考圖11、圖12和圖13，可在形成肽鍵11之前，使球狀體14暫位于孔2的開口中。該球狀體14可具有稍大于孔2直徑的直徑。凝膠7層可由于球狀體14的存在而凹回?？墒褂昧?6 (例如由磁場梯度、電場、重力場或動(dòng)水壓流產(chǎn)生)來將球狀體14從其在孔2開口的位置上提起，在球狀體14表面和孔2的開口之間制造出一個(gè)小縫隙17?？臻e體積15可通過短暫加熱球狀體14以熔化周圍的凝膠7來除去，或者通過用凝膠前體使之飽和并隨后進(jìn)行化學(xué)聚合。所產(chǎn)生的結(jié)果示于圖13中。參考圖14和圖15，孔2的兩端都用球狀體14蓋起。如果凝膠7足夠柔順，則其中一個(gè)球狀體14可通過例如由磁場梯度產(chǎn)生的力被除去。這將在凝膠7中留出一個(gè)小裂口18。這種特定的配置在沒有有效保留機(jī)制的情況下對于孔2中的材料保留將非常有用。參考圖16，可不使用凝膠，而將球狀體14通過例如由磁場梯度16產(chǎn)生的力固定在位置上。關(guān)于圖9的簡單實(shí)例，這種結(jié)構(gòu)可以用于收集和濃縮孔2中的分析物微粒。圖17表示從孔2的開口端通過孔2并隨后通過凝膠7的液體流19的示意圖。如果凝膠7具有充分緊密的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，則懸浮于液體流19中的分析物微粒通過凝膠7被過濾。這種分析物微粒的例子是蛋白質(zhì)20、氨基酸、病毒、原生質(zhì)結(jié)構(gòu)，量子點(diǎn)、大熒光團(tuán)21、大電解質(zhì)陽離子、大電解質(zhì)陰離子和大氧化還原劑?？梢酝ㄟ^在形成時(shí)將微粒包含在凝膠7中從而降低凝膠7的滲透性。能夠穿過凝膠7的微粒的例子是水分子、小電解質(zhì)陽離子22、小電解質(zhì)陰離子23和小氧化還原劑。圖18表示孔2中聚集的分析物微粒的結(jié)果的示意圖。一旦孔2中有聚集的分析物微粒，則可停止液體流19。這時(shí)，分析物微粒會(huì)開始向外擴(kuò)散，最終騰空孔2。然后可恢復(fù)液體流19，重復(fù)聚集/擴(kuò)散的循環(huán)?？蓪⑽⑷跸拗茢U(kuò)散的凝膠放于孔2的出口，以使循環(huán)變得更好。可將微弱限制擴(kuò)散的凝膠放于孔中，以延長擴(kuò)散時(shí)間。擴(kuò)散時(shí)，孔2中的分析物微粒將具有與離子微粒交切的移動(dòng)通道。由于微?；ハ啻┻^，因此會(huì)圍繞彼此運(yùn)動(dòng)，從而降低離子微粒移動(dòng)通道的速度。這種速度降低取決于分析物微粒存在及其結(jié)合過程，因而形成了本方法的基礎(chǔ)。擴(kuò)散時(shí)，孔2中的分析物微粒在擴(kuò)散意外還由遷移力(例如，由電場產(chǎn)生的遷移力) 軸向驅(qū)動(dòng)。這種過程適合于循環(huán)的聚集部分，而分析是通過額外的液體流19的力完成。在循環(huán)的擴(kuò)散或聚集部分，液體流19將被高頻軸向地?cái)[動(dòng)，用于更改微粒的移動(dòng)。例如，圖15中的球狀體14具有磁矩且被磁性地?cái)[動(dòng)以將分析物微粒泵抽穿過裂口 18。另外一個(gè)例子，圖9中的凝膠7的外(內(nèi))表面會(huì)受到壓力脈動(dòng)，使得分析物微粒在孔2中同樣地?cái)[動(dòng)。存在許多這樣的機(jī)制，即孔2在擴(kuò)散之外由力而被軸向驅(qū)動(dòng)。圖19、圖20、圖21和圖23示出了這些機(jī)制的一些例子。參考圖22，不能夠穿過凝膠7的熒光團(tuán)通過工作電極(-W)、極板(C+)和參考電極(R)產(chǎn)生的電場被朝向凝膠7移動(dòng)。參考圖20，不能夠穿過凝膠7的熒光團(tuán)通過磁場梯度被朝向(或遠(yuǎn)離)凝膠7移動(dòng)。參考圖21，不能夠穿過凝膠7的熒光團(tuán)通過重力場被朝向(或遠(yuǎn)離)凝膠7移動(dòng)。參考圖23，不能夠穿過凝膠7的大電解質(zhì)陽離子24和大電解質(zhì)陰離子25或氧化還原試劑通過電場被朝向(或遠(yuǎn)離)凝膠7內(nèi)表面和凝膠7外表面移動(dòng)，形成電容。電容器需要在圖24、圖25和圖26中進(jìn)行更多的描述。參考圖24，與孔2成軸向的電場具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。所述復(fù)雜的結(jié)構(gòu)與常規(guī)電化學(xué)研究中的存在于金屬電極附近的電極相類似。在遠(yuǎn)離凝膠7外表面的一定距離，在本體溶液中，電場繳械且不會(huì)明顯隨距離的變化而變化。接近凝膠7外表面時(shí)，電解質(zhì)表現(xiàn)出增大的濃度，使得電場呈指數(shù)提升；這通常稱為“古依-查普曼電層(Gouy-Chapman Layer)”。非常接近凝膠7外表面時(shí)，電解質(zhì)形成雙層交流電層；這通常稱為“赫姆霍茲層(HelmholtzLayer)”。繼續(xù)向上進(jìn)入凝膠7，電場降低。從凝膠7內(nèi)表面離開后，電場的結(jié)構(gòu)與外表面的結(jié)構(gòu)呈鏡像。參考圖25，凝膠7外表面的赫姆霍茲層中的強(qiáng)電場導(dǎo)致形成電荷，例如形成電子，且從電解質(zhì)(或合適的氧化還原試劑)陰離子(或陽離子)轉(zhuǎn)移到固定在表面的熒光團(tuán)12中。分子25轉(zhuǎn)移器電荷后,成為另一個(gè)分子26.突光團(tuán)12的突光特性由于電荷轉(zhuǎn)移而發(fā)生改變。例如不帶電狀態(tài)下熒光素是非熒光性的，但是當(dāng)帶負(fù)電后，具有強(qiáng)熒光性。在這些孔2中的微粒在擴(kuò)散之外還由力而被軸向驅(qū)動(dòng)的機(jī)制的每一個(gè)例子中，移動(dòng)通道本身可能通過幾種不同的機(jī)制被減速。一些這樣機(jī)制的例子示于圖26、圖27和圖28中。參考圖26,突光團(tuán)21可通過遷移力(例如來自電場、磁場梯度或重力場)而被在一條直線上移動(dòng)，如果路徑上沒有障礙物的話。然而，如果存在障礙物，例如分析物微粒20和分析物微粒27，則陰離子22和陰離子23將需要圍繞分析物微粒運(yùn)動(dòng)，降低熒光團(tuán)軸向移動(dòng)的速度。如果分析物微粒具有結(jié)合相互作用，則會(huì)形成大復(fù)合物28，導(dǎo)致熒光團(tuán)軸向運(yùn)動(dòng)速度降低得更多。例如，典型的蛋白質(zhì)，例如牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)具有4nm x 4nmx 14nm的尺寸。使用TEPC濾紙I的50nm直徑的孔2,單獨(dú)的BSA蛋白會(huì)阻礙孔2的橫截面的很大一部分(0. 8%至2. 9%)，因而顯著降低熒光團(tuán)流的速度。參考圖27，大電解質(zhì)陽離子24和大電解質(zhì)陰離子25可由電場而被在一條直線上移動(dòng)，如果路徑上沒有障礙物的話。然而，如果存在障礙物，例如分析物微粒20和分析物微粒27，則陰離子22和陰離子23將需要圍繞分析物微粒運(yùn)動(dòng)，降低離子軸向移動(dòng)的速度。如果分析物微粒具有結(jié)合相互作用，則會(huì)形成大復(fù)合物28，導(dǎo)致離子軸向運(yùn)動(dòng)速度降低得更多。 參考圖28，障礙物29、30和31本身帶電荷。施加電場后，它們以復(fù)雜的方式與電解質(zhì)或氧化還原試劑的移動(dòng)相互影響。凝膠附近的熒光團(tuán)的聚集或活化，取決于孔2中的障礙物的性質(zhì)，提供了一種高敏感度的測量障礙物性質(zhì)的方法。圖29和圖30示出了對熒光團(tuán)使用紫外光，以及所得的放射可見光。放射可見光的強(qiáng)度取決于凝集7附近活化的熒光團(tuán)的濃度。位于距離孔2 —定距離的不會(huì)發(fā)出熒光，因?yàn)門EPC濾紙I的聚碳酸酯材料較強(qiáng)地吸收紫外光。注意到雖然本方法的主要優(yōu)點(diǎn)在于避免用熒光團(tuán)標(biāo)記分析物微粒，但是標(biāo)記有熒光團(tuán)的分析物微粒也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。圖32示出了樣品載入狀態(tài)下的整個(gè)裝置。分析物的液體流，例如從色譜柱32中洗提出的序列復(fù)雜的蛋白質(zhì)，被引導(dǎo)流入TEPC濾紙I的特定區(qū)域。在另一側(cè)施加較低的壓力使得溶劑和其他小分子通過TEPC濾紙I和凝膠7，使分析物微粒聚集在TEPC濾紙I的孔2中。由于分析物微粒從色譜柱32中洗提出來，因此TEPC濾紙I的表面以掃描的方式移動(dòng)。所洗提的不同分析物微粒被捕獲在TEPC濾紙I中空間上不同的位置。按照這樣的操作，可以對從色譜柱32中洗提的不同分析物微粒進(jìn)行第二次掃描，在TEPC濾紙I的區(qū)域上產(chǎn)生大量的特有二級混合物(其比例是可以控制的)。進(jìn)一步的掃描可以用來對孔2中的群增加更多的復(fù)雜性。這與用于降低蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)問題的“夾心陣列(Sandwich Array)”技術(shù)在功能上是等同的。還可以在孔2中使用液體膠束、膠體、固定材料或噬菌體抗體展示技術(shù)，使得留存的分析物微粒與環(huán)境發(fā)生相互作用。并且，還可以從一組孔2中提取出分析物微粒并添加到另一組孔2中。圖34示出了測量狀態(tài)的整個(gè)裝置。將一束熒光激發(fā)光，例如紫外光，引導(dǎo)向表面例如凝膠7的表面。通過鏡片35或光導(dǎo)管、以及光敏器件例如數(shù)碼相機(jī)，來收集熒光激發(fā)光例如紫外光。在照片影像37中有來自相機(jī)的信息。參考圖36，當(dāng)施加了遷移力(例如來自電場、磁場梯度或重力場)時(shí)測量結(jié)果為一系列變化中的照片影像37。起初，照片影像相對較暗。短暫時(shí)間過后，大部分區(qū)域發(fā)出熒光，除了幾個(gè)具有明顯遷移障礙物(例如分析物微粒)的延遲區(qū)域。然而馬上，隨著這些延遲區(qū)域也完成遷移，影像的而整個(gè)區(qū)域均勻發(fā)出熒光。這種延遲區(qū)域的暫時(shí)性性質(zhì)與為非延遲區(qū)域相關(guān)，是分析信號的基礎(chǔ)。參考圖38，熒光通過存在蛋白質(zhì)的區(qū)域以及不存在蛋白質(zhì)的另一區(qū)域的時(shí)間函數(shù)進(jìn)行圖表化。啟動(dòng)電場E以后，蛋白質(zhì)的存在導(dǎo)致電流i級別的垂直(增加)變化，可以通過測量A電流i來量化。參考圖40，比較存在蛋白質(zhì)與不存在蛋白質(zhì)的理論結(jié)果。在循環(huán)中電場E重復(fù)被激活，得到重復(fù)的A電流i測量值。在更長的時(shí)間規(guī)模中，動(dòng)水壓P也在循環(huán)中重復(fù)啟動(dòng)。當(dāng)增加的壓力導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，則A電流增大。當(dāng)解除壓力，則蛋白質(zhì)向外擴(kuò)散，A電流減少。循環(huán)啟動(dòng)靜水壓使得得到一系列連續(xù)的△電流峰，求其平均值以用作蛋白質(zhì)存在的敏感度檢測。參考圖42，比較蛋白質(zhì)結(jié)合存在的理論結(jié)果。與其他蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的位阻效應(yīng)，成為較大的障礙物且具有較低的擴(kuò)散速率；由此得到一系列連續(xù)的△電流i峰，其幅度較大。不與其他蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)具有較弱的位阻效應(yīng)，不會(huì)成為較大的障·礙物且不會(huì)具有較低的擴(kuò)散速率；由此得到一系列連續(xù)的△電流峰，其幅度較小。注意到由于存在多重蛋白，因此會(huì)具有多個(gè)較小幅度的峰。圖43總結(jié)性示出了測量結(jié)果。通過測量得到穿過PETC濾紙I區(qū)域的分析物微粒性質(zhì)的圖。某區(qū)域38將具有執(zhí)行本方法的科學(xué)人員感興趣的測量性質(zhì)。對這些區(qū)域中內(nèi)容物的鑒定可以通過多種技術(shù)來進(jìn)行，例如質(zhì)譜，或者利用原始傳遞該內(nèi)容物的色譜系統(tǒng)的信息。通過使用相似的結(jié)構(gòu)，例如有孔的單層膜，來代替TEPC/凝膠結(jié)構(gòu)，會(huì)得到基本上相同的功能，其中擴(kuò)散時(shí)徑向的而不是軸向的。第三實(shí)施方式概述特別構(gòu)建的層狀材料形成一組裝載有多重空間分離的分析物顆粒的池，且所述多層材料做質(zhì)譜取樣。結(jié)果得到多種分析物微粒的混合物的圖，能提供關(guān)于生物樣品的有用信息。根據(jù)本發(fā)明第三實(shí)施方式的方法在根據(jù)本發(fā)明第三實(shí)施方式的方法中，TEPC濾紙(或功能性等同的結(jié)構(gòu))的孔具有限制的開口。將受控基質(zhì)中的均勻或不均勻的分析物微粒群體載入TEPC濾紙的孔中，且孔的末端由球狀體以力量緊緊蓋住。將組件載入真空腔室中，照射激光束，并將所得的蒸汽導(dǎo)入到質(zhì)譜腔中。通過離子化和質(zhì)荷比檢測來鑒定分析物微?！，F(xiàn)結(jié)合圖44至圖48對本發(fā)明的方法進(jìn)行描述。參考圖44，通過在孔2每一端放置一個(gè)球狀體14，將分析物微粒20、22和23的混合物裝入TEPC濾紙I的孔2中。參考圖45和圖46，將TEPC濾紙I在兩個(gè)平坦的輥之間壓緊產(chǎn)生力39，使得每個(gè)球狀體14堵塞孔2的兩端。然后將TEPC濾紙I從預(yù)備裝置移除，得到圖16所示的包含分析物微粒的穩(wěn)定材料。參考圖47，將穩(wěn)定材料放入真空室中。通過阻塞孔2且密封水性基質(zhì)的球狀體14，從而在真空下保護(hù)孔2中含有分析物微粒的水性基質(zhì)。通過薄聚合物膜外衣進(jìn)一步進(jìn)行密封。然后將強(qiáng)烈的、聚焦的激光束40引導(dǎo)入孔2中。
參考圖48，激光束將使TEPC濾紙I的孔2的上部阻塞物汽化，導(dǎo)致水性基質(zhì)向外暴露在真空中，分散成氣體。這與基質(zhì)輔助激光解析電離(Matrix-Assisted LaserDesorption Ionization, MALDI)分析相類似。然而，生物樣品受到的熱壓要小得多，得到復(fù)雜性較低的裂解譜。這種復(fù)雜性降低在分析上是有用的?？偨Y(jié)本方法的范圍囊括檢測、表征和鑒定分析物微粒，以及利用納米級別的池的性質(zhì)來表征它們之間的相互作用。本方法用于執(zhí)行這樣的任務(wù)，這些任務(wù)中存在各種不足，例如受到標(biāo)記技術(shù)和交叉反應(yīng)的干擾。本方法消除了這些不足。并且，本方法在分析極低濃度的分析物微粒時(shí)極為有用。本方法特別有用的領(lǐng)域是生物技術(shù)，用于測量蛋白質(zhì)相互作用。每個(gè)生物系統(tǒng)中都使用極大量的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)依賴許許多多因子而相互作用成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。疾 病會(huì)擾亂這些工作，添加和去除其中成分和相互作用途徑。理解這些系統(tǒng)能夠?qū)膊∵M(jìn)行早期診斷，并提供了一種通過藥物治療的化學(xué)修復(fù)方式。人們研究了這些系統(tǒng)中最為大量和穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，但是尚需要更多的研究。為醫(yī)藥研究者們增加新且有用的手段，例如本發(fā)明的方法，將會(huì)加深對蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的理解，并使得能夠發(fā)展處新的藥物療法。本文中所使用的術(shù)語“微?！卑ǚ肿?、細(xì)胞、多細(xì)胞結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞組分、病毒、朊病毒、蛋白質(zhì)、聚合物、離子、膠體和熒光團(tuán)。微粒可以懸浮或溶解。微粒不必須是生物相關(guān)微粒。本文中所使用的術(shù)語“分析物”是指欲測的微粒。本文中所使用的術(shù)語“凝膠”并不限于其嚴(yán)格的技術(shù)定義，而是也一般地包括與限制分析物微粒擴(kuò)散相關(guān)的任何材料。術(shù)語“凝膠”意向包括但不限于，明膠、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、滲透性聚合物、滲透性共聚物、淀粉、氣凝膠、火棉膠、透析膜、不混溶液體、以上所列任一種材料的化學(xué)改性形式、嵌入有微粒的以上所列任一種材料、及以上所列材料的組合。本文中所使用的術(shù)語“不混溶液體”包括與分析物微?；|(zhì)不混溶的液體。本文中所使用的術(shù)語“較大”用來描述不能通過TEPC濾紙孔末端限制的微粒，例如通過凝膠限制。本文中所使用的術(shù)語“較小”用來描述能夠通過TEPC濾紙孔末端限制的微粒，例如通過凝膠限制。本文中所使用的術(shù)語“力”包括由電場產(chǎn)生的力、由磁場梯度產(chǎn)生的力、由重力場產(chǎn)生的力、向心力、離心力、由動(dòng)水壓產(chǎn)生的力、由靜水壓產(chǎn)生的力、或者這些力的組合。電場可以電容性生成，與離子或氧化還原物沒有直接的電極接觸?？梢允褂枚嘟M電極來實(shí)現(xiàn)所需的電場。例如，可以使用一組電極來發(fā)生強(qiáng)遷移力，通過使用另一組電極來測量分析物微粒。對電流的測量可以針對恒定的電阻、電導(dǎo)率、阻抗、電容、感應(yīng)系數(shù)或其組合來測量。例如可以通過測量電容來幫助表征類脂微泡(Lipid Micelle)、整個(gè)細(xì)胞、或具有阻抗邊界的其他材料；再例如通過測量感應(yīng)系數(shù)來幫助表征手性分析物?？梢酝ㄟ^完整細(xì)胞的原位破裂或其他技術(shù)，以及標(biāo)準(zhǔn)色譜技術(shù)，將分析物微粒傳遞到裝置中。
所述TEPC材料或其功能等價(jià)物中的孔或眼，其尺寸可以設(shè)為緊密配合單獨(dú)的細(xì)胞，因而電阻抗和電容很大程度上由細(xì)胞本體決定。 本發(fā)明所述的方法可以與傳統(tǒng)的微通道陣列技術(shù)(MicroChannel Arraytechnology)、即通常所謂的“芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on_a-Chip)”技術(shù)相結(jié)合。 雖然參照某些優(yōu)選實(shí)施方式來描述本發(fā)明，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到， 在本發(fā)明的權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)，可以進(jìn)行其他增添、刪除、替代、改變或改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測分析物微粒的存在、性質(zhì)及相互作用的方法，其包括 a.提供具有多個(gè)通孔的片材料構(gòu)成的薄片，所述通孔具有基本上相近的直徑； b.在所述材料的至少一個(gè)面上，限制所述孔的開口； c.將分析物微粒插入到所述孔的子群中； d.施加電場，貫通含有所述分析物微粒的所述通孔； e.測量電流隨時(shí)間的變化，所述變化指示出所述分析物微粒的擴(kuò)散速率；并且 其中，所述分析物微粒的所述擴(kuò)散速率提供了對所述分析物微粒的存在、性質(zhì)及相互作用的測量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述片材料包括具有選自由以下所組成的組中的性質(zhì)的材料基本上電絕緣；基本上化學(xué)惰性；厚度在500nm至IOOOOOOnm的范圍內(nèi)；厚度在Inm至IOcm的范圍內(nèi)；所述通孔的直徑為IOnm至5000nm ;所述通孔的直徑為Inm至Icm ;所述通孔具有化學(xué)衍生的內(nèi)表面；具有化學(xué)衍生的外表面；所述通孔由凝膠填充。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述片材料選自由下列所組成的組中聚碳酸酯；徑跡蝕刻的聚碳酸酯；制有多個(gè)孔的聚合物；化學(xué)蝕刻有多個(gè)孔的聚合物；制有多個(gè)孔的玻璃；化學(xué)蝕刻有多個(gè)孔的玻璃；有孔的聚合物薄膜；有孔的單層薄膜；有孔的多層薄膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述方法包括利用與所述片材料的表面接觸的凝膠層，來限制所述孔的開口。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述凝膠選自由下列所組成的組中明膠；瓊脂糖；聚丙烯酰胺；聚丙烯酸酯；滲透性聚合物；滲透性共聚物；淀粉；氣凝膠；火棉膠；透析膜；與所述分析物微粒基質(zhì)不混溶的液體；以上所列任一種材料的化學(xué)改性形式；嵌入有微粒的以上所列任一種材料；及它們的組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述方法包括使用基本上的球狀體限制所述孔的開口，所述基本上的球狀體具有足夠大的直徑以導(dǎo)致基本上限制通過所述通孔的液體流；通過選自由下列所組成的組中的方式，使所述基本上的球狀體保持在基本上固定的位置上施加電場；施加磁場梯度；施加重力場；施加向心力；施加離心力；施加動(dòng)水壓；施加靜水壓；化學(xué)鍵；以及使用凝膠基質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述方法進(jìn)一步包括從所述凝膠基質(zhì)上移除所述球狀體。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述方法包括使用安培計(jì)來測量所述電流，所述安培計(jì)能夠以對于被測的擴(kuò)散速率足夠大的速率，測量通過所述薄片的選定區(qū)域的電流。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述選定區(qū)域是由選自由下列所組成的組中的方式來選定絕緣管，所述絕緣管的一端與所述片材料物理接觸；具有孔的絕緣片，所述絕緣片應(yīng)用于所述片材料的表面；以及絕緣的、與水不混溶的液體，所述液體應(yīng)用于所述片材料的表面。
10.一種用于檢測分析物微粒的存在、性質(zhì)及相互作用的方法，其包括 a.提供具有多個(gè)通孔的片材料，所述通孔具有基本上相近的直徑； b.在所述材料的至少一個(gè)面上，限制所述孔的開口； c.將分析物微粒插入到所述孔的子群中；d.傳遞遷移力，軸向上貫通含有所述分析物微粒的所述通孔； e.測量熒光隨時(shí)間的變化，所述變化指示出所述分析物微粒的擴(kuò)散速率；并且 其中，通過所述分析物微粒的所述擴(kuò)散速率提供了對所述分析物微粒的存在、性質(zhì)及相互作用的測量。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述片材料包括具有選由自以下所組成的組中的性質(zhì)的材料基本上電絕緣；基本上化學(xué)惰性；厚度在500nm至IOOOOOOnm的范圍內(nèi)；厚度在Inm至IOcm的范圍內(nèi)；所述通孔的直徑為IOnm至5000nm ;所述通孔的直徑為Inm至Icm ;所述通孔具有化學(xué)衍生的內(nèi)表面；具有化學(xué)衍生的外表面；所述通孔由凝膠填充。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述片材料選自由下列所組成的組中聚碳酸酯；徑跡蝕刻的聚碳酸酯；制有多個(gè)孔的聚合物；化學(xué)蝕刻有多個(gè)孔的聚合物；制有多個(gè)孔的玻璃；化學(xué)蝕刻有多個(gè)孔的玻璃；有孔的聚合物薄膜；有孔的單層薄膜；有孔的多層薄膜。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述方法包括利用與所述片材料的表面接觸的凝膠層，來限制所述孔的開口。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述凝膠選自由下列所組成的組中明膠；瓊脂糖；聚丙烯酰胺；聚丙烯酸酯；滲透性聚合物；滲透性共聚物；淀粉；氣凝膠；火棉膠；透析膜；與所述分析物微?；|(zhì)不混溶的液體；以上所列任一種材料的化學(xué)改性形式；嵌入有微粒的以上所列任一種材料；及它們的組合。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述方法包括使用球狀體限制所述孔的開口，所述球狀體具有足夠大的直徑以導(dǎo)致基本上限制通過所述通孔的液體流；通過選自由下列所組成的組中的方式，使所述球狀體保持在應(yīng)保持的位置上施加電場；施加磁場梯度；施加重力場；施加向心力；施加離心力；施加動(dòng)水壓；施加靜水壓；化學(xué)鍵；以及使用凝月父基質(zhì)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述方法進(jìn)一步包括從所述凝膠基質(zhì)上移除所述球狀體。
17.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述遷移力選自由下列所組成的組中由電場產(chǎn)生的力；由磁場梯度產(chǎn)生的力；由重力場產(chǎn)生的力；向心力；離心力；由動(dòng)水壓產(chǎn)生的力；由靜水壓產(chǎn)生的力；及它們的組合。
18.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述熒光由測光系統(tǒng)測得，所述測光系統(tǒng)能夠以對于被測的擴(kuò)散速率足夠大的速率，測量所述薄片的選定區(qū)域的熒光。
19.一種用于鑒定分析物微粒的方法，其包括 a.提供具有多個(gè)通孔的片材料，所述通孔具有基本上相近的直徑； b.在所述材料的至少一個(gè)面上，限制所述孔的開口； c.將分析物微粒插入到所述孔的子群中； d.基本上關(guān)閉所述孔的開口； e.將所述片材料插入到質(zhì)譜儀中； f.燒蝕所述片材料的選定區(qū)域； g.使燒蝕所得的產(chǎn)物離子化； h.測量所得離子的質(zhì)荷比；并且其中，所述質(zhì)荷比提供用于鑒定所述分析物微粒的方式。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述方法包括通過將球狀體壓進(jìn)所述孔的開口的入口，以致基本上關(guān)閉所述開口，從而限制所述孔的開口。
全文摘要
用于檢測生物相關(guān)分子的方法，其包括將所述分子集中到化學(xué)惰性片材料中的顯微的孔內(nèi)；限制所述孔的開口；并且測量流過所述孔的電流或所述孔的開口附近的熒光。隨著所述分子擴(kuò)散到所述孔外，所述電流或熒光將發(fā)生改變；提供擴(kuò)散速率的測量值，從而檢測所述分子的存在以及所述分子的性質(zhì)。對于相互作用的分子而言，所述擴(kuò)散速率將慢于不相互作用的分子的擴(kuò)散速率，從而得出對所述分子的相互作用的確定。蓋上所有孔，插入到質(zhì)譜儀中，允許對所述分子進(jìn)行鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK102762746SQ201180007918
公開日2012年10月31日 申請日期2011年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月23日
發(fā)明者克里斯托弗·戈登·阿特伍德 申請人:克里斯托弗·戈登·阿特伍德