專利名稱：：包含生物活性材料的干燥玻璃質(zhì)組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在苛刻的儲(chǔ)存和使用條件下穩(wěn)定和保護(hù)生物材料，更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及將生物活性材料和生物制品包括活細(xì)菌包埋在無(wú)定形玻璃質(zhì)基質(zhì)的保護(hù)性制劑中。
背景技術(shù)：
：冷凍干燥在傳統(tǒng)上是保存敏感性生物物質(zhì)例如活或死細(xì)菌和病毒以及蛋白質(zhì)的最常用方法，而其他方法例如噴霧干燥、流化噴霧干燥和干燥法一般不適合。在這些方法中使用的高干燥溫度引起對(duì)生物活性材料本身的顯著傷害。此外，它們不能將材料充分干燥至產(chǎn)物穩(wěn)定性所需的特定的殘余水分或水活度，因此可能需要通過(guò)其他手段進(jìn)行的附加干燥步驟。常規(guī)的冷凍干燥方法典型地包括將含有生物活性材料的溶液冷凍，以及將冷凍的生物材料在完全真空下、在保持冷凍的同時(shí)凍干。冷凍干燥方法的低溫減少了生物活性材料的降解反應(yīng)，并使最終干燥形式中的活性損失降至最低。通常，由于在緩慢干燥過(guò)程期間形成冰晶，冷凍干燥方法往往引起生物活性材料的顯著活性損失和損傷。此外，冷凍步驟本身如果不能正確執(zhí)行，也能使生物活性材料變性或失活。通過(guò)向生物活性物質(zhì)溶液加入低溫保護(hù)劑可以在一定程度上避開(kāi)由冰晶結(jié)構(gòu)的形成所引起的損傷(Morgan等，2006)。這樣的保護(hù)劑是高度可溶的化學(xué)物質(zhì)，其被添加到制劑中以在冷凍期間保護(hù)細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)，并提高儲(chǔ)存期間的穩(wěn)定性。常用于活細(xì)菌和病毒的穩(wěn)定劑包括相對(duì)于細(xì)胞物質(zhì)或生物活性物質(zhì)來(lái)說(shuō)高濃度的高糖，例如蔗糖、甘油或山梨糖醇(Morgan等，2006;CapeIa等，2006)。然而，這樣的保護(hù)劑可能不能足夠地穿透到細(xì)胞內(nèi)以保護(hù)細(xì)胞內(nèi)體積中的活性組分，這可能引起冷凍干燥物質(zhì)在儲(chǔ)存后的不穩(wěn)定性。因此，有膜生物材料例如病毒、細(xì)菌和細(xì)胞在冷凍干燥過(guò)程中不能良好存活。因此，對(duì)于開(kāi)發(fā)能夠使干燥損失最小化并同時(shí)獲得干燥后材料足夠的儲(chǔ)存穩(wěn)定性的最優(yōu)干燥方法和制劑來(lái)說(shuō)，仍存在顯著的挑戰(zhàn)。通過(guò)使用某些制劑與在玻璃態(tài)、特別是糖玻璃中進(jìn)行真空干燥的組合已解決了與冷凍干燥相關(guān)的ー些問(wèn)題(美國(guó)專利6，190，701)。干燥的穩(wěn)定化生物活性材料在玻璃質(zhì)基質(zhì)中受到保護(hù)以對(duì)抗不利環(huán)境例如高的溫度和濕度。一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)玻璃形成而進(jìn)行的穩(wěn)定化，從濃縮含有生物活性分子的糖溶液以形成超飽和糖漿開(kāi)始。進(jìn)ー步去除水使糖漿逐漸固化，最終轉(zhuǎn)變成殘余水含量低的固體糖玻璃。在玻璃中的化學(xué)擴(kuò)散是可以忽略不計(jì)的，因此化學(xué)反應(yīng)事實(shí)上停止。由于變性或膜損壞是化學(xué)變化，它們不能在玻璃中發(fā)生，因此生物活性材料被穩(wěn)定化并受到保護(hù)。許多玻璃由于在儲(chǔ)存期間與生物活性材料反應(yīng)，因此不能執(zhí)行穩(wěn)定化。使用還原糖時(shí)出現(xiàn)明顯問(wèn)題，所述還原糖可以形成良好的物理玻璃，然而它們的醛基在典型的美拉德(Maillard)反應(yīng)中攻擊生物活性物質(zhì)上的氨基基團(tuán)，而非反應(yīng)性糖類提供穩(wěn)定的完全不需要冷藏的產(chǎn)物。由于糖類的固有吸濕性，超飽和糖漿的除水和最終干燥變得極為困難。(Annear1962)首先解決了這ー缺點(diǎn)，其開(kāi)發(fā)了在糖類和氨基酸的溶液中含有細(xì)菌的制劑以及涉及濃縮糖漿的沸騰和泡沫形成的真空干燥方法。Roser等(美國(guó)專利6，964，771)公開(kāi)了通過(guò)泡沫形成進(jìn)行干燥的類似概念，所述概念包括蒸發(fā)掉大部分溶劑的濃縮步驟，隨后在真空下對(duì)濃縮的糖漿進(jìn)行沸騰和發(fā)泡。為了減輕在沸騰步驟中可能發(fā)生的氧化和變性損傷，Bronshtein(美國(guó)專利5，766，520,7,153，472)介紹了含有糖類和表面活性劑的改進(jìn)的保護(hù)性劑型。保護(hù)性溶液的干燥也包括在中度真空下濃縮，然后施加強(qiáng)真空以使剩余的水起泡沸騰，從而形成干燥的穩(wěn)定泡沫的逐步過(guò)程。為了避開(kāi)沸騰步驟，Busson和Schroeder(美國(guó)專利No.6，534，087)介紹了適用于敏感性生物活性材料的制劑的液態(tài)干燥方法，并在高于30ΤΟ1Γ的非常溫和的真空壓カ下使用真空烘箱。在不便材料沸騰的條件下獲得一定干燥水平后，供熱至高于20°C，并在僅僅幾小時(shí)后就收獲了干燥的材料。生物活性物質(zhì)溶液在整個(gè)干燥過(guò)程期間被維持在液態(tài)中的這種類型的干燥方法，具有由于液體在沸騰期間蒸發(fā)和發(fā)泡表面所表現(xiàn)出的表面積增加而造成的干燥更快的優(yōu)點(diǎn)。然而，沸騰和發(fā)泡需要輸入顯著熱量來(lái)提供必需的溶液噴發(fā)。這樣的干燥方法不能良好適用于敏感性生物物質(zhì)例如活病毒、細(xì)胞或細(xì)菌的干燥，這是由于施加的熱加速了酶促降解(例如蛋白質(zhì)水解)和化學(xué)氧化(例如氧化和自由基攻擊)，其可能破壞生物材料的活性或存活力。上面描述的干燥方法在其被放大至大型エ業(yè)過(guò)程的能力方面也是有限的。避免冷凍要求在比常規(guī)冷凍干燥或噴霧冷凍干燥過(guò)程循環(huán)中更低的真空度O7T0RR)下執(zhí)行過(guò)程。上述方法的最顯著的缺點(diǎn)是不能控制并限制容器、托盤或小瓶中泡沫的膨脹。這種無(wú)法控制的噴發(fā)和往往過(guò)度的泡沫形成使得在實(shí)踐上不能開(kāi)發(fā)出エ業(yè)規(guī)模的方法。沸騰步驟的噴發(fā)和發(fā)泡性質(zhì)導(dǎo)致一部分材料濺射到容器壁上并進(jìn)入干燥室中。為了緩和沸騰期間的噴發(fā)，Bronshtein(美國(guó)專利6，884，866,6,306,345)提出了特殊的干燥室和受控的溫度/壓力施加方案，所述溫度/壓カ施加方案將過(guò)度加熱減低至可接受的程度。包含噴發(fā)和過(guò)度發(fā)泡的另ー種方法被描述在美國(guó)專利公布No.2008/0229609中，在所述方法中將生物活性物質(zhì)溶液封裝在覆蓋有透氣膜的容器或袋子中。同樣地，難以在エ業(yè)規(guī)模上實(shí)現(xiàn)這些方案，它們需要特殊的設(shè)備并且難以使用不同制劑可靠地重復(fù)。正如本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的，干燥泡沫方法不能特別良好地適用于保存有膜生物材料例如脂質(zhì)體、病毒或活細(xì)胞和細(xì)菌。脂質(zhì)膜通常阻止保護(hù)劑透入到所包圍的體積中，或阻止從所包圍的體積中除去足夠的水。在保護(hù)劑沒(méi)有足夠透入的情況下，酶促過(guò)程例如蛋白質(zhì)水解和化學(xué)過(guò)程例如氧化和自由基攻擊，可以破壞有膜生物材料的活性或存活力。殘留在膜包圍的體積中的低滲流體可以助長(zhǎng)生物材料的不穩(wěn)定性。Truong-le,Vu(美國(guó)專利7，381，425)描述了適合于有膜生物活性物質(zhì)的冷凍干燥方法。該發(fā)明的組合物包括多元醇和有膜生物活性材料。干燥方法從將制劑冷卻至接近脂質(zhì)膜的相轉(zhuǎn)變溫度的溫度開(kāi)始，降低制劑上的壓カ以形成穩(wěn)定泡沫，將泡沫冷凍，然后使水從冷凍的泡沫升華以提供凍干的干燥泡沫組合物?？梢圆捎氓思?jí)干燥條件來(lái)進(jìn)ー步干燥泡沫。對(duì)于能夠在玻璃態(tài)中干燥而不沸騰和過(guò)度發(fā)泡的適合的保護(hù)性制劑，仍存在需求。特別是對(duì)于也適合于制藥エ業(yè)之外的應(yīng)用例如食品和農(nóng)業(yè)エ業(yè)的成本效益高的制劑和可放大的干燥方法，存在著需求。為了提供足夠的干燥而不暴露于高溫，需要保護(hù)性制劑和溫和的干燥過(guò)程。需要能夠在高的溫度和濕度條件下的儲(chǔ)存中保護(hù)這些生物物質(zhì)的組合物。如下所述，本發(fā)明為所有這些挑戰(zhàn)提供了解決方案。本發(fā)明的脫水方法非常溫和，并且不將活性試劑暴露于沸騰或發(fā)泡中，因此與使樣品經(jīng)受這些脅迫中的ー種或兩種的常規(guī)冷凍干燥和泡沫干燥技術(shù)相比，具有優(yōu)勢(shì)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明包括用于在儲(chǔ)存中保存敏感性生物活性材料的組合物和干燥方法，所述敏感性生物活性材料例如肽、蛋白質(zhì)、酶、激素、維生素、類胡蘿卜素、礦物質(zhì)、藥物、抗生素、殺微生物劑、殺真菌劑、除草剤、殺蟲(chóng)劑、殺精子劑、核酸、抗體、疫苗、細(xì)菌(益生菌或其他細(xì)菌)、病毒和/或細(xì)胞懸液。所述干燥方法提供了用于干燥包含生物活性材料、基質(zhì)形成劑和玻璃形成劑的制劑的方法。通過(guò)將所有固體組分和生物活性材料分散在溶液中來(lái)制備所述制劑。利用本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的手段例如液氮或干冰將所述溶液快速冷凍，以形成小珠、串或小滴形式的無(wú)定形組合物。冷凍粒子可以儲(chǔ)存在低溫冰箱(在-30°C和-80°c之間)中直至干燥，或以冷凍的無(wú)定形狀態(tài)立即置于托盤上用于在常規(guī)冷凍干燥器中液體干燥。干燥方法從在低于2000mT0RR的真空壓カ下對(duì)冷凍粒子進(jìn)行短時(shí)間驅(qū)氣和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化步驟開(kāi)始，然后在高于2000mT0RR的真空壓カ和所需溫度下進(jìn)行初級(jí)干燥步驟。在玻璃質(zhì)無(wú)定形材料的ニ級(jí)和最后干燥步驟期間，使用完全真空壓カ和升高的溫度以獲得所需的干燥材料的最終水活度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑包含足夠量的基質(zhì)形成劑，其中包埋了生物活性材料。適合的基質(zhì)形成劑的實(shí)例包括但不限于こ酸鄰苯ニ甲酸纖維素(CAP)、羧甲基纖維素、果膠、藻酸鈉、藻酸的鹽、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、甲基纖維素、卡拉膠、瓜爾膠、阿拉伯膠、黃原膠、刺槐豆膠、殼聚糖和殼聚糖衍生物、膠原、聚こ醇酸、淀粉和改性淀粉、環(huán)糊精和寡糖(菊粉、麥芽糖糊精、葡聚糖等)，及其組合。在ー個(gè)特定實(shí)施方案中，優(yōu)選的基質(zhì)形成劑是藻酸鈉。優(yōu)選情況下，以干物質(zhì)總重量的百分?jǐn)?shù)計(jì)，所述制劑包含O.1-20%、更優(yōu)選1-12%。在其他實(shí)施方案中，基質(zhì)形成劑包含藻酸鈉與寡糖的混合物，其中藻酸鈉/寡糖的重量比為1:1-10、更優(yōu)選為1:1-5。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案中，使用ニ價(jià)金屬離子將基質(zhì)形成劑交聯(lián)，以形成堅(jiān)固的水凝膠。通過(guò)將料漿霧化或擠出到含有ニ價(jià)金屬離子溶液的槽中，或通過(guò)將ニ價(jià)金屬離子直接添加到料漿中，以及讓制劑硬化并形成水凝膠來(lái)形成交聯(lián)的水凝膠制劑。然后將水凝膠制劑快速冷凍并按照本發(fā)明的干燥方法進(jìn)行干燥。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，制劑包含顯著量的玻璃形成劑，其中包埋了微生物。適合的試劑的實(shí)例包括但不限于蛋白質(zhì)，例如卵清蛋白、卵清、明膠、免疫球蛋白、分離的大豆蛋白、小麥蛋白、婉蛋白、棉桿蛋白、脫脂奶粉、釀蛋白酸鹽、乳清蛋白和任何水解的蛋白質(zhì)；糖類，包括單糖(例如半乳糖、D-甘露糖、山梨糖等)、ニ糖(例如乳糖、海藻糖、蔗糖等);氨基酸，例如賴氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸或組氨酸以及疏水性氨基酸(色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等)；甲基胺類例如甜菜堿；賦形劑鹽類例如硫酸鎂；多元醇例如三元以上糖醇(例如甘油、赤蘚糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇)；丙ニ醇；聚こニ醇；普盧蘭尼克(pluronics);表面活性劑；及其組合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，玻璃形成劑包含ニ糖和水解蛋白質(zhì)的混合物。在特定實(shí)施方案中，優(yōu)選的玻璃形成劑是海藻糖與水解蛋白質(zhì)的混合物。優(yōu)選情況下，以干物質(zhì)總重量的百分?jǐn)?shù)計(jì)，制劑包含10-90%的海藻糖和O.1-30%的水解蛋白質(zhì)，更優(yōu)選20-80%的海藻糖和O.1-20%的水解蛋白質(zhì)，最優(yōu)選40-80%的海藻糖和O.1-20%的水解蛋白質(zhì)。本發(fā)明的方法典型地包括將生物活性材料(例如肽、蛋白質(zhì)、酶、激素、維生素、類胡羅卜素、礦物質(zhì)、藥物、抗生素、殺微生物劑、殺真菌劑、除草劑、殺蟲(chóng)劑、殺精子劑、核酸、抗體、疫苗、細(xì)菌、病毒和/或細(xì)胞懸液)、至少ー種基質(zhì)形成劑和至少兩種玻璃形成劑在溶液中混合成均勻料漿，通過(guò)霧化、滴入或擠出到液氮槽中將料漿快速冷凍。從液氮槽收集珠子、微珠、串或小滴，并在液體狀態(tài)下在冷凍干燥器中干燥，或者可選地將它們儲(chǔ)存在低溫冰箱(在_30°C和_80°C之間)中直至干燥。在本發(fā)明的變體中，對(duì)制劑中基質(zhì)形成劑的量進(jìn)行調(diào)整以獲得所需的制劑粘度和密度，所需粘度和密度允許進(jìn)行有效率的初級(jí)干燥，同時(shí)避免了在初級(jí)液體干燥步驟期間典型發(fā)生的沸騰和過(guò)度發(fā)泡。通過(guò)本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的任何手段例如攪打或注入氣體例如空氣、氮?dú)狻ⅴ搜趸?、氬氣等可以獲得液體制劑的所需密度。優(yōu)選情況下，在快速冷凍步驟之前將氮?dú)庠诨旌舷伦⑷氲秸承粤蠞{制劑中，以形成穩(wěn)定的多孔或乳脂狀料漿。根據(jù)本發(fā)明，干燥過(guò)程包括三個(gè)主要步驟1·在低于2000mT0RR的真空壓カ下對(duì)冷凍粒子進(jìn)行短時(shí)間驅(qū)氣和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化的步驟，2.在高于2000mT0RR的真空壓カ和所需溫度下進(jìn)行初級(jí)液體干燥的步驟，3.在完全真空壓カ和升高的溫度下對(duì)玻璃質(zhì)材料進(jìn)行ニ級(jí)和最后干燥的步驟，其時(shí)間足以將干燥后制劑的水活度降低至O.3Aw以下。在干燥方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，將生物活性材料混合在包含基質(zhì)形成劑和玻璃形成劑的溶液中。在ー個(gè)特定實(shí)施方案中，生物活性材料包括活細(xì)菌(例如益生菌)。適合的微生物的實(shí)例包括但不限于酵母例如糖酵母屬(Saccharomyces)、德巴利氏酵母屬(Debaromyces)、假絲酵母屬(Candida)、畢赤氏酵母屬(Pichia)和球擬酵母屬(Torulopsis),霉菌例如曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)、毛霉屬(Mucor)、青霉屬(Penicillium)和球擬酵母屬(Torulopsis),以及細(xì)菌例如雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、蜜蜂球菌屬(Melissococcus)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、庫(kù)克菌屬(Kocuriaw)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、消化鏈球菌屬(Peptostrepococcus)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、微球菌屬(Micrococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、魏斯氏菌屬(Weissella)、氣球菌屬(Aerococcus)、酒球菌屬(Oenococcus)和乳桿菌屬(Lactobacillus)。適合的益生微生物的具體實(shí)例以下面的種為代表，并包括那些種中的所有培養(yǎng)生物型黑色曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(A.oryzae)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、緩慢芽抱桿菌(B.lentus)、地衣形芽抱桿菌(B.licheniformis)、腸膜芽孢桿菌(B.mesentericus)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、納豆芽抱桿菌(B.natto)、嗜淀粉擬桿菌(Bacteroidesamylophilus)、多毛擬桿菌(Bac.capiIIosus)、瘤胃生擬桿菌(Bac.ruminocola)、豬擬桿菌(Bac.suis)、青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)、動(dòng)物雙歧桿菌(B.animalis)、短雙歧桿菌(B.breve)、兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)、嬰兒雙歧桿菌(B.infantis)、乳雙歧桿菌(B.lactis)、長(zhǎng)雙歧桿菌(B.Iongum)Λ假長(zhǎng)雙歧桿菌(B.pseudolongum)、嗜熱雙歧桿菌(B.thermophilum)、Candidapintolepesii、丁酸梭狀芽抱桿菌(Clostridiumbutyricum)、乳脂腸球菌(Enterococcuscremoris)、ニ丁酮腸球菌(Ε·diacetylactis)、屎腸球菌(E.faecium)、中間腸球菌(Ε·intermedius)、乳酸腸球菌(Ε·lactis)、E.muntdi、嗜熱腸球菌(E.thermophilus)、大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)、脆壁克魯維氏酵母(Kluyveromycesfragilis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、消化乳桿菌(L.alimentarius)、食淀粉乳桿菌(L.amylovorus)、卷曲乳桿菌(L.crispatus)、短小乳桿菌(L.brevis)、干酪乳桿菌(L.case4)、彎曲乳桿菌(L.curvatus)、纖維ニ糖乳桿菌(L.cellobiosus)、德氏乳桿菌保加利亞亞種(L.delbrueckiiss.bulgaricus)、香腸乳桿菌(L.farciminis)、發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)、加氏乳桿菌(L.gasseri)、瑞士乳桿菌(L.helveticus)、乳酸乳桿菌(L.lactis)、植物乳桿菌(L.plantarum)、約氏乳桿菌(L.johnsonii)、羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、清酒乳桿菌(L.sakei)、唾液乳桿菌(L.salivarius)、腸系膜狀明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、啤酒(有害)片球菌(P.cereviseae(damnosus))、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、戊糖片球菌(P.pentosaceus)、費(fèi)羅伊登氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、薛曼納氏丙酸桿菌(Prop,shermanii)、啤酒糖酵母(Saccharomycescereviseae)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、木糖葡萄球菌(Staph,xylosus)、嬰兒鏈球菌(Streptococcusinfantarius)、唾液鏈球菌嗜熱亞種(Strep,salivariusss.thermophilus)、嗜熱鏈球菌(Strep.Thermophilus)和乳鏈球菌(^trep.lactisノ。在優(yōu)選方法中，將制劑在室溫下混合，或者略微加溫以幫助將材料溶解在粘性溶液中(例如從20°C至40°C)。然后，在混合均勻后，將粘性料漿通過(guò)霧化、滴入或擠出到液氮中進(jìn)行快速冷凍。從液氮槽收獲冷凍粒子，并立即干燥或可選地儲(chǔ)存在低溫冰箱中以備隨后干燥。典型情況下，將含有生物活性物質(zhì)的料漿快速冷凍到-30°C至-180°C之間，更優(yōu)選將制劑在液氮中快速冷凍。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將快速冷凍的粒子立即干燥，或者將其儲(chǔ)存在低溫冰箱中、優(yōu)選在_80°C下直至干燥。然后將冷凍粒子荷載在托盤上，并立即轉(zhuǎn)移至真空干燥箱，在真空干燥箱中按照本發(fā)明對(duì)它們進(jìn)行干燥。優(yōu)選情況下，通過(guò)將冷凍粒子置于在O和2000mT0RR之間的真空壓カ下開(kāi)始干燥。將冷凍粒子脫氣，并讓它們的結(jié)構(gòu)和體積發(fā)展和穩(wěn)定化一段短的時(shí)間。典型情況下，使冷凍粒子經(jīng)受高真空壓カ的理想時(shí)間長(zhǎng)度不超過(guò)30分鐘，更優(yōu)選情況下，該時(shí)間長(zhǎng)度在I和20分鐘之間。在冷凍粒子的短時(shí)間初始脫氣和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化之后，將真空調(diào)整到2000至10，OOOmTORR,并供熱使粒子在高于其冷凍點(diǎn)的溫度下融化。典型情況下，將真空調(diào)整到2000和4000mT0RR之間，并將粒子溫度升高到_5°C和+5°C之間。在這些優(yōu)選的初級(jí)干燥條件下，冷凍粒子快速融化并松散地維持其原始形狀，同時(shí)開(kāi)始加速脫水。在除去約60-90%的游離水之后，安排進(jìn)行隨后的ニ級(jí)干燥，施加最大真空壓カ并供應(yīng)熱量，使制劑的溫度升高到30°C至60°C。為了使最終產(chǎn)物的穩(wěn)定性最大化，優(yōu)選將制劑干燥一段足以使制劑的水活度降低至Aw=O.3以下的時(shí)間。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，ニ級(jí)干燥包括在低于IOOOmTORR的壓カ下除去結(jié)合水。干燥的制劑可以作為薄片直接使用，或者研磨成粉并篩分成約ΙΟμπι至約1000μm的平均粒徑。可以將制劑作為濃縮粉劑、作為復(fù)溶液體(例如飲料)直接施用于動(dòng)物、包括人類，或者可以將其以薄片或粉末形式摻入到現(xiàn)有的食品和飼料產(chǎn)品中。圖I.含有各種不同基質(zhì)和玻璃形成劑、作為按照本發(fā)明的方法冷凍的固體珠子的不同干燥組合物的目測(cè)和顯微鏡觀察結(jié)果。圖2.作為新鮮、冷凍珠子或干粉培養(yǎng)物的鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)物形式對(duì)其在干燥組合物中的初始CFU計(jì)數(shù)的影響。圖3.作為在液氮或-800C低溫冰箱中冷凍的固體珠子和作為在+4°C下未冷凍的粘性料漿的含有鼠李糖乳桿菌的組合物的冷凍溫度對(duì)干燥組合物中細(xì)菌的初始CFU計(jì)數(shù)的影響。結(jié)果只顯示了在干燥之前沒(méi)有附加的驅(qū)氣步驟下料漿的冷凍固溫度的影響。圖4.作為在液氮中冷凍的固體珠子和作為在+4°C下未冷凍的粘性料漿的含有動(dòng)物雙歧桿菌Bbl2的組合物的冷凍溫度對(duì)干燥組合物中細(xì)菌的初始CFU計(jì)數(shù)的影響。結(jié)果只顯示了在干燥之前沒(méi)有附加的驅(qū)氣步驟下料漿的冷凍溫度的影響。圖5.冷凍固體珠子在真空下的驅(qū)氣時(shí)間長(zhǎng)度對(duì)干燥組合物中鼠李糖乳桿菌的初始CFU計(jì)數(shù)的影響。圖6.本發(fā)明方法的組合物在冷凍干燥器中的干燥情況圖。圖7.鼠李糖乳桿菌在本發(fā)明的組合物和干燥方法中的過(guò)程和干燥損失。圖8.干燥的益生菌鼠李糖乳桿菌組合物儲(chǔ)存在40°C和33%相対濕度下的穩(wěn)定性趨勢(shì)。發(fā)明詳述定義應(yīng)該理解，在本文中使用的術(shù)語(yǔ)的目的僅僅是為了描述具體實(shí)施方案，并不旨在限制。當(dāng)在本說(shuō)明書和隨附的權(quán)利要求書中使用時(shí)，不帶具體數(shù)量的指稱包括其復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確指明不是如此。因此，例如指稱“蛋白質(zhì)”包括單個(gè)蛋白質(zhì)或兩種以上蛋白質(zhì)的組合；指稱“酶”、“維生素”、“細(xì)菌”等包括単數(shù)或幾種的混合物，等等。“生物活性材料”、“生物活性組合物”或“生物活性制劑”是指這樣的制備物，所述制備物處于使生物活性成分的生物活性肯定有效的形式下。“基質(zhì)形成劑”是指添加到制劑中以增加濕制劑的粘度和/或密度或形成水凝膠的化合物或材料。適合的基質(zhì)形成劑的實(shí)例包括但不限于水溶性纖維素衍生物，例如甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥こ基纖維素和羥丙基甲基纖維素；藻酸鹽，半乳甘露聚糖，結(jié)冷膠，黃蓍膠，包括它們的任何衍生物，こ酸鄰苯ニ甲酸纖維素(CAP)，羧甲基纖維素，果膠，藻酸鈉，藻酸的鹽，羥丙基甲基纖維素(HPMC)，甲基纖維素，卡拉膠，瓜爾膠，阿拉伯膠，黃原膠，刺槐豆膠，殼聚糖和殼聚糖衍生物，膠原，聚こ醇酸，淀粉和改性淀粉，環(huán)糊精和寡糖(菊粉、麥芽糖糊精、葡聚糖等)，及其組合。“玻璃形成劑”或“糖玻璃形成劑”一般是指容易溶解在溶液中并且在與水接觸后不變稠或聚合的化合物或材料。添加這些試劑是為了確?；蛟黾由锘钚圆牧显诟稍镞^(guò)程期間和隨后的穩(wěn)定性，或干粉產(chǎn)物的長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性。有用的玻璃形成劑可以是單體、低聚或聚合的。根據(jù)ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，玻璃形成劑是糖類。糖類被定義為主要由碳、氫和氧構(gòu)成的化合物。有用的糖類包括還原和非還原糖類和糖醇、寡糖、水溶性多糖及其衍生物。本發(fā)明的優(yōu)選糖類包括葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖、纖維ニ糖、半乳糖、麥芽三糖、棉子糖、糊精、葡聚糖、菊粉、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇。特別優(yōu)選的糖類是葡萄糖和海藻糖。其他有用的玻璃形成劑可以選自其他化學(xué)類型，例如水溶性氨基酸、肽或蛋白質(zhì)和水解蛋白質(zhì)。例如，賴氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸或組氨酸，以及疏水性氨基酸(色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等)；甲基胺類例如甜菜堿。有用的蛋白質(zhì)包括明膠、卵清蛋白、卵清、乳清蛋白、酪蛋白酸鹽、免疫球蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、棉籽蛋白或其他食品、乳制品或植物蛋白?！八獾鞍踪|(zhì)”一般是指來(lái)自于動(dòng)物、乳制品或植物來(lái)源的，通過(guò)酶促水解或消化被分解成較短的肽片段和/或氨基酸的蛋白質(zhì)。有用的水解蛋白質(zhì)是那些經(jīng)歷過(guò)大量水解過(guò)程的蛋白質(zhì)，所述大量水解過(guò)程使99%的天然蛋白質(zhì)的分子量降低至低于50，000道爾頓、優(yōu)選低于10，000道爾頓?！碍h(huán)境”室溫或條件是在給定環(huán)境中任何給定時(shí)間處的溫度或條件。典型情況下，環(huán)境室溫是22-25°C，環(huán)境大氣壓カ和環(huán)境濕度是容易測(cè)量的，并且隨著一年中的時(shí)節(jié)、天氣和氣候條件、海抜等而變。在本發(fā)明的情形中，“驅(qū)氣”或“脫氣”是指從固體或液體制劑釋放氣體，在所述固體或液體制劑中氣體的分壓大于所施加的壓力。這不是液體形式的溶液的沸騰，通?？梢栽诒仁谷芤悍序v的壓カ更高的壓カ下發(fā)生。“沸騰”是指當(dāng)液體的溫度高于其沸騰溫度時(shí)發(fā)生的從液體到氣體的快速相轉(zhuǎn)變。沸騰溫度是液體的蒸汽壓等于所施加的壓カ時(shí)的溫度。當(dāng)向已經(jīng)處于其沸點(diǎn)的液體加熱時(shí)，沸騰會(huì)特別劇烈。在干燥制劑組合物的情形中，“水活度”或“Aw”是指水的可利用率，并且表示系統(tǒng)中水的能量狀態(tài)。它被定義為樣品上水的蒸汽壓除以純水在相同溫度下的蒸汽壓。純蒸餾水的水活度正好為1，或Aw=LO。在儲(chǔ)存穩(wěn)定性的情形中，“相對(duì)濕度”或“RH”是指在給定溫度下空氣中水蒸氣的量。相対濕度通常低于使空氣飽和所需的濕度，并用飽和濕度的百分?jǐn)?shù)表示。“干燥”及其變體是指被凍干、脫水或無(wú)水，即顯著缺乏液體的物理狀態(tài)。干燥包括例如噴霧干燥、流化床干燥、凍干和真空干燥?！皟龈伞被颉袄鋬龈稍铩笔侵竿ㄟ^(guò)快速冷凍并在冷凍狀態(tài)下脫水(有時(shí)被稱為升華)來(lái)制備干燥形式的組合物。該過(guò)程可以在真空下在足以維持冷凍產(chǎn)物的壓力、優(yōu)選為低于約2000mT0RR的壓カ下發(fā)生。對(duì)于本文中描述的方法來(lái)說(shuō)，“初級(jí)干燥”或“液體干燥”是指從融化冷凍粒子的時(shí)間到開(kāi)始ニ級(jí)干燥的時(shí)間點(diǎn)之間所發(fā)生的脫水干燥。典型情況下，大部分的初級(jí)干燥通過(guò)大量蒸發(fā)來(lái)進(jìn)行，同時(shí)將產(chǎn)物溫度維持在顯著低于熱源的溫度下。該過(guò)程可以在真空下在足以維持融化的產(chǎn)物的壓力、優(yōu)選為高于約2000mT0RR的壓カ下發(fā)生。對(duì)于本文中描述的方法來(lái)說(shuō)，“ニ級(jí)干燥”是指在高于制劑的冷凍溫度并接近熱源溫度的溫度下發(fā)生的干燥步驟。該過(guò)程可以在真空下在足以降低制劑的水活度的壓力、優(yōu)選為低于約IOOOmTORR的壓カ下發(fā)生。在典型的制劑干燥過(guò)程中，ニ級(jí)干燥步驟將制劑的水活度降低至Aw為O.3以下?！芭菽纬伞笔侵冈谏镏破吩诃h(huán)境和更高溫度下長(zhǎng)時(shí)間保持活性或生存カ的條件下，通過(guò)在真空下沸騰來(lái)干燥敏感性生物制品的程序。用于形成機(jī)械上穩(wěn)定的多孔結(jié)構(gòu)的特定程序分兩步進(jìn)行(I)初級(jí)泡沫干燥并通過(guò)在真空下沸騰；(2)穩(wěn)定性干燥/玻璃化，并且被公開(kāi)在Bronshtein的美國(guó)專利No.5，766，520中?！胺€(wěn)定的”制劑或組合物是其中的生物活性材料在儲(chǔ)存后基本上保留其物理穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物活性的制劑或組合物。對(duì)于選定的時(shí)間長(zhǎng)度來(lái)說(shuō)，可以在選定的溫度和濕度條件下測(cè)量穩(wěn)定性?？梢允褂泌厔?shì)分析來(lái)估算預(yù)期的儲(chǔ)存期限，然后才將材料實(shí)際儲(chǔ)存該時(shí)間長(zhǎng)度。例如對(duì)于活細(xì)菌來(lái)說(shuō)，穩(wěn)定性被定義為在預(yù)定的溫度、濕度和時(shí)間長(zhǎng)度條件下失去Ilog的CFU/g干制劑所花費(fèi)的時(shí)間。對(duì)于細(xì)菌來(lái)說(shuō)，“生存力”是指在適合于細(xì)菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)上形成菌落的能力(CFU或菌落形成単位)。對(duì)于病毒來(lái)說(shuō)，生存カ是指感染適合的宿主細(xì)胞并在適合的宿主細(xì)胞中繁殖，導(dǎo)致在宿主細(xì)胞的菌苔上形成噬斑的能力。本發(fā)明的組合物和方法解決了為含有敏感性生物活性材料例如肽、蛋白質(zhì)、酶、激素、維生素、類胡蘿卜素、礦物質(zhì)、藥物、抗生素、殺微生物劑、殺真菌劑、除草剤、殺蟲(chóng)劑、殺精子劑、核酸、抗體、疫苗、細(xì)菌、病毒和/或細(xì)胞懸液的且在干燥狀態(tài)下的壽命顯著延長(zhǎng)的制劑提供成本效益高并且在エ業(yè)上可放大的干燥方法的問(wèn)題。本發(fā)明提供了在溶液混合物中包含生物活性材料與基質(zhì)和玻璃形成劑的組合物，以及干燥方法，所述干燥方法包括將所述組合物在液氮中快速冷凍以形成小滴、串、珠子或微珠形式的無(wú)定形固體結(jié)構(gòu)，以及將冷凍粒子在高真空下驅(qū)氣，然后通過(guò)在降低壓カ并同時(shí)向組合物供應(yīng)熱量的方案下凍干或蒸發(fā)水分，將生物活性材料穩(wěn)定在糖玻璃形成物中。微生物在干燥過(guò)程期間的大部分生存カ損失，可歸因于與溶液在低干燥壓カ和高溫下的“沸騰”和發(fā)泡相關(guān)的空泡氣蝕期間的冰晶形成、高滲透和氧化脅迫、剪切力和能量釋放這些因素的組合。本發(fā)明避免了這些負(fù)面效應(yīng)，并提供了組合物和損失最小的干燥方法，其產(chǎn)生在隨后的苛刻儲(chǔ)存和操作條件下保護(hù)在糖玻璃基質(zhì)中的生物活性材料。本發(fā)明的組合物本發(fā)明包括生物活性材料、基質(zhì)形成劑和玻璃形成劑在粘性溶液中的組合物。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的制劑在其物理結(jié)構(gòu)和功能方面與使用或不使用快速冷凍和驅(qū)氣進(jìn)行干燥的非粘性或濃縮制劑具有本質(zhì)上的區(qū)別。例如，現(xiàn)有技術(shù)的制劑首先通過(guò)沸騰進(jìn)行“發(fā)泡”以促進(jìn)有效干燥。發(fā)泡步驟通常引起溶液的大量沸騰和噴發(fā)，這是在液態(tài)中干燥不可避免的結(jié)果，因此在小瓶或容器中只能獲得非常低的材料荷載容量(參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.6，534，087，其中最終發(fā)泡產(chǎn)物的厚度小于2mm)。本發(fā)明的組合物和干燥方法避免了制劑的沸騰和大量發(fā)泡，從而使単位干燥面積的材料荷載量大大提高，因此能夠容易地放大規(guī)模至生產(chǎn)大量材料，而無(wú)需使用特別設(shè)計(jì)的容器、托盤或設(shè)備。已經(jīng)顯示，益生菌特別受益于本發(fā)明的制劑和干燥方法。按照本發(fā)明的組合物和方法來(lái)制備制劑，所述方法包括將益生菌的新鮮、冷凍或干燥培養(yǎng)物與至少ー種基質(zhì)形成劑和至少兩種玻璃形成劑混合，將粘性制劑在液氮中快速冷凍以形成冷凍的固體小滴、串或珠子的無(wú)定形結(jié)構(gòu)。對(duì)于初級(jí)干燥來(lái)說(shuō)，施加足夠的真空壓カ以驅(qū)氣并穩(wěn)定冷凍粒子的結(jié)構(gòu)，然后將冷凍粒子在降低的真空壓カ和高于制劑冷凍溫度的升高溫度下凍干或蒸發(fā)?？梢酝ㄟ^(guò)將熱量從制劑傳導(dǎo)出去，和/或通過(guò)由水蒸發(fā)造成的潛熱損失來(lái)實(shí)現(xiàn)將制劑的溫度維持在高于冷凍點(diǎn)。為了完成干燥過(guò)程并進(jìn)ー步降低制劑的水活度，可以在IOOOmTORR以下的較高真空壓カ和最高達(dá)70°C的升高的溫度下執(zhí)行ニ級(jí)干燥步驟，以提供具有Aw為O.3以下的水活度的最終組合物。如圖8中所示，這樣的組合物能夠在40°C和33%RH的儲(chǔ)存條件下保持穩(wěn)定30天以上。組合物的制備為了制備本發(fā)明的干粉組合物而與優(yōu)選的生物活性物質(zhì)在溶液中混合的材料，包括至少ー種基質(zhì)形成劑和至少兩種玻璃形成劑。這樣的材料在與優(yōu)選的生物活性材料混合時(shí)在液氮中形成珠子、微珠、串或小滴，并且能夠按照本發(fā)明的方法有效率地凍干或脫水成無(wú)定形玻璃態(tài)，以提供大量穩(wěn)定的干燥組合物用于所述生物活性材料的儲(chǔ)存和施用(對(duì)于不同制劑在干燥后的目測(cè)和顯微鏡觀察結(jié)果以及水活度(Aw)，參見(jiàn)圖IA和B)?；|(zhì)形成劑提供了制劑的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，改進(jìn)的干燥曲線和/或?qū)ι锘钚圆牧系奈锢砗突瘜W(xué)保護(hù)益處?；|(zhì)形成劑還為制劑提供增稠的粘度，對(duì)制劑在真空壓カ下的性質(zhì)提供更好的控制，并増加本發(fā)明的干燥制劑組合物的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度(對(duì)于特定制劑的玻璃質(zhì)結(jié)構(gòu)和干燥性，參見(jiàn)圖IB-照片4、4b、4c)。基質(zhì)形成劑包含多糖與寡糖的混合物。由于水溶性膠在溫和的溫度下形成粘性凝膠的獨(dú)特性質(zhì)，水溶性膠是優(yōu)選的多糖，特別是對(duì)于活生物體來(lái)說(shuō)。還發(fā)現(xiàn)，一定濃度的膠能夠有效地穩(wěn)定制劑，促進(jìn)無(wú)定形玻璃質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成，并改進(jìn)真空下的干燥曲線(參見(jiàn)圖IA-照片3a、3b、3c、4和圖lB_4c和圖6)。尤其是通過(guò)觀察圖IA的照片并結(jié)合下面表I中顯示的結(jié)果，可以明顯看出樣品3b、3c、4、5和6都被充分干燥,在無(wú)定形玻璃質(zhì)結(jié)構(gòu)中提供一定孔隙度。表I各種干燥組合物的目測(cè)檢查I23a3bc456十き性小十きイヽ燥小·}‘燥十燥十!^；十燥干燥干燥[_6]多孔性無(wú)無(wú)尤存在存在存在無(wú)部分Aw0.8470.9230.9160.2160.1830.3760.1710.112玻璃結(jié)構(gòu)I—無(wú)—無(wú)—無(wú)—部分—部分—IF在_部分_部分本發(fā)明的玻璃形成劑可以包括各種糖類、非還原糖、糖醇、氨基酸、蛋白質(zhì)、水解蛋白質(zhì)和肽。玻璃形成化合物優(yōu)選為在冷凍溫度(例如低于-20°C)下不便制劑中的生物活性材料結(jié)晶和/或去穩(wěn)定化的化合物。例如，生物活性材料可以被物理包埋在無(wú)定形糖玻璃結(jié)構(gòu)例如蔗糖或海藻糖中，以促進(jìn)在整個(gè)干燥過(guò)程中保留分子結(jié)構(gòu)，并賦予干燥狀態(tài)下的無(wú)定形基質(zhì)以結(jié)構(gòu)剛性。玻璃形成劑代替在干燥期間失去的結(jié)合水，以防止細(xì)胞膜損傷和酶的變性(參見(jiàn)Crowe等，1998的綜述)。玻璃形成劑的其他功能可以包括保護(hù)生物活性材料以免暴露于損傷性的光、氧氣、氧化劑和水分。大多數(shù)玻璃形成劑必須易于以約O.I重量％至約80重量％范圍內(nèi)的量溶解在溶液中。包含兩種以上不同的玻璃形成劑，對(duì)于抑制晶體形成和増加干燥的生物活性材料制劑在儲(chǔ)存條件下的長(zhǎng)期穩(wěn)定性是有益的(參見(jiàn)圖IA-照片4、5和6中糖類和蛋白質(zhì)混合物的效果)。預(yù)干燥的制劑包含顯著量的總固體(組分減去溶劑例如水)?？偣腆w的主要部分由生物活性材料、基質(zhì)形成劑和玻璃形成劑構(gòu)成。例如，生物活性材料以在約5-60重量％范圍內(nèi)的濃度存在于制劑中，基質(zhì)形成劑在約1-20重量％范圍內(nèi)，玻璃形成劑在約5-80重量％范圍內(nèi)。在另ー個(gè)實(shí)例中，基質(zhì)形成劑可以以在約O.5-10重量％范圍內(nèi)的濃度存在于制劑中，玻璃形成劑在約10-50重量％范圍內(nèi)。優(yōu)選情況下，濕制劑應(yīng)該具有在約5%和80%之間、更優(yōu)選在30%和60%之間的固體含量。本發(fā)明的制劑的粘度典型地高于1000厘泊(cP)、更優(yōu)選高于5，OOOcP、最優(yōu)選高于10，OOOcP0本發(fā)明的制劑的密度優(yōu)選在O.9和I.2g/ml之間。制備穩(wěn)定干燥制劑的方法制備含有生物活性材料的穩(wěn)定干燥制劑的方法包括(I)通過(guò)將生物活性材料與基質(zhì)和玻璃形成劑在溶液中混合來(lái)制備制劑，(2)將制劑快速冷凍以形成固體冷凍粒子，(3)使冷凍粒子經(jīng)受短時(shí)間的高真空壓力，以對(duì)粒子進(jìn)行驅(qū)氣并使其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，(4)在向制劑供應(yīng)熱量使其溫度高于制劑的冷凍溫度、優(yōu)選高于-10°C的溫度的同時(shí)，通過(guò)在降低的壓力下凍干和/或蒸發(fā)水分來(lái)除去水，(5)在完全真空和升高的溫下進(jìn)ー步將制劑的水活度降低至低于O.3Aw0例如,在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑包含被配制在含有基質(zhì)和玻璃形成劑的溶液和懸液中的生物活性材料。將基質(zhì)形成劑和/或高濃度的玻璃形成劑在攪拌下溶解在熱的水溶液中并消毒，然后冷卻并與生物活性材料混合。通過(guò)離心或過(guò)濾將生物活性材料例如培養(yǎng)的病毒或細(xì)菌濃縮并與培養(yǎng)基分開(kāi)，然后重新懸浮到制劑中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在濃縮的活生物體的液體中提供了制劑中的全部水，并且活生物體懸液被維持在略高于室溫的溫度下。將干燥的組分摻混在一起，然后緩慢加入到活生物體的溫暖(25°C至40°C)懸液中。將制劑懸液在行星式混合器中輕柔攪拌，直到所有組分完全分散并獲得均勻的料漿。然后通過(guò)霧化、滴入或擠出到液氮槽中將粘性溶液快速冷凍，以形成小的固體小滴、串或珠子?？梢詫⒗鋬龅墓腆w粒子儲(chǔ)存在-30°C和-80°C之間的低溫冰箱中直至干燥，或立即置于托盤上并按照本發(fā)明的方法凍干或干燥。將固體冷凍粒子在足夠的真空(例如低于2000mT0RR)下進(jìn)行短時(shí)間驅(qū)氣，典型地在I和20分鐘之間。一般來(lái)說(shuō)，在驅(qū)氣步驟期間，在低于_20°C的溫度下粒子保持固體冷凍形式。在初始驅(qū)氣步驟后，將真空壓カ增加到2000和10，OOOmTORR之間，并且可以提供熱量使得制劑溫度快速增加到_5°C和+5°C之間并使粒子開(kāi)始融化。在制劑溫度達(dá)到所需溫度后，調(diào)整加熱以維持該溫度并執(zhí)行初級(jí)干燥步驟。在該步驟時(shí)，制劑已經(jīng)融化，并且在沒(méi)有任何沸騰或發(fā)泡的情況下發(fā)生水的加速蒸發(fā)。典型的現(xiàn)有技術(shù)方法涉及大量發(fā)泡和/或?yàn)R射以及劇烈沸騰，這可以損壞敏感性生物制品，并對(duì)以高的荷載容量進(jìn)行エ業(yè)規(guī)模放大造成困難(參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.6，534，087，其中施加的真空壓カ引起劇烈沸騰和發(fā)泡)，而本發(fā)明的組合物和方法避免了制劑的任何沸騰或過(guò)量發(fā)泡，同時(shí)獲得了明顯更快的干燥速率，并能實(shí)現(xiàn)制劑的高荷載容量。此外，完全且有效率地將粘性液體料漿脫氣是困難的，并可能需要長(zhǎng)時(shí)間。在本發(fā)明中通過(guò)使用適合的組合物解決了所有這些障礙，所述組合物允許有效的初級(jí)液體干燥，并形成無(wú)定形玻璃質(zhì)構(gòu)造而沒(méi)有任何沸騰和過(guò)度發(fā)泡。令人吃驚和重要的是，這主要是通過(guò)適合組合物的快速冷凍并通過(guò)在初級(jí)液體干燥步驟開(kāi)始之前引入短時(shí)間的驅(qū)氣步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)的。與料漿或粘性糖漿相反，固體冷凍粒子在托盤上的荷載使得托盤上單位干燥面積的荷載容量比按照現(xiàn)有技術(shù)所能提供的高得多。在初級(jí)液體干燥階段完成后，將穩(wěn)定化的無(wú)定形玻璃質(zhì)制劑保持在升高的二級(jí)干燥溫度(在20°C和70°C之間)和低于IOOOmTORR的真空壓力下，以在非常短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)一步降低制劑的水活度。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了制備用于保存生物活性材料的水凝膠制劑組合物的方法。例如，將含有生物活性材料和基質(zhì)與玻璃形成劑的制劑在溶液中混合，并通過(guò)霧化或擠出到含有二價(jià)金屬離子的槽中或通過(guò)將二價(jià)金屬離子直接添加到料漿中并將變硬的水凝膠化厚塊粉碎成小串或碎片，來(lái)交聯(lián)形成堅(jiān)固的水凝膠粒子。然后按照如上所述的本發(fā)明的干燥方法來(lái)干燥水凝膠化的粒子。例如，在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，制劑在1-4%藻酸鈉和10-40%海藻糖的溶液中包含活益生菌。向制劑添加5-10%的蛋白質(zhì)、特別是水解蛋白質(zhì)例如酪蛋白、乳清、豌豆、大豆或棉子蛋白，以改進(jìn)制劑的干燥過(guò)程和無(wú)定形玻璃質(zhì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的形成(參見(jiàn)圖IA照片4、5和6)。益生菌培養(yǎng)物可以是新鮮、冷凍的或已經(jīng)干燥成干粉形式(對(duì)于干燥制劑中益生菌的不同培養(yǎng)物形式的CFU計(jì)數(shù)，參見(jiàn)圖2)。將溶液在略高于室溫的溫度(典型在25V-37°C之間)下混合，直到所有組分完全溶解。將制劑料漿霧化、擠出或滴入到液氮中以形成小滴或珠子，然后將其從液氮中取出，裝入袋中，并可以儲(chǔ)存在-80°C的低溫冰箱中直至干燥?；钜嫔牡湫透稍锓椒ò▽⒐腆w冷凍珠子在托盤上鋪展成均勻的層，荷載容量在100-1000g/sqft之間，并將托盤立即置于冷凍干燥器中。然后施加約IOOOmTORR的真空壓力，并且取決于冷凍干燥器的尺寸和熱源類型，將架子溫度調(diào)整至+20°C或足以將粒子維持在約_20°C的溫度。允許對(duì)固體冷凍珠子驅(qū)氣約5-30分鐘，將真空調(diào)整到2000和10，OOOmTORR之間，并增加傳熱以將制劑溫度升高到_5°C和+5°C之間。在初級(jí)液體干燥步驟期間維持這些溫度和真空壓力條件，取決于托盤載量，所述初級(jí)液體干燥步驟可能持續(xù)幾小時(shí)并最高達(dá)24小時(shí)，優(yōu)選為約3至10小時(shí)。在初級(jí)干燥過(guò)程中的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)，溶劑的蒸發(fā)速率變緩，并由于干燥箱中熱供應(yīng)過(guò)多，制劑溫度開(kāi)始升高。該時(shí)間點(diǎn)表明初級(jí)干燥步驟結(jié)束。由于溶劑從制劑中被驅(qū)除，溶液中的玻璃形成劑變得濃縮和更稠，直至不再像液體一樣流動(dòng)并形成無(wú)定形和/或穩(wěn)定的玻璃質(zhì)結(jié)構(gòu)。然后在完全真空和在30°C和50°C之間的制劑溫度下進(jìn)行二級(jí)干燥步驟。二級(jí)干燥步驟的目的是除去殘余的被夾帶或結(jié)合的水分，并提供在環(huán)境溫度下長(zhǎng)期儲(chǔ)存中穩(wěn)定的組合物。二級(jí)干燥步驟可以持續(xù)幾小時(shí)，其終點(diǎn)是制劑完全干燥并且水活度低于0.3Aw時(shí)。本發(fā)明的干燥方法產(chǎn)生包覆在無(wú)定形玻璃質(zhì)基質(zhì)內(nèi)的生物活性材料，由于無(wú)定形玻璃質(zhì)組合物中的化合物和其他分子的移動(dòng)性極大降低，由此防止了蛋白質(zhì)解折疊并顯著減緩了分子相互作用或交叉反應(yīng)性。只要無(wú)定形固體處于低于其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度的溫度下，并且殘余的水分保持相對(duì)低(即低于0.3的Aw)，生物活性材料就能保持相對(duì)穩(wěn)定(參見(jiàn)圖8)。應(yīng)該指出，獲得玻璃態(tài)不是長(zhǎng)期穩(wěn)定性的必要條件，因?yàn)槟承┥锘钚猿煞衷诟泳B(tài)下可能保存得更好。干粉的制備干燥制劑可以被整塊使用、切成所需形狀和尺寸、或壓碎并碾磨成自由流動(dòng)的粉齊，所述自由流動(dòng)的粉劑提供了容易的下游處理例如濕法或干法團(tuán)聚、成粒、制片、壓實(shí)、制粒，或混合在食品或飼料產(chǎn)品或任何其他種類的遞送方法中。用于壓碎、碾磨、研磨或粉碎的方法在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是公知的。例如，可以使用錘式碾磨機(jī)、風(fēng)力碾磨機(jī)、沖擊式碾磨機(jī)、噴射式碾磨機(jī)、銷棒碾磨機(jī)、Wiley碾磨機(jī)或類似的碾磨裝置。碾磨后粒子的優(yōu)選粒徑為小于約1000μm,優(yōu)選小于500μm。本文描述的組合物和方法保存所包覆的生物活性材料的生物活性。例如，通過(guò)將組合物置于升高的溫度(例如40°C)和高濕度(例如33%RH)下并測(cè)量制劑的生物活性，來(lái)測(cè)試組合物的穩(wěn)定性。例如，對(duì)于活益生菌來(lái)說(shuō)，這些研究的結(jié)果證實(shí)了被配制在這些制劑中的細(xì)菌穩(wěn)定至少20天(參見(jiàn)圖8)。穩(wěn)定性被定義為效價(jià)損失一個(gè)logCFU/g的時(shí)間。即使在使用高濃度生物活性材料時(shí)，這樣的制劑也是穩(wěn)定的。因此這些制劑的優(yōu)點(diǎn)在于它們可以在室溫或高于室溫的溫度下長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸和儲(chǔ)存。具體實(shí)施例方式提供以下實(shí)施例來(lái)說(shuō)明而不是限制所要求保護(hù)的發(fā)明。實(shí)施例I制備干燥且穩(wěn)定的益生菌物質(zhì)基礎(chǔ)制劑將75g海藻糖(CargillMinneapolis,MN)和22g廣泛水解的酪蛋白(Marcor,Carlstadt,NJ)與3g藻酸鈉(ISPCorp.,Wayne,NJ)在干燥形式下均勻混合。在摻混器中加入嗜酸乳桿菌的新鮮濃縮物(100ml，含有至少10%固體，直接來(lái)自于發(fā)酵收獲)，并維持在35°C。向益生菌培養(yǎng)物緩慢加入膠、糖和水解蛋白質(zhì)的干混物，并在35°C下混合10分鐘。然后將粘性料漿轉(zhuǎn)移至底部穿孔的容器中，并讓其滴入含有液氮的槽中。然后從液氮中取出珠子并立即轉(zhuǎn)移至干燥。干燥基礎(chǔ)制劑的冷凍珠子將冷凍珠子以lOOg/sqft的荷載容量均勻鋪展在托盤上，并立即置于冷凍干燥器(25SRC型，Virtis，Gardiner，NY)的架子上。然后施加IOOOmTORR的真空壓力，并讓固體冷凍珠子驅(qū)氣10分鐘。然后將真空調(diào)整至2700mT0RR，并將架子溫度升高至+30°C。將這些溫度和真空壓力維持3小時(shí)。然后在完全真空(150-200mT0RR)和升高至30°C的架子溫度下繼續(xù)進(jìn)行2小時(shí)的二級(jí)干燥步驟。制劑被完全干燥,通過(guò)HygropalmAwI儀器(RotonicInstrumentCorp.,Huntington,NY.)測(cè)量其水活度為Aw=O.23。實(shí)施例2含有益生菌鼠李糖乳桿菌LGG的穩(wěn)定干燥組合物將鼠李糖乳桿菌LGG(來(lái)自商業(yè)來(lái)源的500g冷凍濃縮物)在帶有夾套的雙行星混合器(DPM,lqt,RossEngineering,Inc.Savannah,GA)中在37°C下融化。將兩種玻璃形成劑海藻糖(387g,CargillMinneapolis,MN)和廣泛水解的酪蛋白(83g,Marcor,Carlstadt,NJ)與兩種基質(zhì)形成劑藻酸鈉(15g,ISPCorp.，Wayne,NJ)和速溶菊粉(25g,CargillMinneapolis，MN)在干燥形式下均勻混合。向融化的益生菌緩慢加入干混物，并在40RPM和37°C下混合10分鐘。通過(guò)加入50-200ml水，將料漿的粘度調(diào)整至12，OOOCp。然后將料漿轉(zhuǎn)移至底部穿孔的容器中，并讓其滴入含有液氮的容器中。然后從液氮中取出珠子，置于密封的包有鋁箔的袋子中，在低溫冰箱中在_80°C儲(chǔ)存幾周。對(duì)于干燥來(lái)說(shuō)，將冷凍珠子以100至最高500g/sqft范圍內(nèi)的荷載容量均勻鋪展在托盤上，并將托盤置于冷凍干燥器(25SRC型，Virtis,Gardiner,NY)中的架子上。施加IOOOmTorr的真空壓力，并將架子溫度調(diào)節(jié)到+20°C。讓固體冷凍珠子驅(qū)氣I至30分鐘范圍內(nèi)的一段時(shí)間。在驅(qū)氣步驟后，在將真空壓力調(diào)整至2700mT0RR并將架子溫度升高至+30°C后，進(jìn)行初級(jí)干燥步驟。將這些溫度和真空壓力維持12小時(shí)。然后在完全真空(150-200mT0RR)和維持在30°C的架子溫度下繼續(xù)進(jìn)行4小時(shí)的二級(jí)干燥步驟。制劑被完全干燥，其水活度經(jīng)測(cè)量為O.23Aw。圖6顯示了所述益生菌制劑的干燥曲線。在圖3、4和7中，顯示了料漿在不同溫度(+4°C、_80°C和_180°C)下冷凍之后和在干燥步驟、包括冷凍珠子的制備和在冷凍干燥器中干燥之后的生存力損失。取決于細(xì)菌培養(yǎng)物的類型(冷凍或干燥培養(yǎng)物)和粘性料漿的冷凍溫度，整個(gè)過(guò)程的生存力損失一般低于一個(gè)log。結(jié)果顯示，益生菌在液氮(_180°C)中的快速冷凍與在_80°C下冷凍相比，是損傷更低的方法。圖5和8顯示了在O分鐘(沒(méi)有驅(qū)氣)至30分鐘范圍內(nèi)的各種驅(qū)氣時(shí)間長(zhǎng)度對(duì)干燥組合物中的益生菌初始計(jì)數(shù)，以及在40°C和33%RH的加速儲(chǔ)存條件下的儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，總的來(lái)說(shuō)，較長(zhǎng)的驅(qū)氣時(shí)間增加干燥制劑中的細(xì)菌初始計(jì)數(shù)，但是對(duì)益生菌制劑的儲(chǔ)存穩(wěn)定性沒(méi)有影響。實(shí)施例3將海藻糖(752g,CargillMinneapolis,MN)、廣泛水解的豌豆蛋白(167g,Marcor,Carlstadt,NJ)、藻酸鈉(30g，ISPCorp.，Wayne,NJ)和速溶菊粉(50g,CargillMinneapolis,MN)以干燥形式均勻混合。將干混物緩慢添加到在帶有夾套的雙行星混合器(DPM,lqt,RossEngineering,Inc.Savannah,GA)中的80°C的1000ml熱去離子水中，并在40RPM混合10分鐘。將混合物的溫度降低至37°C，緩慢加入從商業(yè)來(lái)源獲得的IOOg鼠李糖乳桿菌LGG的干粉，并繼續(xù)混合20分鐘。然后將料漿通過(guò)2_孔針擠出到含有液氮的槽中。然后從液氮中取出串/珠子，置于密封的包有鋁箔的袋子中，在低溫冰箱中在_80°C儲(chǔ)存幾周。對(duì)于干燥來(lái)說(shuō)，將冷凍的串/珠子以100至500g/sqft范圍內(nèi)的荷載容量均勻鋪展在托盤上，將托盤置于冷凍干燥器(25SRC型，Virtis,Gardiner,NY)中的架子上，并如實(shí)施例2中所述進(jìn)行干燥。所有制劑均令人滿意地被保留在托盤內(nèi)，在所有荷載水平下菌沒(méi)有觀察到濺射或發(fā)泡。即使在較高荷載容量下，制劑也被完全干燥，對(duì)于所有樣品來(lái)說(shuō)，測(cè)量到的水活度為0.26Aw以下。實(shí)施例4制備含有益生菌乳雙歧桿菌(Bbl2)的水凝膠制劑按照實(shí)施例I制備濃縮的乳雙歧桿菌(Bbl2)益生菌料漿。向基礎(chǔ)制劑加入0.5g磷酸氫二鈣，然后加入0.5g葡萄糖酸內(nèi)酯。在接下來(lái)的2小時(shí)內(nèi)讓料漿在室溫下硬化，以形成固體水凝膠。使用可商購(gòu)的切片機(jī)/切碎機(jī)，將堅(jiān)固的凝膠切成細(xì)且長(zhǎng)的絲。將細(xì)絲在液氮中快速冷凍，以700g/sqft的荷載容量荷載在托盤上并置于冷凍干燥器中，如實(shí)施例2中所述進(jìn)行干燥。制劑的水活度(Aw)為O.05(通過(guò)HygroPalmAwl,RotonicHuntington,NY測(cè)量)。使用標(biāo)準(zhǔn)的錘式碾磨設(shè)備將干燥制劑進(jìn)一步研磨成細(xì)粉，并通過(guò)50-250微米篩網(wǎng)進(jìn)行篩分。實(shí)施例5含有益生菌嗜酸乳桿菌的無(wú)過(guò)敏原組合物將海藻糖(752g,CargillMinneapolis,MN)、廣泛水解的豌豆蛋白(167g,Marcor,Carlstadt,NJ)、藻酸鈉(30g，ISPCorp.，Wayne,NJ)和速溶菊粉(50g,CargillMinneapolis,MN)以干燥形式均勻摻混。通過(guò)將干混物緩慢添加到在帶有夾套的雙行星混合器(DPM,lqt,RossEngineering,Inc.Savannah,GA)中的80°C的IOOOml熱去離子水中對(duì)其進(jìn)行滅菌，并在40RPM混合10分鐘，直至形成順滑清澈的料漿。將混合物的溫度降低至370C，緩慢加入從商業(yè)來(lái)源獲得的IOOOg含有嗜酸乳桿菌的冷凍珠子，并繼續(xù)混合10分鐘。然后將料漿通過(guò)2_孔針擠出到含有液氮的槽中。然后從液氮中取出串/珠子，置于密封的包有鋁箔的袋子中，在低溫冰箱中在_80°C儲(chǔ)存幾周。對(duì)于干燥來(lái)說(shuō)，將冷凍的串/珠子以1000g/sqft的荷載容量均勻鋪展在托盤上，將托盤置于冷凍干燥器(25SRC型，Virtis，Gardiner,NY)中的架子上，并如實(shí)施例2中所述進(jìn)行干燥。干燥組合物中益生菌的初始CFU計(jì)數(shù)為10.531og/g，在40°C和33%RH的加速儲(chǔ)存條件下儲(chǔ)存42天后的生存力損失為O.691ogCFU/g。實(shí)施例6含有本發(fā)明的干燥制劑的嬰兒配方食品按照實(shí)施例2制備含有乳桿菌屬GG(ValioCorp,芬蘭)的穩(wěn)定干燥制劑，然后篩分成兩個(gè)粒徑組(大于50μm和小于150μm)。通過(guò)將99.9gNutramigen(MeadJohnson;Evansville,IL)與0.Ig粒徑范圍在50μm和150μm之間的干燥制劑粒子混合，制備了嬰兒配方食品。最終產(chǎn)品含有每IOOg嬰兒配方食品約IO8Cfu乳桿菌屬GG。實(shí)施例7含有本發(fā)明的穩(wěn)定干燥制劑的益生菌增補(bǔ)劑將含有嗜酸乳桿菌的穩(wěn)定干燥組合物配制成口服制劑例如片劑、囊片或膠囊。通過(guò)在旋轉(zhuǎn)機(jī)械上使用1/2〃圓形標(biāo)準(zhǔn)凹形工具進(jìn)行直接壓制，制備了含有99.9g壓制劑(右旋糖)和0.Ig粒徑范圍在50μm和150μm之間的干燥制劑粒子的橙味片劑。最終產(chǎn)品含有約IO8Cfu/單位劑量。片劑的硬度在8-10kp范圍內(nèi)，崩解時(shí)間為約20秒。將壓制的片劑以每瓶100片的量包裝在180ccHDPE瓶中，并暴露于40°C/33%RH的受控溫度/濕度下。對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行每月微生物穩(wěn)定性測(cè)試，共進(jìn)行12個(gè)月的時(shí)間或者直至在測(cè)定中觀察到計(jì)數(shù)減少至低于IxlO6/單位劑量。實(shí)施例8含有本發(fā)明的穩(wěn)定干燥制劑的功能性飲料制備了含有(以重量計(jì)的％)71%蔗糖、14%麥芽糖糊精、10%菊粉、2%右旋糖、1%無(wú)水檸檬酸、0.3%阿拉伯膠、0.3%調(diào)味劑、0.3%磷酸三鈣和0.1%粒徑范圍在50μm和250μm之間的干燥益生菌制劑粒子(嗜酸乳桿菌)的干燥混合物。最終產(chǎn)品含有約IO9Cfu/單位劑量(30g干混物)。將產(chǎn)品包裝在小鋁箔袋中(30g單位劑量/袋)，通過(guò)攪拌在340mil水中以供飲用。對(duì)在飲料干混物中的益生菌的穩(wěn)定性進(jìn)行每月微生物穩(wěn)定性測(cè)試，共進(jìn)行12個(gè)月的時(shí)間或者直至在測(cè)定中觀察到計(jì)數(shù)減少至低于IxlO7/單位劑量。實(shí)施例9制備益生菌寵物食品將可商購(gòu)的狗用顆粒寵物食品在對(duì)流烘箱中干燥至水活度為O.1，然后涂覆上按實(shí)施例3所述制備的穩(wěn)定的益生菌干燥制劑。將干燥顆粒噴涂上約5%的基于脂肪的防潮層(40%雞脂、40%可可脂和20%蜂蠟的混合物)，在轉(zhuǎn)鼓中與干粉制劑(通常為寵物食品總量的O.1-0.5%，其提供了108CFU/g的劑量)混合，最后噴涂上另一層基于脂肪的防潮層。涂層的總量為(寵物食品的)約15%。涂覆時(shí)間為約30分鐘。實(shí)施例10制備含有幾種益生微生物的魚飼料用幾種益生菌的混合物制備了本發(fā)明的魚用顆粒飼料。如實(shí)施例I中所述制備含有鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和乳雙歧桿菌的混合物的穩(wěn)定的干燥益生菌制劑。首先將可商購(gòu)的鮭魚用開(kāi)口飼料(ZeiglerBros.,Gardners,PA)在對(duì)流烘箱中干燥至水活度為O.I,然后在轉(zhuǎn)鼓中涂覆上益生菌制劑。首先將顆粒(IOOOg)噴涂上以重量計(jì)約5%的基于脂肪的防潮層(40%魚油、40%可可脂和20%蜂蠟的混合物)，然后與Ig穩(wěn)定的干燥益生菌制劑混合(以獲得107cfu/g飼料的劑量)，最后噴涂上另一層基于脂肪的防潮層。涂層的總量為(魚飼料的)約10%。實(shí)施例11含有酶的穩(wěn)定干粉通過(guò)將600g實(shí)施例4中描述的制劑與400gSavinase(Novozymes,Denmark)在IOOOg水溶液中混合，制備了含有40重量％Savinase的水凝膠制劑。將切碎的水凝膠制劑在液氮中快速冷凍，并在50°C的制劑干燥溫度下在真空烘箱中干燥。為了確定干燥制劑的載量和儲(chǔ)存穩(wěn)定性，準(zhǔn)確稱取(<100mg)干燥樣品至微量離心管中。加入200μI二甲亞砜(DMS0)。通過(guò)渦旋振蕩將制劑溶解在DMSO緩沖液中。向該樣品加入0.8ml含有0.05NNaOH,0.5%SDS和0.075M檸檬酸(三鈉鹽)的溶液。將管在45°C下超聲10分鐘，然后在5，OOOrpm短暫離心10分鐘。取清澈的DMS0/Na0H/SDS/檸檬酸溶液的等份試樣至微孔板的孔中，并使用Bradford測(cè)定方法分析蛋白質(zhì)含量。穩(wěn)定的酶制劑的儲(chǔ)存穩(wěn)定性明顯高于不含本發(fā)明制劑的干燥的酶。實(shí)施例12含有維生素A的穩(wěn)定干粉通過(guò)將320g速溶菊粉、320g麥芽糖糊精DE-I(Tate&Lyle，London，UK)、50g羧甲基纖維素鈉(AshlandAqualonFunctionalIngredients,Wilmington,DE)、IOg抗壞血酸鈉和300g維生素A晶體(BASFCorp.,FlorhamPark，N.J)混合在IOOOg水中，制備了含30重量％維生素A的制劑。將濕制劑在Mobile-Minor噴霧干燥器(GEAProcessEngineeringInc.,ColumbiaMD)中噴霧干燥，其中入口和出口溫度分別為180°C和80°C，或者在液氮中快速冷凍，然后以1000g/Sqft的荷載容量鋪展在托盤上，并如實(shí)施例2中所述干燥。所述維生素A組合物在40°C和75%RH下穩(wěn)定(>80%)3個(gè)月。實(shí)施例13制備在保護(hù)制劑中的生物利用度提高的胡蘿卜素類按照本發(fā)明的制劑和方法制備了保護(hù)并提高胡蘿卜素類的生物利用度的制劑，否則所述胡蘿卜素類在儲(chǔ)存期間或喂給生物體后會(huì)遭受到飼料中其他成分的氧化。將含有6g水溶性殼聚糖的制劑(LSKBioPartners,Inc.SaltLakeCity,Utah)溶解在200g水中。向該溶液加入90g天然奸青素(Naturose,CyanotechCorp.,Kailua-Kona,HI),并將料衆(zhòng)噴霧或擠出到含有5%三聚磷酸鈉的槽中。讓水凝膠化的微?；虼谑覝亟?jīng)4小時(shí)硬化。將粒子從交聯(lián)槽中取出，用水洗漆，并與90g鹿糖和IOg廣泛水解的酪蛋白的干摻混物混合。將荷載有糖/蛋白質(zhì)的粒子快速冷凍，并立即以500g/sqft的荷載容量置于托盤上，在冷凍干燥器中凍干，直到水活度降低到低于O.3。將干燥制劑進(jìn)一步碾磨成所需的粒度分布，并包裝。實(shí)施例14制備攻擊性物種的誘餌按照本發(fā)明制備了用于特異性針對(duì)攻擊性物種的顆粒誘餌。按實(shí)施例I所述制備200g含有殺蟲(chóng)劑的制劑，并加入到200gm水中。向該溶液加入90gm魚藤酮和O.5gm磷酸氫二鈣，然后加入O.5gm葡萄糖酸內(nèi)酯。讓料漿在室溫下經(jīng)2小時(shí)硬化。通過(guò)切片機(jī)/切碎機(jī)將堅(jiān)固的凝膠切成細(xì)且長(zhǎng)的絲。將細(xì)絲荷載在托盤上，并置于冷凍干燥器中。將架子溫度設(shè)定在-30°C并讓制劑冷凍，然后施加完全真空，并將架子溫度升高至+60°C，過(guò)夜干燥。將干燥制劑碾磨成對(duì)于所靶向的特定物種的誘餌尺寸規(guī)格來(lái)說(shuō)適合的粒度分布。實(shí)施例15制備在水不溶性制劑中受保護(hù)的殺蟲(chóng)劑用本發(fā)明的制劑和方法制備了殺蟲(chóng)劑的受保護(hù)的顆粒制劑，否則所述殺蟲(chóng)劑在儲(chǔ)存期間或應(yīng)用到環(huán)境中后將受到制劑中其他成分的分解。向200g水中加入含有6g果膠和102g蔗糖的制劑。向該溶液加入90g含有敏感性殺蟲(chóng)劑的干燥制劑和含有I.5g磷酸氫二鈣和O.5g氯化鈣的混合物，然后加入O.85g葡萄糖酸內(nèi)酯。讓料漿在室溫下經(jīng)4小時(shí)硬化，然后通過(guò)切片機(jī)/切碎機(jī)切成細(xì)且長(zhǎng)的絲。將細(xì)絲荷載在托盤上，在冷凍干燥器中干燥至水活度達(dá)到O.I。將干燥制劑進(jìn)一步碾磨成所需的粒度分布并包裝。實(shí)施例16制備受保護(hù)的植物益生菌制劑按照實(shí)施例4將生物控制劑例如根際細(xì)菌(Rhizobacteria)制備在干燥組合物中。在限菌條件下評(píng)估干燥的根際細(xì)菌組合物對(duì)萵苣生長(zhǎng)的有效性。將每株植物IOOmg根際細(xì)菌干燥組合物的劑量接種到含有沙土的罐中，并種植預(yù)先發(fā)芽(24h)的萵苣苗。向罐中的植物施加5ml無(wú)菌霍格蘭(Hoagland)溶液營(yíng)養(yǎng)劑。將罐隨機(jī)排列在維持在28°C和12小時(shí)光照期的生長(zhǎng)室中。在接種后每隔7天，將植物和附著的沙土小心地從te中取出。將根在無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中清洗，并記錄根長(zhǎng)度的測(cè)量值。參考文獻(xiàn)下面的參考文獻(xiàn)以及本文中引用的所有參考文獻(xiàn)在此為所有目的通過(guò)參考結(jié)合于此。美國(guó)專利文獻(xiàn)6，190，701用于穩(wěn)定的可注射液體的組合物和方法(Compositionandmethodforstableinjectableliquids),1999年3月，Roser等。6，964，771用于在干燥、發(fā)泡的玻璃基質(zhì)中穩(wěn)定地?fù)饺胛镔|(zhì)的方法(Methodforstablyincorporatingsubstanceswithindry,foamedglassmatrices)，1997年9月，Roser等。5，766，520通過(guò)形成制劑進(jìn)行保存(Preservationbyformulationformation),1998年6月，Bronshtein。6，534，087用于制備藥物組合物的方法(Processforpreparingapharmaceuticalcomposition),2001年6月，Busson和Schroeder06，884，866大體積干燥和誘導(dǎo)氣泡成核的效果(Bulkdryingandtheeffectsofinducingbubblenucleation)，2005年4月，Bronshtein。7，153，472用于在疏水性載體中儲(chǔ)存和遞送的生物活性材料的保存和制劑(Preservationandformulationofbioactivematerialsforstorageanddeliveryinhydrophobiccarriers)，2006年12月，Bronshtein。20080229609通過(guò)汽化進(jìn)行保存(PreservationbyVaporization)，2005年6月，Bronshtein。6，306，345用于在環(huán)境溫度下保存敏感性生物材料的工業(yè)規(guī)模屏障技術(shù)(Industrialscalebarriertechnologyforpreservationofsensitivebiologicalmaterialsatambienttemperatures)，2001年10月，Bronshtein等。7381425通過(guò)冷凍干燥的泡沫保存生物活性材料(Preservationofbioactivematerialsbyfreezedriedfoam)，2006年9月，Truong-le，Vu0其他參考文獻(xiàn)Morgan,C.A.，Herman,N.，White,P.A.，VeseyjG.2006.“通過(guò)干燥保存微生物，綜述”(Preservationofmicro-organismsbydrying;areview),J.Microbiol.Methods.66(2):183-93。Capela，P.，Hay，T.K.C，&Shah，N.P.2006.“低溫保護(hù)劑、益生元和微囊化對(duì)酸奶和冷凍干燥的酸奶中的益生有機(jī)體的存活力的影響”(Effectofcryoprotectants，prebioticsandmicroencapsulationonsurvivalofprobioticorganismsinyoghurtandfreeze-driedyoghurt),FoodResearchInternational,39(3)203-211。Annearj1962.“通過(guò)從液體狀態(tài)干燥來(lái)保存鉤端螺旋體”(ThePreservationofLeptospiresbyDryingFromtheLiquidState)，J.Gen.Microbiol，27:341-343。Crowe,J.F.，Carpenter,J.F.和Crowe,LM_1998.“玻璃化在低濕休眠中的作用”(THEROLEOFVITRIFICATIONINANHYDR0BI0SIS)，Annu.Rev.Physiol.60:73-103。權(quán)利要求1.組合物，其包含生物活性材料、至少ー種基質(zhì)形成劑和至少兩種玻璃形成劑。2.權(quán)利要求I的組合物，其中組合物是包含生物活性材料的干燥玻璃質(zhì)組合物。3.權(quán)利要求I的組合物,其中制劑包含在約30重量％至約70重量％范圍內(nèi)的總固體。4.權(quán)利要求I的組合物，其中生物活性材料包括細(xì)胞、微生物、病毒、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)菌、益生菌、植物和土壤益生菌、酵母、蛋白質(zhì)、重組蛋白質(zhì)、酶、肽、激素、疫苗、藥物、抗生素、維生素、類胡羅卜素、礦物質(zhì)、殺微生物劑、殺真菌劑、除草劑、殺蟲(chóng)劑或殺精子劑。5.權(quán)利要求I的組合物，其中基質(zhì)形成劑是選自下列的多糖こ酸鄰苯ニ甲酸纖維素(CAP)、羧甲基纖維素、果膠、藻酸鈉、藻酸的鹽、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、甲基纖維素、卡拉膠、瓜爾膠、阿拉伯膠、黃原膠、刺槐豆膠、殼聚糖和殼聚糖衍生物、淀粉和改性淀粉、環(huán)糊精、菊粉、麥芽糖糊精、葡聚糖、及其組合。6.權(quán)利要求I的組合物，其中基質(zhì)形成劑以約I重量％至約20重量％范圍內(nèi)的量存在于制劑中。7.權(quán)利要求I的組合物，其中玻璃形成劑易于溶解在溶液中，在與水接觸后不變稠或聚合，并且在干燥期間不形成晶體。8.權(quán)利要求I的組合物，其中玻璃形成劑是蛋白質(zhì)，例如人血清白蛋白和牛血清白蛋白、卵清蛋白、明膠、免疫球蛋白、分離的大豆蛋白、小麥蛋白、脫脂奶粉、酪蛋白酸鹽、乳清蛋白、豌豆蛋白、和任何蛋白水解物；糖類，包括單糖(半乳糖、D-甘露糖、山梨糖等)、ニ糖包括乳糖、海藻糖、蔗糖等；氨基酸，例如賴氨酸、谷氨酸ー鈉、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸或組氨酸以及疏水性氨基酸(色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等)；甲基胺類例如甜菜堿；多元醇例如三元以上糖醇，例如甘油、赤蘚糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇和異麥芽酮糖醇；丙ニ醇；聚こニ醇；表面活性剤，例如糖脂肪酸酯和磷脂類例如卵磷脂；及其組合。9.權(quán)利要求I的組合物,其中玻璃形成劑以約I重量％至約80重量％范圍內(nèi)的量存在于制劑中。10.用于制備權(quán)利要求I的穩(wěn)定干粉制劑的方法，所述方法包括將生物活性材料、基質(zhì)形成劑和兩種玻璃形成劑在水性溶劑中組合以形成粘性料漿；在液氮中快速冷凍料漿以形成固體冷凍珠、小滴或串；在真空和低于制劑的冷凍點(diǎn)的溫度下對(duì)固體冷凍粒子驅(qū)氣；在真空下、在高于制劑冷凍溫度的制劑溫度下通過(guò)蒸發(fā)來(lái)進(jìn)行的制劑的初級(jí)液體干燥步驟；將制劑在完全真空和20°c以上的溫度下進(jìn)行ニ級(jí)干燥，ニ級(jí)干燥的時(shí)間足以將制劑的水活度降低至Aw為O.3以下。11.制備權(quán)利要求I的組合物的方法，所述方法包括制備包含生物活性材料、至少ー種基質(zhì)形成劑和至少兩種玻璃形成劑的粘性料漿；在液氮中快速冷凍料漿，以形成串、小滴、珠或微珠形式的冷凍粒子的無(wú)定形結(jié)構(gòu)；將冷凍粒子上的壓カ降低至低于2000mT0RR，持續(xù)時(shí)間小于30分鐘；將壓カ升高至超過(guò)2000mT0RR，并從20°C加熱至70°C以加速制劑的脫水。12.權(quán)利要求11的方法，其中在干燥之前將組合物快速冷凍至低于其冷凍溫度的溫度。13.權(quán)利要求11的方法，其中通過(guò)蒸發(fā)來(lái)進(jìn)行初級(jí)干燥。14.權(quán)利要求11的方法，其中通過(guò)凍干來(lái)進(jìn)行初級(jí)干燥。15.權(quán)利要求11的方法，其中通過(guò)提高溫度和/或真空壓カ使ニ級(jí)干燥步驟加速。16.權(quán)利要求11的方法，其中干燥制劑的時(shí)間足以將制劑降低至Aw為O.3以下的水活度。17.權(quán)利要求11的方法，其中將干燥制劑切碎、壓碎、碾磨或分別粉碎成自由流動(dòng)的粉齊。18.權(quán)利要求17的方法，其中干燥制劑的粒徑小于約1000μm。19.權(quán)利要求11的方法，其還包括將制劑作為復(fù)溶的液體或作為研磨的粉劑以及作為食品或飼料產(chǎn)品施用于動(dòng)物和植物。20.權(quán)利要求11的方法，其還包括將制劑與選自嬰兒配方食品、功能性飲料和寵物食品的組分混合；以及施用于人類嬰兒、成人、動(dòng)物或植物。全文摘要本發(fā)明涉及用于在苛刻的儲(chǔ)存和使用條件下穩(wěn)定和保護(hù)生物材料的制劑和方法，其中所述制劑涉及包埋在保護(hù)性玻璃質(zhì)基質(zhì)中的生物活性材料和生物制品，包括活細(xì)菌。文檔編號(hào)C12N1/00GK102725393SQ201180007562公開(kāi)日2012年10月10日申請(qǐng)日期2011年1月28日優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日發(fā)明者加努阿里·斯卡伯勒,羅杰·德魯斯,莫迪·哈勒爾申請(qǐng)人:先進(jìn)生物營(yíng)養(yǎng)公司