專(zhuān)利名稱(chēng)：轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于制作轉(zhuǎn)化厭氧菌的、具有包含在厭氧菌中發(fā)揮功能的分泌信號(hào)肽的表達(dá)盒且為非穿梭質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，所述轉(zhuǎn)化厭氧菌作為實(shí)體瘤等缺氧疾病治療用基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是有用的。此外，本發(fā)明涉及包含由用該轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的厭氧菌構(gòu)成的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體、含有該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的藥物組合物和含有該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的缺氧疾病治療劑。進(jìn)而，本發(fā)明還涉及對(duì)制作該缺氧疾病治療用轉(zhuǎn)化厭氧菌有用的、包含編碼新的分泌信號(hào)肽的堿基序列的DNA片段。
背景技術(shù)：
近些年來(lái)，治療惡性腫瘤的方法中，將轉(zhuǎn)化厭氧菌用作基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的方法已經(jīng) 引起了注意，例如，已經(jīng)提出了使用轉(zhuǎn)化的梭菌(Clostridium)將能把抗腫瘤物質(zhì)前藥轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的酶的硝基還原酶的表達(dá)基因轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤位置的方法等(參見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)I至3)。進(jìn)而，還在討論用侵襲性厭氧菌例如沙門(mén)氏菌、腸侵襲性大腸桿菌、李斯特菌(Listeria)、志賀氏菌(ShigelIa)等，通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞的RNA干擾(RNAinterfering,RNAi)，轉(zhuǎn)運(yùn)能消滅與缺氧疾病因子有關(guān)的基因或阻礙其表達(dá)的核酸(siRNAs ;小型干擾RNAS (small interfering RNAs)、短鏈干擾 RNAS (short interfering RNAs)或小發(fā)夾RNAS (short hairpin RNAs))的表達(dá)基因的方法(參見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)4至6)。但是，這些微生物都是將致病菌變異為低毒性的微生物，不能否認(rèn)其有可能進(jìn)行反向變異而恢復(fù)為原來(lái)的致病菌，發(fā)揮有害性，進(jìn)而，由于局域運(yùn)動(dòng)性、侵襲性，因此不僅在疾病組織而且在正常組織也發(fā)揮作用，可能產(chǎn)生全身性的副作用癥狀等，存在安全性方面的問(wèn)題。本發(fā)明人等著眼于存在于人腸道內(nèi)而形成菌群的非致病性的腸內(nèi)細(xì)菌、已知是極其安全的兼性厭氧性細(xì)菌的雙歧桿菌，開(kāi)發(fā)了使用該雙歧桿菌的轉(zhuǎn)化體菌的惡性腫瘤的治療方法。于是，開(kāi)發(fā)了轉(zhuǎn)化了的長(zhǎng)雙歧桿菌105A，使得其表達(dá)能將5-氟尿嘧啶(以下稱(chēng)為5-FU)的前藥5-氟胞嘧啶(以下稱(chēng)為5-FC)轉(zhuǎn)變?yōu)?-FU的酶一胞嘧啶脫氨酶(以下稱(chēng)為⑶)(參見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)7、8)。該轉(zhuǎn)化體雙歧桿菌具有在將其通過(guò)靜脈內(nèi)的方式給予實(shí)體瘤動(dòng)物模型時(shí)，在低氧狀體的缺氧疾病組織中特異性地建群、增殖，而在沒(méi)有缺氧環(huán)境下的正常組織中迅速消失的特點(diǎn)。(參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)1、2)進(jìn)而，該轉(zhuǎn)化體雙歧桿菌還具有即時(shí)靜脈給藥時(shí)也不顯示抗原性的特點(diǎn)，可以期待其作為極其優(yōu)異的惡性腫瘤治療劑。這些轉(zhuǎn)化體雙歧桿菌由于是使用大腸桿菌一雙歧桿菌的穿梭質(zhì)粒pBLES100-S-eCD、pAVOO I-HU-eCD_M968等被轉(zhuǎn)化，因此橫向轉(zhuǎn)移到大腸桿菌時(shí)，可能在該大腸桿菌中復(fù)制。為了解決該課題，本發(fā)明人等進(jìn)行了質(zhì)粒的改良，開(kāi)發(fā)了不具有在大腸桿菌中發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)的非穿梭質(zhì)粒pBifiCD (參照專(zhuān)利文獻(xiàn)9)。另一方面，這些非穿梭質(zhì)粒由于不具有分泌信號(hào)，這些轉(zhuǎn)化體雙歧桿菌沒(méi)能將表達(dá)了的CD分泌到菌體外。因此，需要開(kāi)發(fā)在雙歧桿菌中發(fā)揮功能，可以將表達(dá)蛋白等分泌到菌體外的分泌信號(hào)肽。作為雙歧桿菌的分泌蛋白，報(bào)道了例 如青春雙歧桿菌的淀粉酶、短雙歧桿菌的SeCl、SeC2、SeC3等，還報(bào)道了導(dǎo)入有這些分泌信號(hào)的質(zhì)粒。例如，報(bào)道了導(dǎo)入有青春雙歧桿菌的淀粉酶的分泌信號(hào)肽基因的、用大腸桿菌一雙歧桿菌的穿梭質(zhì)粒pYBamy59轉(zhuǎn)化了的長(zhǎng)雙歧桿菌MGl。(參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)另外，還報(bào)道了導(dǎo)入有短雙歧桿菌SeC2的分泌信號(hào)肽和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 (FGF2)的融合基因的、用大腸桿菌一雙歧桿菌的穿梭質(zhì)粒pESH86、pESH87等轉(zhuǎn)化了的短雙歧桿菌UCC2003等。(參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)另外，還報(bào)道了包含來(lái)自雙歧桿菌屬細(xì)菌的啟動(dòng)子以及信號(hào)序列、特別是BL1181基因產(chǎn)物的信號(hào)或aMyB基因產(chǎn)物的信號(hào)序列的表達(dá)盒，實(shí)際上確認(rèn)了在短雙歧桿菌以及長(zhǎng)雙歧桿菌中表達(dá)蛋白的顯著的分泌(專(zhuān)利文獻(xiàn)10)。但是，上述的質(zhì)粒均為大腸桿菌-雙歧桿菌的穿梭質(zhì)粒，而對(duì)于如本發(fā)明這樣的、是不具有在大腸桿菌中發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)的非穿梭質(zhì)粒且具有在雙歧桿菌中發(fā)揮功能的分泌信號(hào)的質(zhì)粒，還是未知的。另外，這些分泌信號(hào)都還不明確是否在確認(rèn)了的菌株以外的菌株中發(fā)揮功能，推測(cè)轉(zhuǎn)化了的菌的目的蛋白的分泌量也少。因此，期待開(kāi)發(fā)出可以發(fā)揮優(yōu)異的分泌功能的、實(shí)用性高的分泌信號(hào)肽?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)I:美國(guó)專(zhuān)利第6416754號(hào)專(zhuān)利文獻(xiàn)2:美國(guó)專(zhuān)利第6652849號(hào)專(zhuān)利文獻(xiàn)3:美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2003/0103952號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)4:日本特表2008 — 519002號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)5:日本特開(kāi)2008 — 92956號(hào)公報(bào)；國(guó)際公開(kāi)W02006 — 066048號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)6:國(guó)際公開(kāi)W02008 — 091375號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)7:日本特開(kāi)2002-97144號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)8:國(guó)際公開(kāi)WO 2007-136107號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)9:國(guó)際公開(kāi)W02009 — 128272號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)10:國(guó)際公開(kāi)WO 2010 — 126073號(hào)公報(bào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)I: Yazawa et al, Cancer Gene Ther.，7，269-274 (2000)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2:Yazawa et al. , Breast Cancer Res. Treat. , 66, 165-170 (2001)非專(zhuān)利文獻(xiàn)3:Seong et al. , Biotechnology Letters, 2006, Vol. 28:pp 163-168非專(zhuān)利 文獻(xiàn) 4 : Shkoporov et al. , BiotechnologyLetters, 2008Vol. 30:ppl983_1988
發(fā)明概述技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的課題是提供用于制作轉(zhuǎn)化厭氧菌的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒、用該轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的轉(zhuǎn)化厭氧菌、包含該轉(zhuǎn)化厭氧菌的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體、含有該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的藥物組合物以及含有該轉(zhuǎn)化厭氧菌的缺氧疾病治療劑，所述轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒是具有在厭氧菌中發(fā)揮功能的分泌信號(hào)且不具有在該厭氧菌以外的菌中發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)的非穿梭質(zhì)粒。另外，本發(fā)明的另一個(gè)課題是，提供包含由該轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的轉(zhuǎn)化厭氧菌的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體、含有該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的藥物組合物以及含有該耐性菌的缺氧疾病治療劑。再另外，本發(fā)明的另一個(gè)課題是，提供在例如長(zhǎng)雙歧桿菌105A等中發(fā)揮功能的新的分泌信號(hào)。問(wèn)題解決方法 本發(fā)明人等，之前，制作了插入有表達(dá)具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白中的⑶的基因的質(zhì)粒pBLES100-S-e⑶、pAV001-HU-era_M968等。發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了 使用其重組的專(zhuān)性厭氧菌，例如長(zhǎng)雙歧桿菌105A / pBLESlOO-S-e⑶、長(zhǎng)雙歧桿菌105A / pAV001-HU-e⑶-M968等可以期待作為有用的惡性腫瘤的治療劑。(專(zhuān)利文獻(xiàn)7、8)上述專(zhuān)利文獻(xiàn)7、8的轉(zhuǎn)化菌的制作中所用的質(zhì)粒pBLES100-S-e⑶和pAVOOl-HU-eCD-M968均是大腸桿菌一雙歧桿菌的穿梭質(zhì)粒，因此其橫向轉(zhuǎn)移到大腸桿菌時(shí)，可能在該大腸桿菌中被復(fù)制。但是，使用轉(zhuǎn)化基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的實(shí)體瘤的治療方法中，非常重要的是，所用的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的轉(zhuǎn)化基因不向該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體以外的、致病菌或好氧性或者兼性厭氧菌橫向轉(zhuǎn)移，進(jìn)而即使發(fā)生了橫向轉(zhuǎn)移也不在該菌中復(fù)制。因此，需要不具有轉(zhuǎn)化菌以外的菌中發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)的、即在轉(zhuǎn)化菌以外的菌中不相互復(fù)制的非穿梭質(zhì)粒。本發(fā)明者人等為了解決該課題，進(jìn)行了質(zhì)粒的改良，開(kāi)發(fā)出了不具有在大腸桿菌中發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)的非穿梭質(zhì)粒pBifiCD。(專(zhuān)利文獻(xiàn)9)另一方面，這些質(zhì)粒由于都是不具有分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，因此使用其重組的轉(zhuǎn)化菌不將表達(dá)的CD分泌到菌體外，CD表達(dá)量不直接反映CD酶活性、即藥效的問(wèn)題依然存在。進(jìn)而，在不是CD這樣的將前藥轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的酶而是產(chǎn)生抗腫瘤性蛋白、核酸等的菌的情況下，需要使所產(chǎn)生的抗腫瘤物質(zhì)放出到菌體外，因此，需要在缺氧疾病組織中增殖后，殺死破壞菌。因此得出結(jié)論具有在專(zhuān)性厭氧菌、特別是雙歧桿菌中發(fā)揮功能的分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒是更好的。于是進(jìn)行潛心研究，從而完成了本發(fā)明。SP，本發(fā)明涉及〈1>轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，是用于制作轉(zhuǎn)化厭氧菌的質(zhì)粒，其具有包含在厭氧菌中發(fā)揮功能的分泌信號(hào)的表達(dá)盒，并且是非穿梭質(zhì)粒。<2>如〈1>所述的質(zhì)粒，其中厭氧菌是雙歧桿菌。〈3>如〈1>或〈2>所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中分泌信號(hào)肽來(lái)自雙歧桿菌。<4>如〈3>所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中分泌信號(hào)肽來(lái)自長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)。<5>如<1>至〈4>中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中分泌信號(hào)是由序列號(hào)6 28的堿基序列或其序列的I個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或增添后的序列的任一種所示的DNA。〈6>如〈5>所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中分泌信號(hào)是由序列號(hào)6、7、8、9、12、14、15、17、21、25或28的堿基序列或其序列的I個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或增添后的序列。<7>如〈6>所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中分泌信號(hào)是由序列號(hào)8或25的堿基序列的任一種所示的DNA或其單核苷酸多態(tài)性?！?>如〈1>至〈7>中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中編碼表達(dá)盒所含的啟動(dòng)子的基因是由序列號(hào)29 44的啟動(dòng)子區(qū)域的堿基序列或者序列號(hào)45的堿基序列或其序列的I個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或增添后的序列的任一種所示的DNA。<9>如〈8>所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中表達(dá)盒所含的啟動(dòng)子基因是由序列號(hào)35的啟動(dòng)子區(qū)域的堿基序列或者序列號(hào)45的堿基序列或其序列的I個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或增添后的序列的任一種所示的DNA。
<10>如〈1>至〈9>中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中表達(dá)盒所含的終止子基因是由序列號(hào)46的堿基序列或其序列的I個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或增添后的序列的任一種所示的DNA。〈11>如〈1>至〈10>中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中表達(dá)盒所含的靶基因是編碼突光蛋白的基因。<12>如<1>至〈10>中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中表達(dá)盒所含的靶基因是編碼具有抗腫瘤活性的蛋白的基因。<13>如〈12>所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中具有抗腫瘤活性的蛋白是選自干擾素(IFN)-a、IFN-β、IFN-Y、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-Ia、IL-I β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、腫瘤壞死因子(TNF)-a、淋巴毒素(LT)-i3、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)、白血病抑制因子(LIF)、T細(xì)胞活化共刺激因子B7 (⑶80)和B7-2 (⑶86)、KIT配體、制瘤素M等細(xì)胞因子，以及內(nèi)皮抑制素、血管抑制素(angiostatin)、三環(huán)(kringle) I、三環(huán)2、三環(huán)3、三環(huán)4、三環(huán)5等血管發(fā)生抑制物質(zhì)中的一種。<14>如〈13>所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中具有抗腫瘤活性的蛋白是腫瘤壞死因子(TNF)-Q或腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)中的任一者。<15>如〈1>至〈10>中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中靶基因是是編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白的基因。<16>如〈15>所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白是選自胞嘧啶脫氨酶、硝基還原酶和β_葡糖醛酸糖苷酶中的一種。<17〉如<1>至〈10>中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中靶基因是是編碼具有缺血性疾病治療活性的蛋白的基因。<18>如<17〉所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中具有缺血性疾病治療活性的蛋白是選自成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 (FGF2)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)等具有血管生成促進(jìn)活性的蛋白中的一種。<19>如〈1>至〈10>中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中靶基因是是具有缺氧疾病治療活性的核酸。
<20>如〈19>所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中具有缺氧疾病治療活性的核酸是與選自成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 (FGF2)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)等中的至少一種腫瘤細(xì)胞增殖因子有關(guān)的siRNAs。<21>如<1>至〈20>中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒(pBifi-SP3B_TNF alpha),其包含由序列號(hào)5的堿基序列或其序列的I個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或增添后的序列的任一種所示的DNA序列。<22>基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，包含用〈1>至〈21>中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化厭氧菌。<23>如〈22>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中所述厭氧菌是非致病性的腸內(nèi)細(xì)菌?！?4>如〈22>或〈23>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中所述厭氧菌是雙歧桿菌。 <25>如〈24>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中所述雙歧桿菌是選自青春雙歧桿菌、埃氏雙岐桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、星狀雙歧桿菌、雙歧雙歧桿菌、牛雙歧桿菌、短雙歧桿菌、鏈狀雙歧桿菌、小豬雙歧桿菌、棒狀雙歧桿菌、兔雙歧桿菌、寓齒雙歧桿菌、齒雙歧桿菌、沒(méi)食子雙歧桿菌、雞腸雙歧桿菌、球雙歧桿菌、印度雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、奇異雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌、自由雙歧桿菌(Bifidobacterium liberorum)、長(zhǎng)雙歧桿菌、大雙歧桿菌、瘤胃雙歧桿菌、最小雙歧桿菌、摩恩格里艾恩斯雙歧桿菌(Bifidobacteriummongoliense)、微小粒雙歧桿菌(Bifidobacterium parvulorum)、假小鏈雙歧桿菌、假長(zhǎng)雙歧桿菌、薩伊庫(kù)拉埃羅胡拉姆雙歧桿菌(Bifidobacterium psychroaerophilum)、小雞雙歧桿菌、瘤胃雙歧桿菌、反芻雙歧桿菌、波倫亞雙歧桿菌、蘇卡魯?shù)谰S伊雙歧桿菌(Bifidobacterium scardovii )、細(xì)長(zhǎng)雙歧桿菌、豬雙歧桿菌、薩瑪茨德胡拉姆雙歧桿菌(Bifidobacterium thermacidophilum)和嗜熱雙歧桿菌中的 I 種。<26>如〈25>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中所述雙歧桿菌是長(zhǎng)雙歧桿菌。<27>如〈22>至〈26>中任一項(xiàng)所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，它能夠在缺氧環(huán)境中的腫瘤組織中生長(zhǎng)，并且能夠表達(dá)、分泌至少一種對(duì)缺氧疾病的診斷或治療有用的蛋白或核酸。<28>如〈27>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中對(duì)缺氧疾病的診斷有用的蛋白是熒光蛋白。<29>如〈27>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中對(duì)缺氧疾病的治療有用的蛋白是具有抗腫瘤活性的蛋白?！?0>如〈28>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中具有抗腫瘤活性的蛋白是選自干擾素(IFN)-a、IFN-β、IFN-Y、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-I α、IL-I β、IL-2、IL-3、IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18、腫瘤壞死因子(TNF)-a、淋巴毒素(LT)-i3、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)、白血病抑制因子(LIF)、T細(xì)胞活化共刺激因子B7 (⑶80)和B7-2 (⑶86)、KIT配體、制瘤素M等細(xì)胞因子，以及內(nèi)皮抑制素、血管抑制素(angiostatin)、三環(huán)(kringle) I、三環(huán)2、三環(huán)3、三環(huán)4、三環(huán)5等血管發(fā)生抑制物質(zhì)中的一種。<31>如〈27>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中對(duì)缺氧疾病的治療有用的蛋白是具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白。<32>如〈31>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白是選自胞嘧啶脫氨酶、硝基還原酶和葡糖醛酸糖苷酶中的I種。
〈33>如〈27>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中對(duì)缺氧疾病的治療有用的核酸是與缺氧疾病因子有關(guān)的siRNAs。<34>如〈33>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中與缺氧疾病因子有關(guān)的siRNAs是與選自成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 (FGF2)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)等中的至少一種腫瘤細(xì)胞增殖因子有關(guān)的siRNAs?！?5>藥物組合物，包含〈22>至〈34>中任一項(xiàng)所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體?！?6>編碼來(lái)自長(zhǎng)雙歧桿菌的分泌信號(hào)肽的DNA。<37>如〈36>所述的編碼分泌信號(hào)肽的DNA，其包含由序列號(hào)6 28的堿基序列或其序列的I個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或增添后的序列的任一種所示的DNA序列?！?8>由〈36>或〈37>所述的DNA編碼的分泌信號(hào)肽。
<39>包含〈36>或〈37>所述的DNA的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒。<40>如〈39>所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，它進(jìn)一步包含編碼對(duì)缺氧疾病的診斷或治療有用的蛋白或核酸的DNA。<41>如〈40>所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中對(duì)缺氧疾病的診斷有用的蛋白是熒光蛋白?！?2>如〈40>所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中對(duì)缺氧疾病的治療有用的蛋白是具有抗腫瘤活性的蛋白。<43>如〈42>所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中具有抗腫瘤活性的蛋白是選自干擾素(IFN)-a、IFN-β、IFN-Y、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-Ia、IL-I β、IL-2、IL-3、IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18、腫瘤壞死因子(TNF)-a、淋巴毒素(LT)-i3、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)、白血病抑制因子(LIF)、T細(xì)胞活化共刺激因子B7 (CD80)和B7-2 (⑶86)、KIT配體、制瘤素M等細(xì)胞因子，以及內(nèi)皮抑制素、血管抑制素(angiostatin)、三環(huán)(kringle) I、三環(huán)2、三環(huán)3、三環(huán)4、三環(huán)5等血管發(fā)生抑制物質(zhì)中的一種。<44>如〈40>所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中對(duì)缺氧疾病的治療有用的蛋白是具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白。<45>如〈44>所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白是選自胞嘧啶脫氨酶、硝基還原酶和β_葡糖醛酸糖苷酶中的I種。<46>如〈40>所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中對(duì)缺氧疾病的治療有用的核酸是與缺氧疾病因子有關(guān)的siRNAs。<47>如〈46>所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中與缺氧疾病因子有關(guān)的siRNAs是與選自成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 (FGF2)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)等中的至少一種腫瘤細(xì)胞增殖因子有關(guān)的siRNAs。<48>基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其為用〈39>至〈47>中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的厭氧菌。<49>如〈48>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中所述厭氧菌是雙歧桿菌。〈50>如〈49>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中所述雙歧桿菌是選自青春雙歧桿菌、埃氏雙岐桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、星狀雙歧桿菌、雙歧雙歧桿菌、牛雙歧桿菌、短雙歧桿菌、鏈狀雙歧桿菌、小豬雙歧桿菌、棒狀雙歧桿菌、兔雙歧桿菌、寓齒雙歧桿菌、齒雙歧桿菌、沒(méi)食子雙歧桿菌、雞腸雙歧桿菌、球雙歧桿菌、印度雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、奇異雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌、自由雙歧桿菌(Bifidobacterium liberorum)、長(zhǎng)雙歧桿菌、大雙歧桿菌、瘤胃雙歧桿菌、最小雙歧桿菌、摩恩格里艾恩斯雙歧桿菌(Bifidobacteriummongoliense)、微小粒雙歧桿菌(Bifidobacterium parvulorum)、假小鏈雙歧桿菌、假長(zhǎng)雙歧桿菌、薩伊庫(kù)拉埃羅胡拉姆雙歧桿菌(Bifidobacterium psychroaerophilum)、小雞雙歧桿菌、瘤胃雙歧桿菌、反芻雙歧桿菌、波倫亞雙歧桿菌、蘇卡魯?shù)谰S伊雙歧桿菌(Bifidobacterium scardovii)、細(xì)長(zhǎng)雙歧桿菌、豬雙歧桿菌、薩瑪茨德胡拉姆雙歧桿菌(Bifidobacterium thermacidophilum)和嗜熱雙歧桿菌中的 I 種。<51>如〈50>所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中所述雙歧桿菌是長(zhǎng)雙歧桿菌。<52>藥物組合物，包含〈48>至〈51>中任一項(xiàng)所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體。發(fā)明的效果本發(fā)明的質(zhì)粒具有具有分泌信號(hào)的表達(dá)盒且是非穿梭質(zhì)粒，是對(duì)于制作實(shí)體瘤等 缺氧疾病治療用轉(zhuǎn)化厭氧菌來(lái)說(shuō)有用的新型質(zhì)粒。本發(fā)明的質(zhì)粒不具有在轉(zhuǎn)化菌以外菌中發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)，是在轉(zhuǎn)化菌以外的菌中不相互復(fù)制的非穿梭質(zhì)粒，因此是非常安全的載體。用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的厭氧菌進(jìn)行缺氧疾病組織特異性地建群、增殖，在該疾病組織，可以產(chǎn)生、分泌具有缺氧疾病治療活性的蛋白或核酸，作為缺氧疾病治療劑是非常有用的，可以期待其成為高品質(zhì)的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體。進(jìn)而，本發(fā)明的新型分泌信號(hào)，如上所述，除了插入到質(zhì)粒中以外，通過(guò)將其直接組入?yún)捬蹙幕蚪M，也可以制作對(duì)缺氧疾病治療有用的、轉(zhuǎn)化厭氧菌。


[圖I]圖I是表示分泌型GFP表達(dá)質(zhì)粒(pSPxA-GFP)的構(gòu)建概要的工序圖。[圖2]圖2是表示分泌型GFP表達(dá)質(zhì)粒(pSPxB_GFP)的構(gòu)建概要的工序圖。[圖3]圖3是表示分泌型GFP表達(dá)質(zhì)粒(pSec2_GFP)的構(gòu)建概要的工序圖。[圖 4]圖 4 是表示 B. longum 105A/pSP3B_GFP、B. longuml05A/pSP7B_GFP、B. longum 105A/pSP23B_GFP、B. longum 105A/pSP7A_GFP 以及 B. longum 105A/pSec2_GFP的免疫印跡的結(jié)果的圖。圖中，C表示細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)提取物的條帶，T表示培養(yǎng)上清濃縮物的條帶，縱軸的數(shù)值表示分子量(kDa)。[圖5]圖5是表示分泌型TNFα表達(dá)質(zhì)粒(pSPxA-TNF alpha)的構(gòu)建概要的工序圖。[圖6]圖6是表示分泌型TNFα表達(dá)質(zhì)粒(pSPxB_TNF alpha)的構(gòu)建概要的工序圖。[圖7]圖7是表示分泌型TNFa表達(dá)質(zhì)粒(pSec2_TNFalpha)的構(gòu)建概要的工序圖。[圖 8]圖 8 是表示 B. longum 105A/pSPlB_TNF alpha、B. longuml05A/pSP3B_TNFalpha、B. longum 105A/pSP4B_TNF alpha、B. longuml05A/pSP7B_TNF alpha、B. longum105A/pSP12B-TNF alpha、B. longuml05A/pSP16B-TNF alpha、B. longum 105A/pSP23B_TNFalpha、B. longuml05A/pSP7A_TNF alpha 以及 B. longum 105A/pSec2_TNF alpha 的免疫印跡的圖。圖中、C表示細(xì)胞內(nèi)蛋白提取物的條帶，T表示培養(yǎng)上清濃縮物的條帶，S表示培養(yǎng)上清的條帶，縱軸的數(shù)值表示分子量(kDa)。[圖9]圖9是表不B.longum 105A以及B. longum 105A/pTNF3的免疫印跡結(jié)果的圖。縱軸的數(shù)值表示分子量(kDa)。[圖10]圖10是表示質(zhì)粒pBifi-SP3B_TNFalpha構(gòu)建的概要的工序圖。[圖 11]圖 11 是表不 Bifidobacterium longum IO 5A/pB i f i SP3B-TNF alpha 乃免疫印跡的圖。條帶I的分子量標(biāo)準(zhǔn)從下往上分別是20、30、40、50、60以及80kDa。[圖12]圖12是表示TNFa表達(dá)質(zhì)粒(pTNF3)的構(gòu)建概要的工序圖。[圖13]圖13是表示具有不含插入物的蛋白表達(dá)單元的mock質(zhì)粒(pBEshuttle)的構(gòu)建概要的工序圖。
[圖14]圖14是表示TNFα的細(xì)胞毒性試驗(yàn)的結(jié)果的曲線(xiàn)圖。[圖15]圖 15 是表示分泌型 TNFa 表達(dá)質(zhì)粒 B. longum 105A/pSP3B_TNFalpha 以及B. breve/pSP3B-TNF alpha的、小鼠的in vivo抗腫瘤效果測(cè)定實(shí)驗(yàn)中的腫瘤體積的經(jīng)日變化的結(jié)果的曲線(xiàn)圖。[圖16]圖 16 是表示分泌型 TNF α 表達(dá)質(zhì)粒 B. longum 105A/pSP3B_TNFalpha 的、阿霉素并用下的小鼠的in vivo抗腫瘤效果測(cè)定實(shí)驗(yàn)中的腫瘤體積的經(jīng)日變化的結(jié)果的曲線(xiàn)圖。[圖17]圖17是表示非分泌型人類(lèi)IL一 18表達(dá)質(zhì)粒phIL18mut_His的構(gòu)建概要的工序圖。[圖18]圖18是表示分泌型人類(lèi)IL一 18表達(dá)質(zhì)粒pSP3B_hIL18mut的構(gòu)建概要的工序圖。本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)中所說(shuō)的非穿梭質(zhì)粒的意思是，具有僅在轉(zhuǎn)化對(duì)象的厭氧菌中發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)、不具有在其以外的菌中發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)、在轉(zhuǎn)化厭氧菌和轉(zhuǎn)化厭氧菌以外的菌中不相互復(fù)制的質(zhì)粒。本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)中所說(shuō)的分泌信號(hào)的意思是，包含編碼分泌信號(hào)肽的堿基序列的DNA片段(有時(shí)也簡(jiǎn)稱(chēng)為分泌信號(hào)肽基因)。本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)中，編碼具有抗腫瘤活性的蛋白的DNA、編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白的DNA、以及編碼具有缺血性疾病治療活性的蛋白的DNA等，有時(shí)也稱(chēng)為“編碼目的蛋白的DNA”。本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)中所說(shuō)的“siRNAs”包括被稱(chēng)作小型干擾RNA (small interferingRNA)或短鏈干擾RNA (short interfering RNA)的siRNA以及、在祀細(xì)胞內(nèi)被切割酶(Dicer)等酶切斷而成為siRNA的短鏈發(fā)夾RNA (short hairpin RNA、SHRNA)。另外，有時(shí)也包括siRNA修飾體和siRNA復(fù)合體而進(jìn)行總稱(chēng)。本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)中所說(shuō)的“表達(dá)盒”是指包含啟動(dòng)子、編碼表達(dá)蛋白的基因(靶基因)、終止子等表達(dá)單元、進(jìn)而還可以包含任意其他的有用單元的、用于使特定蛋白或肽片段表達(dá)的一套基因。作為其他的有用單元，可以舉出例如編碼分泌信號(hào)等信號(hào)肽的基因、編碼標(biāo)識(shí)蛋白的基因等。本發(fā)明涉及用于制作轉(zhuǎn)化厭氧菌的質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒具有包含在厭氧菌中發(fā)揮功能的分泌信號(hào)的表達(dá)盒，且是非穿梭質(zhì)粒。
作為在實(shí)體瘤、缺血性疾病等疾病部位處于厭氧環(huán)境下的疾病(以下、稱(chēng)為缺氧疾病)的治療中所用的轉(zhuǎn)化基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，從安全性的觀(guān)點(diǎn)考慮，需要使非致病性的。進(jìn)而，僅在處于厭氧狀態(tài)的疾病組織等中建群、增殖，而在非厭氧狀態(tài)的正常的組織中不建群、增殖的專(zhuān)性厭氧菌是更優(yōu)選的。本發(fā)明者人等對(duì)使用作為專(zhuān)性厭氧菌的雙歧桿菌的惡性腫瘤的治療方法就行了反復(fù)研究，開(kāi)發(fā)了組入了將前藥5-FC轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)5-FU的酶的CD的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的長(zhǎng)雙歧桿菌105A。(專(zhuān)利文獻(xiàn)7、8)對(duì)于這些轉(zhuǎn)化體雙歧桿菌，確認(rèn)了 在以靜脈內(nèi)方式給予缺氧疾病的實(shí)體瘤模型動(dòng)物時(shí)，在處于低酸素狀態(tài)的缺氧疾病組織中特異性地建群、增殖，而在非低酸素狀態(tài)的正常組織中迅速消失。(參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)1、2)但是，上述專(zhuān)利文獻(xiàn)7、8的轉(zhuǎn)化體雙歧桿菌由于是使用菌一雙歧桿菌的穿梭質(zhì)粒pBLES100-S-e⑶、pAV001-HU-e⑶-M968等轉(zhuǎn)化的，因此在橫向轉(zhuǎn)移到大腸桿菌時(shí)，有可能在 該大腸桿菌中復(fù)制。因此，本發(fā)明人等，為了解決該課題，進(jìn)行了質(zhì)粒的改良，開(kāi)發(fā)了不具有在大腸桿菌中發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)的非穿梭質(zhì)粒pBifiCD。(專(zhuān)利文獻(xiàn)9)使用這些轉(zhuǎn)化菌的惡性腫瘤的治療方法，即酶一前藥療法(⑶一 5 - FC療法)中，為了盡量降低抗腫瘤物質(zhì)5 - FU的副作用，希望抗腫瘤物質(zhì)5 - FU腫瘤組織特異性地發(fā)揮作用，因此本發(fā)明人等，為了使產(chǎn)生的CD不分泌到菌體外，將被攝入菌體內(nèi)的5 — FC轉(zhuǎn)變?yōu)? - FU而排出到菌體外，僅在腫瘤組織發(fā)揮5 - FU的抗腫瘤作用，從而對(duì)這些轉(zhuǎn)化體雙歧桿菌均用不具有分泌信號(hào)的質(zhì)粒進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。這些用不具有分泌信號(hào)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的雙歧桿菌，從在處于低酸素狀態(tài)的缺氧疾病組織中特異性地建群、增殖的特征和酶CD停留于在缺氧疾病組織中特異性地建群、增殖了菌的內(nèi)部的特征這兩方面，具有可以消除抗腫瘤物質(zhì)5 - FU的全身的副作用的優(yōu)點(diǎn)，但另一方面，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了以下問(wèn)題5 — FU的生成量并不是轉(zhuǎn)化體雙歧桿菌所產(chǎn)生的CD量，而與攝入菌體內(nèi)的5 - FC的量相關(guān)，所產(chǎn)生的CD的酶功能不能充分發(fā)揮。另外，在不是CD這樣的將前藥轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的酶而是產(chǎn)生抗腫瘤性蛋白、核酸等的菌的情況下，為了使所產(chǎn)生的抗腫瘤物質(zhì)放出到菌體外，需要在缺氧疾病組織中增殖后，殺死破壞菌。為了解決這些問(wèn)題，著手開(kāi)發(fā)在厭氧菌、優(yōu)選非致病性的專(zhuān)性厭氧菌中發(fā)揮功能、具有使產(chǎn)生的活性物質(zhì)分泌的分泌信號(hào)的質(zhì)粒，開(kāi)發(fā)了對(duì)該質(zhì)粒制作有用的、至少在厭氧菌中發(fā)揮功能、表現(xiàn)出優(yōu)異的表達(dá)蛋白的分泌作用的分泌信號(hào)肽。另外，使用轉(zhuǎn)化基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的實(shí)體瘤等的治療方法中，如上所述，非常重要的是，所用的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的轉(zhuǎn)化基因不向該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體以外的、致病菌或好氧性或者兼性厭氧菌中橫向轉(zhuǎn)移，進(jìn)而，即使橫向轉(zhuǎn)移了也不在該菌中復(fù)制。因此，對(duì)于上述具有分泌信號(hào)的質(zhì)粒，優(yōu)選是不具有在轉(zhuǎn)化菌以外的菌中發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)的非穿梭質(zhì)粒。本發(fā)明的質(zhì)粒是轉(zhuǎn)化厭氧菌制作用的質(zhì)粒，是具有包含至少在厭氧菌中發(fā)揮功能的分泌信號(hào)的表達(dá)盒的質(zhì)粒。而且是不具有在轉(zhuǎn)化菌以外的菌中發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)、在轉(zhuǎn)化菌以外的菌中不相互復(fù)制的非穿梭質(zhì)粒。
更具體地，是至少在雙歧桿菌中發(fā)揮功能、具有含有優(yōu)異的分泌作用的分泌信號(hào)的表達(dá)盒、而且、不具有在轉(zhuǎn)化菌以外的菌中發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)、在轉(zhuǎn)化菌以外的菌中不相互復(fù)制的轉(zhuǎn)化厭氧菌制作用的質(zhì)粒。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒是的特征是通過(guò)使用該質(zhì)粒，能夠表達(dá)任意的目的蛋白或核酸，進(jìn)而可以制作通過(guò)表達(dá)盒所含的分泌信號(hào)肽的作用發(fā)揮優(yōu)異的實(shí)用性高的分泌功能的轉(zhuǎn)化厭氧菌。進(jìn)而，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒的特征是是不具有在轉(zhuǎn)化菌以外的菌中發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)、在轉(zhuǎn)化菌以外的菌中不相互復(fù)制的非穿梭質(zhì)粒載體。至今，作為在厭氧菌、特別是雙歧桿菌中發(fā)揮功能的信號(hào)肽，報(bào)道有例如青春雙歧桿菌的淀粉酶、短雙歧桿菌的SeCl、SeC2、SeC3等，還報(bào)道了導(dǎo)入有它們的分泌信號(hào)的質(zhì)粒。但是，推測(cè)這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的雙歧桿菌的目的蛋白質(zhì)的分泌量少。而且，克隆該青春雙歧桿菌的淀粉酶的分泌信號(hào)以及啟動(dòng)子區(qū)域，將它們與編碼UV優(yōu)化綠色熒光蛋白變異體(GFPUv ；CL0NTECH Laboratories, Inc.)的基因組合而制作質(zhì)粒，對(duì)于用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的長(zhǎng)雙歧桿菌，確認(rèn)其表達(dá)蛋白(GFP)的分泌功能，結(jié)果沒(méi)有顯示GFP的分泌功能，推定該分泌信號(hào)肽不可以分泌任意的目的蛋白。進(jìn)而，至今報(bào)道的將表達(dá)蛋白分泌到菌體外的轉(zhuǎn)化厭氧菌制作用的質(zhì)粒載體是將來(lái)自大腸桿菌的質(zhì)粒和來(lái)自轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒融合后的、在大腸桿菌和轉(zhuǎn)化菌雙方中發(fā)揮功能的穿梭載體，沒(méi)有報(bào)道過(guò)僅在大腸桿菌以外的轉(zhuǎn)化菌中發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒所具有的在厭氧菌中發(fā)揮功能的分泌信號(hào)肽，只要是至少在厭氧菌中發(fā)揮功能的分泌信號(hào)肽則可以使用任意的分泌信號(hào)肽，優(yōu)選在雙歧桿菌中發(fā)揮功能的分泌信號(hào)肽。從對(duì)轉(zhuǎn)化菌的毒性、功能性的觀(guān)點(diǎn)考慮，更優(yōu)選來(lái)自雙歧桿菌的分泌信號(hào)肽，進(jìn)一步優(yōu)選來(lái)自長(zhǎng)雙歧桿菌菌的分泌信號(hào)肽。作為來(lái)自長(zhǎng)雙歧桿菌菌的分泌信號(hào)肽，例如，可以例示出由序列號(hào)6 28的任一堿基序列或其I個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或增添后的序列表示的DNA編碼的分泌信號(hào)肽等。這些之中，從高分泌功能的角度考慮，優(yōu)選由序列號(hào)6、7、8、9、12、14、15、17、21、25或28的任一堿基序列或其I個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或增添后的序列表示的DNA編碼的分泌信號(hào)肽，更優(yōu)選由序列號(hào)8或25的任一堿基序列或其I個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或增添后的序列表示的DNA編碼的分泌信號(hào)肽。另外，作為本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒所具有的、表達(dá)盒中的啟動(dòng)子，只要是在厭氧菌中發(fā)揮功能、作為分泌信號(hào)肽的啟動(dòng)子來(lái)發(fā)揮功能，則可以使任意的啟動(dòng)子，例如可以舉出與來(lái)自雙歧桿菌的分泌信號(hào)肽的上游相鄰的啟動(dòng)子(promoter X)或編碼在雙歧桿菌中發(fā)揮功能的組織蛋白樣DNA結(jié)合蛋白的基因的啟動(dòng)子(HU promoter)等。具體地,可以舉出由序列號(hào)29 44的任一個(gè)所表不的堿基序列的啟動(dòng)子區(qū)域的DNA以及序列號(hào)45所表不的堿基序列或其I個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或增添后的序列的DNA編碼的啟動(dòng)子。在這些之中，優(yōu)選由序列號(hào)35所表示的堿基序列的啟動(dòng)子區(qū)域的DNA或者其單核苷酸多態(tài)性編碼的啟動(dòng)子或HU啟動(dòng)子,更優(yōu)選HU啟動(dòng)子,尤其優(yōu)選由序列號(hào)45的堿基序列或其I個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或增添后的序列所表示的DNA編碼的啟動(dòng)子。進(jìn)而，作為本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒所具有的終止子，只要是在雙歧桿菌中發(fā)揮功能、作為分泌信號(hào)肽的終止子發(fā)揮功能，則可以是任意的終止子，優(yōu)選編碼在雙歧桿菌中發(fā)揮功能的組織蛋白樣DNA結(jié)合蛋白的基因的終止子(HUterminator),特別是序列號(hào)46的堿基序列或其I個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或增添后的序列所表示的DNA是尤其優(yōu)選的。這里，本發(fā)明中所說(shuō)的“一堿基變異體”的意思是至少I(mǎi)處的堿基發(fā)生了變異的單核苷酸多態(tài)性(以下稱(chēng)為SNP)，不僅包括I處的SNP，還包括多處的SNP。因此，能夠與“I個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或增添后的序列”相互替換。作為編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒所具有的分泌的目的蛋白或核酸的基因(即靶基因)，例如，只要是編碼熒光蛋白的基因、編碼具有抗腫瘤活性的蛋白的基因、編碼具有缺血性疾病治療活性的蛋白的基因、編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白的基因等基因，則可以任意使用。作為熒光蛋白，可以舉出各種綠色熒光蛋白(GFP )、紅色熒光蛋白(RFP)等。另外，作為具有抗腫瘤活性的蛋白，可以舉出例如細(xì)胞因子，作為具體的細(xì)胞因子可以舉出，例如干擾素(IFN)-Ci、β和Y，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-Ia、1β、2、3、4、6、7、10、12、13、15、18、腫瘤壞死因子(TNF) - α、淋巴毒素(LT) - β、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)、白血病抑制因子(LIF)、T-細(xì)胞活化共刺激因子Β7 (CD80)和Β7-2 (CD86)、KIT配體和制瘤素M等。另外，還可以舉出內(nèi)皮抑制素、血管抑制素(angiostatin)和三環(huán)(kringle) 1、2、
3、4和5等血管發(fā)生抑制物質(zhì)。作為具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白，可以舉出胞嘧啶脫氨酶(以下稱(chēng)為CD)，其是將5-氟胞嘧啶(以下稱(chēng)為5-FC)轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤活性物質(zhì)5-氟尿嘧啶(以下稱(chēng)為5-FU)的酶；硝基還原酶，其是將5-氮雜環(huán)丙基-2，4- 二硝基苯甲酰胺(以下稱(chēng)為CB1945)轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤活性烷化劑的酶；I型單純皰疹病毒胸苷激酶(以下稱(chēng)為HSVI-TK)，其是將更昔洛韋轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤活性代謝產(chǎn)物的酶；以及β -葡糖醛酸糖苷酶，其是將葡糖醛酸化的抗腫瘤活性物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤活性物質(zhì)的酶；等。進(jìn)而，作為具有缺血性疾病治療活性的蛋白，可以舉出具有對(duì)缺血性疾病治療有用的血管新生促進(jìn)活性的蛋白，具體地，可以舉出成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF2)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)等。這些蛋白的序列在各種各樣的生物中是已知的，基于其序列信息利用PCR法、人工基因合成等公知的方法，從而可以獲得編碼目的蛋白的DNA。另外，作為具有處于厭氧環(huán)境下的疾病的治療活性的核酸，可以舉出與缺氧疾病因子有關(guān)的siRNAs，更具體地，可以舉出與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF2)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)等腫瘤細(xì)胞增殖因子有關(guān)的siRNAsο同樣地，這些核酸的序列也是已知的，基于其序列信息利用PCR法等公知的方法就可以獲得。本發(fā)明的質(zhì)粒例如可以如下來(lái)制作。例如，按照通常的方法，在具有在轉(zhuǎn)化菌和轉(zhuǎn)化菌以外的菌例如大腸桿菌中分別發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒中，插入至少在雙歧桿菌中發(fā)揮功能的分泌信號(hào)及其啟動(dòng)子基因，在其下游插入至少I(mǎi)種編碼對(duì)所期望的缺氧疾病的診斷或治療有用的蛋白的基因或核酸(靶基因)，進(jìn)而，在其下游插入在厭氧菌中發(fā)揮功能的終止子基因，從而可以制作穿梭質(zhì)粒。進(jìn)而，按照希望，從該穿梭質(zhì)粒中除去轉(zhuǎn)化菌以外的菌的復(fù)制起點(diǎn)，從而可以制作非穿梭質(zhì)粒。需要說(shuō)明的是，各工程中的操作可以根據(jù)文獻(xiàn)記載等的公知的方法來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明的缺氧疾病治療用基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體可以通過(guò)用上述本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒按照基因工程學(xué)領(lǐng)域公知的方法將要轉(zhuǎn)化的任意厭氧菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化來(lái)制作。 用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的厭氧菌由于是用于實(shí)體瘤等缺氧疾病的治療劑的物質(zhì)，因此必須是專(zhuān)性厭氧性其是非致病性的，如果是梭菌或沙門(mén)氏菌(Salmonella)等致病性菌，則非致病性化后的菌即可，另外，如果是乳酸桿菌等兼性厭氧菌，則突變?yōu)閷?zhuān)性厭氧性后的菌即可。優(yōu)選可以舉出非致病性的厭氧性細(xì)菌，更優(yōu)選可以舉出非致病性的腸內(nèi)細(xì)菌，其中特別優(yōu)選雙歧桿菌屬細(xì)菌。作為雙歧桿菌屬細(xì)菌，可以舉出例如青春雙歧桿菌、埃氏雙岐桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、星狀雙歧桿菌、雙歧雙歧桿菌、牛雙歧桿菌、短雙歧桿菌、鏈狀雙歧桿菌、小豬雙歧桿菌、棒狀雙歧桿菌、兔雙歧桿菌、寓齒雙歧桿菌、齒雙歧桿菌、沒(méi)食子雙歧桿菌、雞腸雙歧桿菌、球雙歧桿菌、印度雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、奇異雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌、自由雙歧桿菌(Bifidobacterium liberorum)、長(zhǎng)雙歧桿菌、大雙歧桿菌、瘤胃雙歧桿菌、最小雙歧桿菌、摩恩格里艾恩斯雙歧桿菌(Bifidobacterium mongoliense)、微小粒雙歧桿菌(Bifidobacterium parvulorum)、假小鏈雙歧桿菌、假長(zhǎng)雙歧桿菌、薩伊庫(kù)拉埃羅胡拉姆雙歧桿菌(Bifidobacterium psychroaerophilum)、小雞雙歧桿菌、瘤胃雙歧桿菌、反會(huì)雙歧桿菌、波倫亞雙歧桿菌、蘇卡魯?shù)谰S伊雙歧桿菌(Bifidobacterium scardovii)、細(xì)長(zhǎng)雙歧桿菌、豬雙歧桿菌、薩瑪茨德胡拉姆雙歧桿菌(Bifidobacterium thermacidophilum)和嗜熱雙歧桿菌等，尤其優(yōu)選長(zhǎng)雙歧桿菌。這些菌均為市售或可以容易從保藏機(jī)構(gòu)獲得的。例如，長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC-15707、雙歧雙歧桿菌ATCC-11863、嬰兒雙歧桿菌ATCC-15697等可以容易地從ATCC (美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心(The American Type Culture Collection))獲得。另外，對(duì)各菌的菌株沒(méi)有特別限定，例如，對(duì)于長(zhǎng)雙歧桿菌的菌株，可以舉出長(zhǎng)雙歧桿菌105 — A株、長(zhǎng)雙歧桿菌aE — 194B株、長(zhǎng)雙歧桿菌BS — 601株、長(zhǎng)雙歧桿菌MlOl —2株，其中長(zhǎng)雙歧桿菌105 — A株是優(yōu)選的。對(duì)于短雙歧桿菌的菌株，例如可以舉出短雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(JCMl 192),短雙歧桿菌aS — I株、短雙歧桿菌I 一 53 — 8W株，其中，短雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、短雙歧桿菌aS — I株是優(yōu)選的。對(duì)于嬰兒雙歧桿菌的菌株d P r ii，例如可以舉出嬰兒雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(JCM1222)、嬰兒雙歧桿菌I 一 10 — 5株，其中，嬰兒雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、嬰兒雙歧桿菌I 一10 — 5株是優(yōu)選的。另外，對(duì)于乳雙歧桿菌的菌株，例如可以舉出乳雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(JCM1210)。本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是包含通過(guò)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的上述厭氧菌的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，是可以在處于厭氧環(huán)境下的組織內(nèi)生長(zhǎng)、且可以表達(dá)具有目標(biāo)活性的蛋白、進(jìn)而不會(huì)向轉(zhuǎn)化菌以外的特別是致病性或好氧性菌或者兼性厭氧菌橫向轉(zhuǎn)移的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體。本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制作可以按照市售的實(shí)驗(yàn)教科書(shū)中記載的方法來(lái)進(jìn)行，例如，基因手冊(cè)(講談社)、高木康敬編著的基因操作實(shí)驗(yàn)法(講談社)、分子·克隆(Molecular Cloning)科爾德斯普林實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring Harbor Laboratory)(1982)、分子·克隆第 2 版(Molecular Cloning, 2nd ed.)科爾德斯普林實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring HarborLaboratory) (1989)、酶學(xué)方法(Methods in Enzymol. ), 194 (1991)。本發(fā)明的藥物組合物只要含有本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體則沒(méi)有特別限制。另外，本發(fā)明的缺氧疾病治療劑只要含有本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體則沒(méi)有特別限制。另外，本發(fā)明的藥物組合物、缺氧疾病治療劑也可以含有2種以上的本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體。進(jìn)而，本發(fā)明的藥物組合物、缺氧疾病治療劑可以與含有本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體以外的缺氧疾病治療效果的化合物的藥物組合物、厭氧性疾病治療劑組合使用。 另外，本發(fā)明的藥物組合物、缺氧疾病治療劑在不妨礙本發(fā)明效果的范圍內(nèi)，還可以含有本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體以外的任意成分。作為這樣的任意成分，例如可以舉出藥理學(xué)上允許的載體、賦形劑、稀釋劑等。本發(fā)明的藥物組合物、缺氧疾病治療劑的劑型沒(méi)有特別限制，例如可以舉出含有本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的液體制劑或者固體制劑。液體制劑可以通過(guò)對(duì)本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的厭氧菌的培養(yǎng)液進(jìn)行精制，根據(jù)需要向其中加入適當(dāng)?shù)纳睇}水或者液體替換品或藥物添加劑，并填裝到安瓿、小瓶等來(lái)制造。另外，固體制劑可以通過(guò)向液體試劑添加合適的保護(hù)劑，用其填裝安瓿、小瓶等，并且然后凍干或L-干燥而產(chǎn)生，或通過(guò)向液體試劑添加合適的保護(hù)劑，將其凍干或L-干燥，并且然后用其填裝安瓿、小瓶等而產(chǎn)生。作為本發(fā)明的藥物組合物、缺氧疾病治療劑的給藥方法，口服給藥和腸胃外給藥兩者都是可以的，但腸胃外給藥是優(yōu)選的，例如可以進(jìn)行靜脈內(nèi)注射、皮下注射、局部輸注或腦室內(nèi)給藥，并且靜脈內(nèi)注射是最優(yōu)選的。本發(fā)明的藥物組合物、缺氧疾病治療劑的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的給藥量沒(méi)有特殊限定，只要其對(duì)于在疾病位置生長(zhǎng)和表達(dá)有效治療劑量的活性蛋白是足夠的量，但是，從經(jīng)濟(jì)觀(guān)點(diǎn)和盡量避免副作用的觀(guān)點(diǎn)出發(fā)，劑量?jī)?yōu)選地在能獲得所需的治療效果的范圍內(nèi)盡可能地小。本發(fā)明的藥物組合物、缺氧疾病治療劑中的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的給藥量根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度和患者的體重、年齡或性別適當(dāng)選擇，并且可以根據(jù)改善程度適當(dāng)增加或減少。例如，當(dāng)將本發(fā)明的缺氧疾病治療劑用作實(shí)體瘤治療劑時(shí)，根據(jù)厭氧菌自身表現(xiàn)出的抗腫瘤活性、具有所使用的厭氧菌產(chǎn)生的抗腫瘤活性的蛋白等的種類(lèi)、轉(zhuǎn)變自抗腫瘤物質(zhì)前體的抗腫瘤物質(zhì)的有效治療劑量、所使用的厭氧菌產(chǎn)生的活性蛋白的量等來(lái)適當(dāng)?shù)卮_定劑量具體地，例如在靜脈內(nèi)給藥的情況下，因?yàn)樾枰档陀捎诖罅考?xì)菌引起的栓塞風(fēng)險(xiǎn)，所以?xún)?yōu)選將以盡可能低濃度的注射用制劑分為多次注射或用適當(dāng)?shù)囊后w代替品稀釋注射并且通過(guò)連續(xù)輸注給藥。例如，在成人的情況下，將每天IO6IO12Cfu每千克體重的本發(fā)明的厭氧菌的菌體分為I至多次、連續(xù)或適當(dāng)間隔地進(jìn)行給藥，并且持續(xù)I天至多天。更具體地，每成人直接給予ImL至IOOOmL含有104 101(lCfu/mL的本發(fā)明的厭氧菌的菌體，或用適當(dāng)?shù)囊后w代替品稀釋?zhuān)譃槊刻煲淮沃炼啻芜M(jìn)行給藥，并且持續(xù)I天至連續(xù)幾天另外，在涉及直接對(duì)疾病組織直接給藥的局部給藥的情況下，因?yàn)樾枰?xì)菌細(xì)胞在整個(gè)疾病組織中盡可能多地建群和增殖，所以在疾病組織的多個(gè)位置給予高濃度注射是可取得。例如，在成人的情況下，每天一次或多次給予IO6Cfu至IO12Cfu每千克體重的本發(fā)明的雙歧桿菌的菌體，視情況連續(xù)或間隔地進(jìn)行給藥，并且按照需要持續(xù)I天至多天。更具體地,每成人直接地給予ImL至IOOOmL含有104cfu/mL至10lclcfu/mL的本發(fā)明的雙歧桿菌的菌體直接地，優(yōu)選每天一次至多次，并且按照需要連續(xù)地持續(xù)I天至幾天。當(dāng)在治療期間觀(guān)察到疾病組織中的細(xì)菌已消失，則首先暫停治療，然后以如以上相似的方式給予細(xì)菌。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中的“ X和Y組合而成”X和Y在不同配置(configuration)的情況以及X和Y在相同配置的情況(例如含有X和Y的配置)。當(dāng)X和Y在不同配置時(shí)，X和Y可以各自另外含有其他成分。本發(fā)明的藥物組合物、缺氧疾病治療劑可以應(yīng)用于厭氧環(huán)境下的疾病、優(yōu)選各種實(shí)體瘤。作為實(shí)體瘤，可以舉出大腸癌、腦瘤、頭頸癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、胰腺癌、胰島細(xì)胞癌、絨毛膜癌、結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌、腎上腺皮質(zhì)癌、膀胱癌、睪丸癌、前列腺癌、睪丸腫瘤、卵巢癌、子宮癌、甲狀腺癌、惡性類(lèi)癌瘤、皮膚癌、惡性黑色素瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、維爾姆斯腫瘤(Wilm’s tumor)、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、黑色素瘤和鱗癌等。另外，在缺氧環(huán)境中的其他疾病的實(shí)例包括缺血性疾病，例如心肌梗死或閉塞性動(dòng)脈硬化，以及下肢缺血性疾病，例如伯格病(Buerger’ s disease)。另外，本發(fā)明也還包含對(duì)于在特別是上述的質(zhì)粒、基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體或藥物組合物中的使用有用的新型分泌信號(hào)肽。本發(fā)明人等首先，為了發(fā)現(xiàn)在雙歧桿菌中發(fā)揮功能、表現(xiàn)出優(yōu)異的表達(dá)蛋白的分泌作用的分泌信號(hào)肽，進(jìn)行了上述轉(zhuǎn)化體雙歧桿菌的親代菌株長(zhǎng)雙歧桿菌105A的基因組解析，選出了 25種具有分泌信號(hào)且推測(cè)是不具有膜貫通區(qū)域的分泌蛋白的蛋白。25種蛋白中，分泌信號(hào)與啟動(dòng)子相鄰的是16種，分泌信號(hào)不與啟動(dòng)子相鄰的是9種。
精確檢查25種蛋白編碼區(qū)域的堿基序列，對(duì)于25種分泌蛋白質(zhì)中推測(cè)為不完全的蛋白編碼序列(CDS)的3個(gè)(No. 17、18、20)后的22個(gè)(No. I 16、19、21 25)，如下進(jìn)行分泌信號(hào)以及推定為啟動(dòng)子的區(qū)域的克隆。對(duì)于分泌信號(hào)與啟動(dòng)子相鄰的16種蛋白，克隆該啟動(dòng)子(promoter X)以及推定為分泌信號(hào)(以下、SPxA)的區(qū)域，將它們與編碼UV優(yōu)化綠色熒光蛋白變異體(GFPUv ；CL0NTECH Laboratories, Inc.)的基因和在上述專(zhuān)利文獻(xiàn)7 9記載的質(zhì)粒制作中使用的雙歧桿菌的組織蛋白樣肽(HU )的終止子(HUt ermi nator )組合,制作質(zhì)粒,對(duì)于用該質(zhì)粒(PSPxA)轉(zhuǎn)化了的雙歧桿菌，確認(rèn)表達(dá)蛋白(GFP)的分泌功能。另外，對(duì)于包括分泌信號(hào)不與啟動(dòng)子相鄰的剩余9種蛋白的全部22種蛋白，克隆不含啟動(dòng)子區(qū)域的分泌信號(hào)(以下、SPxB)區(qū)域，與上述雙歧桿菌的組織蛋白樣肽(HU)的啟動(dòng)子(HU promoter)、編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因以及上述雙歧桿菌的組織蛋白樣肽(HU)的終止子(HU terminator)組合,制作質(zhì)粒,與上述同樣地,對(duì)于用該質(zhì)粒(pSPxB)轉(zhuǎn)化了的雙歧桿菌，確認(rèn)表達(dá)蛋白(GFP)的分泌功能。
結(jié)果是，在12 種質(zhì)粒(pSP7A-GFP，pSP12A-GFP，pSPlB-GFP，pSP2B-GFP，PSP3B-GFP, pSP4B-GFP, pSP7B_GFP，pSP9B_GFP，pSP IOB-GFP, pSP 12B-GFP，pSP16B_GFP，PSP23B-GFP)中確認(rèn)到分泌傾向，在 4 種質(zhì)粒(pSP7A_GFP，pSP3B_GFP，pSP7B_GFP，PSP23B-GFP)中確認(rèn)到優(yōu)異的表達(dá)蛋白的分泌功能。另外，除此之外，在該長(zhǎng)雙歧桿菌105A的基因組解析中，進(jìn)行了與報(bào)道在短雙歧桿菌中分泌的 SeC2 的基因(Laura E. MacConaill et al. , Applied and Environmental Microbiology, 2003Vol. 69:pp6994_7001)在氨基酸水平上同源性高的堿基序列的蛋白的檢索，對(duì)于其分泌信號(hào)肽，進(jìn)行了研究。即，將該分泌編碼信號(hào)肽的基因和上述雙歧桿菌的組織蛋白樣肽(HU)的啟動(dòng)子(HUpromoter)基因組合而進(jìn)行克隆，將它們與編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因以及上述雙歧桿菌的組織蛋白樣肽(HU)的終止子(HU terminator)組合而制作質(zhì)粒，與上述同樣地，對(duì)于用該質(zhì)粒(pSeC2 - GFP)轉(zhuǎn)化了的雙歧桿菌，確認(rèn)表達(dá)蛋白(GFP)的分泌功能，結(jié)果確認(rèn)了優(yōu)異的表達(dá)蛋白的分泌功能。接下來(lái)，對(duì)于上述確認(rèn)了分泌傾向的13種質(zhì)粒，制作插入了編碼別的目的蛋白的人類(lèi)TNF — α的基因來(lái)代替編碼GFP的基因的質(zhì)粒，用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化雙歧桿菌，確認(rèn)其表 達(dá)蛋白分泌功能。結(jié)果是，在9 種質(zhì)粒(pSP7A-TNF α，pSPlB-TNF α，pSP3B_TNF α，pSP4B_TNF α，PSP7B-TNF α，pSP12B_TNFa，pSP16B_TNFa，pSP23B_TNF a，pSeC2B_TNF a )中顯示分泌功能，在2種質(zhì)粒(pSP3B_TNFa，pSP23B-TNF a )中確認(rèn)了特別優(yōu)異的表達(dá)蛋白的分泌功能。進(jìn)而，制作從這些質(zhì)粒中除去了在雙歧桿菌以外的菌中發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)、例如pUC ORI的質(zhì)粒。于是,對(duì)于用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的雙歧桿菌看,確認(rèn)表達(dá)蛋白的分泌功能，結(jié)果確認(rèn)到除去了在雙歧桿菌以外的菌中發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)pUC ORI的質(zhì)粒也同樣地能夠發(fā)揮優(yōu)異的表達(dá)蛋白的分泌功能。這樣，發(fā)現(xiàn)了至少在雙歧桿菌中發(fā)揮功能、優(yōu)異的表達(dá)蛋白的分泌作用的新型分泌信號(hào)肽。如上所述，本發(fā)明的分泌信號(hào)肽由于具有優(yōu)異的分泌活性，且能在非致病性專(zhuān)性厭氧菌雙歧桿菌中發(fā)揮功能，因此特別適用于上述質(zhì)粒、基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體或藥物組合物。因此，包含本發(fā)明的新型分泌信號(hào)肽作為分泌信號(hào)肽的、所有形式的上述質(zhì)粒、基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體或藥物組合物也包括在本發(fā)明中。
實(shí)施例以下，借助制造例及實(shí)施例更具體地說(shuō)明本發(fā)明，但是本發(fā)明的技術(shù)范圍不局限于這些實(shí)施例。參考例I:分泌信號(hào)的in Silico篩選針對(duì)由Bifidobacterium longum 105A的全基因組序列推定的全翻譯區(qū)域的1941個(gè)氨基酸序列，進(jìn)行使用PrediSi的信號(hào)肽預(yù)測(cè)，推定188個(gè)信號(hào)肽。預(yù)測(cè)時(shí)，使用了Gram Positive Bacteria 的參數(shù)組。推測(cè)的188個(gè)信號(hào)肽之中，選定不具有膜貫通區(qū)域的25個(gè)作為候選分泌蛋白質(zhì)。該推定分泌蛋白質(zhì)編碼區(qū)域示于表I。[表 I]
表I候選分泌蛋白的基因組上的位置和方向
…候逢號(hào).操縱子位靈方向.
1頭部201120 ■ - ami
2頭部762462 7637S
3頭部781649 現(xiàn)> 782512
4頭部M2H77 -> 84457
5頭部1433216 -> Ι433Λ50
麵1662965 16642097頭部19171 50 -> I (11 7836
s頭部164213 <~ 165142
9頭部63684(κ174 4
10頭部752108 < 752839
11頭部83966341006
U頭部1201317 <- 1202642--
13頭部1744372 -二 1744605
H頭部 95Η Κ} ·<- H15M93
15頭部2225M4 ^ 22 7349
16頭部225S216 225K665I Φ頭部5S769 -> 598 !
IH非頭部471.M5--> 47241 I
19Φ頭部7Λ·37 - 7ASS34
20非頭部695274 696701
21尊頭部7081 51 <- 70眺6 2,非頭部9303 I <- 93165
23非頭部I I 15148 1116155
24非頭部1326_ <· I 32713
25非頭部1867S2] <- !SftSHO 制造例I:分泌型GFP表達(dá)質(zhì)粒(pSPxA-GFP)的構(gòu)建構(gòu)建通過(guò)候選信號(hào)肽的啟動(dòng)子使分泌型GFP表達(dá)的質(zhì)粒。概要示于圖I。具體如下。
制備插入物上述25個(gè)候選分泌蛋白質(zhì)之中，關(guān)于其基因位于操縱子的最前頭的16種(表1N0. I 16)，如下所述通過(guò)PCR法擴(kuò)增含啟動(dòng)子區(qū)域的推定信號(hào)肽部分及其下游部分的60 90個(gè)堿基。在翻譯起始點(diǎn)的300Bp上游設(shè)計(jì)forward primer,在編碼信號(hào)肽的DNA的60 90Bp下游設(shè)計(jì)reverse primer。以長(zhǎng)雙歧桿菌105A的基因組DNA30NG作為模板，用
2XPhusion Flash PCR Master mix (FINNZYMES)進(jìn)行 PCR。PCR的程序是98°C下10秒之后，98°C下I秒、55°C下5秒、72°C下9秒，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，在72°C下進(jìn)行I分鐘。各信號(hào)肽的PCR引物示于表2. I。各引物的5’側(cè)的15個(gè)堿基具有與以下所示載體相同的序列。[表2] 表2. I信號(hào)肽擴(kuò)增時(shí)的引物(SPxA)
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，是用于制作轉(zhuǎn)化厭氧菌的質(zhì)粒，其具有包含在厭氧菌中發(fā)揮功能的分泌信號(hào)的表達(dá)盒，并且是非穿梭質(zhì)粒。
2.如權(quán)利要求I所述的質(zhì)粒，其中厭氧菌是雙歧桿菌。
3.如權(quán)利要求I或2所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中分泌信號(hào)肽來(lái)自雙歧桿菌。
4.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中分泌信號(hào)肽來(lái)自長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)。
5.如權(quán)利要求I至4中任一權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中分泌信號(hào)是由序列號(hào)6^28的堿基序列或其序列的I個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或增添后的序列的任一種所示的DNA。
6.如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中分泌信號(hào)是由序列號(hào)6、7、8、9、12、14、15、17、21、25或28的堿基序列或其序列的I個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或增添后的序列。
7.如權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中分泌信號(hào)是由序列號(hào)8或25的堿基序列的任一種所示的DNA或其單核苷酸多態(tài)性。
8.如權(quán)利要求I至7中任一權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中編碼表達(dá)盒所含的啟動(dòng)子的基因是由序列號(hào)29 44的啟動(dòng)子區(qū)域的喊基序列或者序列號(hào)45的喊基序列或其序列的I個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或增添后的序列的任一種所示的DNA。
9.如權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中表達(dá)盒所含的啟動(dòng)子基因是由序列號(hào)35的啟動(dòng)子區(qū)域的堿基序列或者序列號(hào)45的堿基序列或其序列的I個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或增添后的序列的任一種所示的DNA。
10.如權(quán)利要求I至9中任一權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中表達(dá)盒所含的終止子基因是由序列號(hào)46的堿基序列或其序列的I個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或增添后的序列的任一種所示的DNA。
11.如權(quán)利要求I至10中任一權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中表達(dá)盒所含的靶基因是編碼熒光蛋白的基因。
12.如權(quán)利要求I至10中任一權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中表達(dá)盒所含的靶基因是編碼具有抗腫瘤活性的蛋白的基因。
13.如權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中具有抗腫瘤活性的蛋白是選自干擾素(IFN)-α、IFN-β、IFN-Y、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-I α、IL-I β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、腫瘤壞死因子(TNF)-a、淋巴毒素(LT)-i3、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)、白血病抑制因子(LIF)、T細(xì)胞活化共刺激因子B7 (⑶80)和B7-2 (⑶86)、KIT配體、制瘤素M等細(xì)胞因子，以及內(nèi)皮抑制素、血管抑制素(angiostatin)、三環(huán)(kringle) I、三環(huán)2、三環(huán)3、三環(huán)4、三環(huán)5等血管發(fā)生抑制物質(zhì)中的一種。
14.如權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中具有抗腫瘤活性的蛋白是腫瘤壞死因子(TNF)-Q或腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)中的任一者。
15.如權(quán)利要求I至10中任一權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中靶基因是是編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白的基因。
16.如權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白是選自胞嘧啶脫氨酶、硝基還原酶和β-葡糖醛酸糖苷酶中的一種。
17.如權(quán)利要求I至10中任一權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中靶基因是是編碼具有缺血性疾病治療活性的蛋白的基因。
18.如權(quán)利要求17所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中具有缺血性疾病治療活性的蛋白是選自成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 (FGF2)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)等具有血管生成促進(jìn)活性的蛋白中的一種。
19.如權(quán)利要求I至10中任一權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中靶基因是是具有缺氧疾病治療活性的核酸。
20.如權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中具有缺氧疾病治療活性的核酸是與選自成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 (FGF2)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)等中的至少一種腫瘤細(xì)胞增殖因子有關(guān)的siRNAs。
21.如權(quán)利要求I至20中任一權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒(pBifi-SP3B-TNFalpha),其包含由序列號(hào)5的堿基序列或其序列的I個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或增添后的序列的任一種所示的DNA序列。
22.基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，包含用權(quán)利要求I至21中任一權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化厭氧菌。
23.如權(quán)利要求22所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中所述厭氧菌是非致病性的腸內(nèi)細(xì)菌。
24.如權(quán)利要求22或23所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中所述厭氧菌是雙歧桿菌。
25.如權(quán)利要求24所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中所述雙歧桿菌是選自青春雙歧桿菌、埃氏雙岐桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、星狀雙歧桿菌、雙歧雙歧桿菌、牛雙歧桿菌、短雙歧桿菌、鏈狀雙歧桿菌、小豬雙歧桿菌、棒狀雙歧桿菌、兔雙歧桿菌、寓齒雙歧桿菌、齒雙歧桿菌、沒(méi)食子雙歧桿菌、雞腸雙歧桿菌、球雙歧桿菌、印度雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、奇異雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌、自由雙歧桿菌(Bifidobacterium liberorum)、長(zhǎng)雙歧桿菌、大雙歧桿菌、瘤胃雙歧桿菌、最小雙歧桿菌、摩恩格里艾恩斯雙歧桿菌(Bifidobacteriummongoliense)、微小粒雙歧桿菌(Bifidobacterium parvulorum)、假小鏈雙歧桿菌、假長(zhǎng)雙歧桿菌、薩伊庫(kù)拉埃羅胡拉姆雙歧桿菌(Bifidobacterium psychroaerophilum)、小雞雙歧桿菌、瘤胃雙歧桿菌、反芻雙歧桿菌、波倫亞雙歧桿菌、蘇卡魯?shù)谰S伊雙歧桿菌(Bifidobacterium scardovii)、細(xì)長(zhǎng)雙歧桿菌、豬雙歧桿菌、薩瑪茨德胡拉姆雙歧桿菌(Bifidobacterium thermacidophilum)和嗜熱雙歧桿菌中的 I 種。
26.如權(quán)利要求25所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中所述雙歧桿菌是長(zhǎng)雙歧桿菌。
27.如權(quán)利要求22至26中任一權(quán)利要求所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，它能夠在缺氧環(huán)境中的腫瘤組織中生長(zhǎng)，并且能夠表達(dá)、分泌至少一種對(duì)缺氧疾病的診斷或治療有用的蛋白或核酸。
28.如權(quán)利要求27所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中對(duì)缺氧疾病的診斷有用的蛋白是熒光蛋白。
29.如權(quán)利要求27所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中對(duì)缺氧疾病的治療有用的蛋白是具有抗腫瘤活性的蛋白。
30.如權(quán)利要求28所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中具有抗腫瘤活性的蛋白是選自干擾素(IFN)-α、IFN-β、IFN-Y、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-I α、IL-I β、IL-2、IL-3、IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18、腫瘤壞死因子(TNF)-a、淋巴毒素(LT)-i3、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)、白血病抑制因子(LIF)、T細(xì)胞活化共刺激因子B7 (⑶80)和B7-2 (⑶86)、KIT配體、制瘤素M等細(xì)胞因子，以及內(nèi)皮抑制素、血管抑制素(angiostatin)、三環(huán)(kringle) I、三環(huán)2、三環(huán)3、三環(huán)4、三環(huán)5等血管發(fā)生抑制物質(zhì)中的一種。
31.如權(quán)利要求27所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中對(duì)缺氧疾病的治療有用的蛋白是具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白。
32.如權(quán)利要求31所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤物質(zhì)的活性的蛋白是選自胞嘧啶脫氨酶、硝基還原酶和葡糖醛酸糖苷酶中的I種。
33.如權(quán)利要求27所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中對(duì)缺氧疾病的治療有用的核酸是與缺氧疾病因子有關(guān)的siRNAs。
34.如權(quán)利要求33所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中與缺氧疾病因子有關(guān)的siRNAs是與選自成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 (FGF2)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)等中的至少一種腫瘤細(xì)胞增殖因子有關(guān)的siRNAs。
35.藥物組合物，包含權(quán)利要求22至34中任一權(quán)利要求所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的分泌信號(hào)、含分泌信號(hào)的新的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒、被該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化厭氧菌、由該厭氧菌形成的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體、含有該載體的藥物組合物。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102834514SQ20118000753
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日
發(fā)明者島谷裕子, 清水瞳, 佐佐木貴之 申請(qǐng)人:阿內(nèi)羅藥物科學(xué)株式會(huì)社