專(zhuān)利名稱(chēng)：花生2s-4b蛋白及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及花生2s_4b蛋白及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
癌癥是目前嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康與生命的“三大殺手”之一，其發(fā)生率逐年增高，在2008年，全世界有2500，0000癌癥病人，估計(jì)有1200，0000癌癥新增病例，700，0000人萬(wàn)死于癌癥。預(yù)計(jì)在2030年將有2700，0000癌癥病人，1700，0000人死于癌癥(World cancerreport 2008)。其中超過(guò)一半的癌癥病例和60%的癌癥死亡病例發(fā)生在中等達(dá)國(guó)家。而在所有的癌癥中，肺癌的發(fā)病率和死亡率都是最高的。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)為肺癌的主要類(lèi)型，占肺癌的75% 80%。手術(shù)為其首選的治療方法。但由于當(dāng)前肺癌的早期診斷水平有限，70% 80%的患者確診時(shí)已屬晚期，總的治愈率不足10%。肺腺癌是腫瘤臨床中非 小細(xì)胞肺癌(NSCLC)常見(jiàn)的類(lèi)型之一，具有易侵襲、易轉(zhuǎn)移和易產(chǎn)生耐藥等特點(diǎn)，因此還亟 待尋找更有效的治療肺腺癌藥物(Collins，2005 ；Kopper, 2004)o胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor, TI)泛指具有胰蛋白酶抑制活性的多肽或蛋白質(zhì)，廣泛存在于動(dòng)、植物和微生物中，能與相應(yīng)的蛋白水解酶形成一定的動(dòng)態(tài)平衡，具有多種生物活性，調(diào)節(jié)生物體內(nèi)許多重要的生命活動(dòng)，而且很多已被開(kāi)發(fā)為新藥，是一種重要的生化藥物和生化試劑(Maya，1997)。因此，人們對(duì)腫瘤相關(guān)的胰蛋白酶抑制劑(tumor-associated trypsininhibitor, TATI)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用越來(lái)越感興趣。國(guó)內(nèi)外眾多的研究表明植物胰蛋白酶抑制劑具有抗腫瘤的功能。可能是一種新的抗腫瘤藥物?；ㄉ鞍卓鼓[瘤的作用是近幾年才受到人們的關(guān)注，相關(guān)研究不多，并沒(méi)有深入研究它對(duì)腫瘤的影響及其作用機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)室段小華(2004)從花生種子中純化分離出一個(gè)具有胰蛋白酶抑制活性的2s清蛋白。經(jīng)PAGE、HPLC分離，純化的2s清蛋白含有兩條多肽，而經(jīng)SDS-PAGE分析，此2s清蛋白由5種低分子量的亞基組成。溫韻潔(2008)發(fā)現(xiàn)2s蛋白各組分對(duì)胰蛋白酶均有一定的抑制作用?；ㄉ?s蛋白對(duì)胰蛋白酶具有抑制作用，此外，還對(duì)淀粉酶有一定的抑制作用，但對(duì)胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶無(wú)抑制作用。對(duì)該蛋白進(jìn)行氨基酸分析發(fā)現(xiàn)它富含Cys,屬于Bowman-Birk胰蛋白酶抑制劑類(lèi)(BBI) (Tixier, 1968 ;楊曉泉等，1998)。黃葉可(2010)利用雙向電泳發(fā)現(xiàn)每種亞基并不是由單一蛋白組成。植智聰(2010)對(duì)花生種子2s清白中的2s-4b進(jìn)行基因克隆、原核表達(dá)。有研究表明，花生仁、花生油、花生殼、花生種皮、莖、葉、芽等均有藥用價(jià)值(周萍等，2008)。但是對(duì)花生中的2s清蛋白的藥用價(jià)值研究較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是基于實(shí)驗(yàn)室研究的基礎(chǔ)上，對(duì)花生種子2s清蛋白中的2s_4b融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，純化和復(fù)性，以及對(duì)2s-4b融合蛋白進(jìn)行腸激酶酶切制備2s-4b單體蛋白，并對(duì)其蛋白酶抑制劑活性進(jìn)行測(cè)定。
本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明公開(kāi)了一種新型抗腫瘤蛋白花生2s_4b蛋白，運(yùn)用生物信息學(xué)手段對(duì)辦-必編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、性質(zhì)與功能進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，得知其開(kāi)放閱讀框(ORF)共含519 bp,包括起始密碼子ATG和終止密碼子TAA，編碼172個(gè)氨基酸，分子量為20. I kDa，等電點(diǎn)為5.96。必編碼蛋白的N端含有一個(gè)長(zhǎng)約20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，具有AAI結(jié)構(gòu)域；其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋組成。上述花生2s_4b蛋白，由2s_4b融合蛋白酶切后得到，不含有載體蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。本發(fā)明還公開(kāi)了上述融合蛋白的原核表達(dá)載體ρΕΤ-32α-·&-必。本發(fā)明還公開(kāi)了 2s_4b蛋白的制備方法包括如下步驟I.2s-4b cDNA 的克隆
提取花生總RNA并對(duì)RNA的含量和質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，從花生總RNA合成第一鏈cDNA與3’ -CDNA0根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室獲得的2s蛋白MS-MS結(jié)果見(jiàn)圖2、表2_1和表2_2，設(shè)計(jì)2s_4b的簡(jiǎn)并引物。進(jìn)行PCR，回收目的條帶進(jìn)行亞克隆和測(cè)序，獲得2s-4b基因簡(jiǎn)并引物片段。根據(jù)簡(jiǎn)并引物所得的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)辦-必3’-RACE上游引物進(jìn)行3’-RACE的PCR擴(kuò)增。根據(jù)簡(jiǎn)并引物所得的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)必5’ -RACE下游引物采用TaKaRa公司5’ -Full RACEKit試劑盒，從花生cDNA中擴(kuò)增目的基因5’端片段。將3’和5’ -RACE測(cè)序獲得的3’和5’ -cDNA末端在DNAMAN6. O上進(jìn)行序列拼接，獲得一條cDNA全長(zhǎng)序列。比對(duì)該序列與MS結(jié)果上的氨基酸位點(diǎn)，確定其為2s-4b基因。2. pET-32a-2s-4b原核表達(dá)載體的構(gòu)建
取含有pET_32a空質(zhì)粒的DH5a菌進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。將辦-必基因純化產(chǎn)物和pET-32a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收純化酶切產(chǎn)物。然后將2s-4b基因與pET_32a質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建成功ρΕΤ-32α-·&-必重組質(zhì)粒。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到沿xseiia-gaffii菌株的感受態(tài)細(xì)胞中。3. 2s-4b融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及酶切
將含有表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-_&-必的Rosetta-gami菌進(jìn)行培養(yǎng)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，得到一條分子量40 kDa的目的條帶。然后離心收集菌體，用破碎緩沖液進(jìn)行破碎，離心去上清。將上清稀釋后上樣至His · Bind Resin Ni_charged親和層析柱，然后將目的蛋白洗脫。洗脫后的目的蛋白稀釋后在復(fù)興緩沖液中進(jìn)行復(fù)性，將復(fù)性后的的目的蛋白進(jìn)行胰蛋白酶抑制劑活性測(cè)定。將復(fù)性后的2s-4b融合蛋白濃縮用腸激酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物上樣至His · Bind Resin Ni_charged親和層析柱純化,洗脫回收不含載體蛋白的2s-4b蛋白。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，2 s-4b蛋白分子量為20 kDa左右，與軟件預(yù)測(cè)值一致。最后對(duì)回收的2s-4b蛋白進(jìn)行濃縮和胰蛋白酶抑制劑活性測(cè)定，期胰蛋白酶抑制劑活性略高于2s-4b融合蛋白。通過(guò)檢測(cè)，證明所獲得的蛋白為具有胰蛋白酶抑制劑活性2s-4b蛋白。本發(fā)明還公開(kāi)了 2s_4b蛋白的抗腫瘤用途。以肺腺癌A549細(xì)胞為靶細(xì)胞，以不同濃度的2s-4b蛋白體外處理細(xì)胞后，采用MTT檢測(cè)、形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞檢測(cè)等方法測(cè)定2s-4b蛋白體外誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞的凋亡作用。研究結(jié)果表明，2s-4b蛋白對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的抑制率可達(dá)到90%，早期凋亡率最高可達(dá)到37. 4%，對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的抑制效果明顯。本發(fā)明還公開(kāi)了 2s_4b蛋白誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞的凋亡機(jī)制。通過(guò)人類(lèi)全基因芯片對(duì)2s-4b蛋白處理后的和未經(jīng)2s-4b蛋白處理的肺腺癌A549細(xì)胞的基因進(jìn)行分析。人類(lèi)全基因芯片提供的基因列表共23229個(gè)基因共檢測(cè)到9940個(gè)基因，差異表達(dá)基因共499個(gè)。經(jīng)過(guò)篩選后得出，A549細(xì)胞在2s_4b蛋白處理前后共有18個(gè)與凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生改變。2s-4b蛋白處理A549細(xì)胞后與凋亡相關(guān)的差異表達(dá)基因有Apaf-I> Caspase3> Caspase7> Caspase8> Caspase6>IAP> Trai Ir> TRADD> Endog 等 9 個(gè)。與細(xì)胞周期調(diào)控通路相關(guān)的差異表達(dá)基因有P21cipl、P57kip2、Skp2、P19ink4d、P18ink4c、CycE、Gadd45、CDK7、GSK3 β 等 9 條。本發(fā)明所用的辦-必簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增序列如SEQ ID Ν0:2所示；所用的辦-必3’RACE序列如SEQ ID NO: 3所示；所用的辦-必5’RACE序列如SEQ ID NO:4所示；辦-必拼接全長(zhǎng)序列如SEQ ID N0:5所示。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明中基因克隆采用的是RACE (Rapid Amplication of cDNA Ends, cDNA末端快速擴(kuò)增)技術(shù)，該技術(shù)由已知的部分cDNA序列擴(kuò)增出完整的cDNA的5’末端和3’末端，是一種簡(jiǎn)單可靠和有效的方法。利用原核表達(dá)體系，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)2s-4b融合蛋白在大腸桿菌中的簡(jiǎn)單、快速、高效的表達(dá)。本發(fā)明公開(kāi)的2s_4b融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)量占全菌蛋白含量的58 %。結(jié)合簡(jiǎn)單的分離純化步驟易得到純度85 %的2s-4b融合蛋白。采用透析的方法通過(guò)逐漸降低外透液濃度緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)。通過(guò)腸激酶酶切可切掉2s-4b融合蛋白中的載體蛋白，經(jīng)再次純化得到2s-4b蛋白片段，排除載體蛋白帶來(lái)的影響。采用本發(fā)明的蛋白序列和表達(dá)體系容易制備大量該蛋白，利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明還對(duì)該蛋白對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的抑制作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)。該蛋白能抑制肺腺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，其IC50為150 Pg/mL左右。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)2s_4b蛋白作用A549細(xì)胞后可清楚觀察到細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，并且呈現(xiàn)顯著量效、時(shí)效的依賴(lài)關(guān)系。經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，2s-4b蛋白作用A549細(xì)胞后細(xì)胞被特異性的阻滯在Gl期，細(xì)胞最高早期凋亡率達(dá)到37. 4%。該蛋白對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞具有較好的抑制效果，可能具有更好的臨床應(yīng)用效果O


表I為2s_4b MS分析結(jié)果；
表2為2s-4b MS分析所得的氨基酸片段；
圖I為花生總RNA的質(zhì)量分析；
圖2 4是2s-4b簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增片段、3’序列及5’序列的獲得，其中，k為2s-4b簡(jiǎn)并引物PCR電泳圖，B為2s-4b 3’ RACE PCR電泳圖，C為2s_4b 5’ RACE PCR電泳 圖5為2s-4b拼接2s-4b含酶切位點(diǎn)cDNA PCR電泳 圖 6 為 pET-32a-2s-4b 重組質(zhì)粒雙酶切，其中，Ml DL2000 DNA Marker ；M2 :250 bpDNA Ladder Marker ；1 :pET-32a-2s_4b 重組質(zhì)粒，2 :pET-32a-2s_4b 重組質(zhì)粒雙酶切；3 pET-32a-2s-4b 重組質(zhì)粒單酶切，4 :pET_32a 質(zhì)粒；5 :pET_32a 質(zhì)粒雙酶切，6 :pET_32a質(zhì)粒單酶切；
圖7為2S粗蛋白的2D-SDS-PAGE電泳；
圖8為2s-4b融合蛋誘導(dǎo)表達(dá)，其中，M:低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，1、2、3 :IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)；
圖9為包涵體的復(fù)性，其中，M :低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，1、2、3 :復(fù)性后的2s-4b融合蛋
白；
圖10為2s-4b融合蛋白復(fù)性后蛋白酶抑制劑活性測(cè)定；
圖11為2s-4b融合蛋白酶切，其中，M低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，框中為目的條帶；
圖12為2s-4b融合蛋白酶切純化效果檢測(cè)，其中，M :低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，I :2s-4b蛋 白，2 :2s-4b融合蛋白；
圖13為2s-4b蛋白對(duì)肺腺癌細(xì)胞的抑制率；
圖14為熒光顯微鏡觀察2s-4b蛋白誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞；
圖15為流式細(xì)胞檢測(cè)2s-4b蛋白處理A549細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何限定。實(shí)施例I 2s_4b cDNA的克隆
I.采用本領(lǐng)域常規(guī)的Trizol法提取花生總RNA。2. RT-PCR 檢測(cè)
3.從花生總RNA合成第一鏈cDNA與3’ -cDNA
使用 TaKaRa PrimeScrioptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考相關(guān)試劑盒說(shuō)明即可(圖I)。4. 2s-4b基因簡(jiǎn)并引物片段的獲得
根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室獲得的2s蛋白MS-MS結(jié)果，設(shè)計(jì)2s-4b的簡(jiǎn)并上下游引物如SEQ IDNO: 6 7 所示。其中 R = A/G, Y = C/T, M = A/C, K = G/T, S = C/G, W = A/T, H = A/C/T, B=C/G/T, = A/C/G，D = A/G/T，N=A/C/G/T。在一個(gè) 200 μ L Eppendorf 薄壁管中配制 60μ L PCR反應(yīng)體系。5. 2s-4b cDNA 3’ 端的獲得
根據(jù)簡(jiǎn)并引物所得的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)2s-4b 3’ - RACE上游引物如SEQ ID N0:8 9所
/Jn ο采用辦-必3-1、辦-必3-2與試劑盒提供的通用引物AUAP (如SEQ ID NO: 10所示)組合進(jìn)行3’ -RACE的PCR擴(kuò)增。6. 2s-4b 的 5’ RACE 片段的獲得
根據(jù)簡(jiǎn)并引物所得的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)2s-4b 5’-RACE下游引物如SEQ ID N0:ll 14所
/Jn ο采用TaKaRa公司5’_Full RACE Kit試劑盒，從花生cDNA中擴(kuò)增目的基因5’端片段。7. 2s-4b cDNA編碼區(qū)序列的獲得將3’和5’-RACE測(cè)序獲得的3’和5’-cDNA末端在DNAMAN6. O上進(jìn)行序列拼接，獲得一條cDNA全長(zhǎng)序列。比對(duì)該序列與MS結(jié)果上的氨基酸位點(diǎn)，確定其為目的基因。通過(guò)分析已經(jīng)得到的辦-必的cDNA序列與pET32a載體的酶切位點(diǎn)，選擇Nco I與NotI這兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶，設(shè)計(jì)引物辦-必-NcoF (如SEQ ID NO: 15所示)和辦-必-NotR (如SEQ ID NO: 16 所示)。實(shí)施例2 m~^-2s-4b原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 \.2s~4b基因PCR產(chǎn)物的純化
使用 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit 對(duì) 2s_4b 的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化。2.2s~4b基因純化產(chǎn)物和pET_32a質(zhì)粒的雙酶切 3.酶切產(chǎn)物膠回收純化
2s_4b基因酶切產(chǎn)物的純化使用TaKaRa DNA片段純化試劑盒進(jìn)行。4.2s~4b基因與pET_32a質(zhì)粒的連接 使用TaKaRa公司的T4 DNA Ligase進(jìn)行連接。5.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
6.重組質(zhì)粒pET-32a-_&-必的轉(zhuǎn)化
7.重組質(zhì)粒的檢測(cè)
通過(guò)PCR鑒定抗性板上的大腸桿菌中pET-32a質(zhì)粒是否連接了 2s_4b全長(zhǎng)cDNA片段。pET-32a-_&-必重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定。實(shí)施例同源基因反義消減載體和正向過(guò)表
I.2s-4b融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
(I)將pET-32a-2s_4b重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta-gami中。(2)挑單菌落接種于2 ml含有四抗的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C，200 rpm培養(yǎng)12 h0(3)取200 μ 初搖菌液于20 ml含有四抗的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C, 200 rpm培養(yǎng)4 5 h (測(cè)定菌液0D590=0. 5 I. 9)。 (4)當(dāng)菌液0D590到達(dá)O. 5 I. 9時(shí)，取出I ml菌液，10，000 X g，室溫離心Imin，棄培養(yǎng)液，加入100 μ 滅菌的PBS重懸菌體，-20 °C保存。(5)向剩余的培養(yǎng)菌液中加入IPTG使終濃度達(dá)到0.1 mM和I mM，在37 °C, 200rpm培養(yǎng),誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。(6)誘導(dǎo)I h、2 h、3 h和4 h的時(shí)候分別取出2 ml菌液(I ml/管)一管用于測(cè)定菌液濃度(0D590)，另一管10，000 X g，室溫離心I min，棄培養(yǎng)液，加入100 μ 滅菌的PBS重懸菌體，-20 °C保存。(7)按PBS重懸樣品液滅菌雙蒸水2XSDS電泳裂解液=1 4 5配制電泳樣品液，沸水浴5min后，13，000 X g，室溫離心5 min，取上清進(jìn)行12.5 %的SDS-PAGE電泳，電泳后膠板進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)R-250染色，12 %甲醇-8 %乙酸脫色。2. 2s-4b融合蛋白包涵體變性溶解
(I)收集28 V O. 5 mM IPTG誘導(dǎo)的培養(yǎng)菌液，4 V 12000 X g離心10 min，收集沉淀的菌體。(2)取O. I g菌體加10 mL破碎緩沖液(IX結(jié)合緩沖液，8 M尿素，2 mM DTT,5 mg/ml溶菌酶，pH 7. 9)混勻，在冰上放置30 min后，室溫放置過(guò)夜。(3)破碎后的菌液用I mL注射器吹打至不粘稠，12000 X g，4 V離心I min，上清即為包涵體溶解液。3. 2s-4b融合蛋白包涵體的純化
(I)取I ml鎳瓊脂糖凝膠預(yù)裝柱，加4倍柱體積的雙蒸水洗柱。用6倍柱體積的IX清洗緩沖液洗柱。用4倍柱體積的IX結(jié)合緩沖液(含8 M尿素)平衡柱子。(2)取包涵體溶解液I ml以O(shè). 5 ml/min上樣，反復(fù)上樣I h。
(3)用9倍柱體積的IX結(jié)合緩沖液(含8 M尿素)洗去未吸附的樣品，流速
O.5 ml/min, 2 ml/ 管收集。(4)用6倍柱體積的IX洗滌緩沖液(含8 M尿素)洗去雜質(zhì)，流速0.5 ml/min。用4倍柱體積的IX洗脫緩沖液(分別含20、50、100、250、500 mM咪唑，8 M尿素)梯度洗脫目的蛋白，流速0.5 ml/min, 2 ml/管收集。收集的部分用12.5%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)純度，并用考瑪斯亮藍(lán)法測(cè)定純化蛋白的濃度。4.包涵體的復(fù)性
參考Bovine Prethrombin等(1990)的方法,稍作修改后進(jìn)行包涵體的復(fù)性。(I)純化后的融合蛋白稀釋至蛋白濃度為O. 025、· I mg/mL。(2)使用尿素梯度濃度透析復(fù)性復(fù)性液(100 mM Na2HPO4, 2 mM EDTA，0. I mMGSSG，0. 2 mM GSH，pH 7. 9)含尿素濃度分別為6 M、4 M、2 M，每個(gè)濃度在4 V透析24h0(3)最后在4 °C透析于PBS緩沖液24 h，中間更換一次PBS緩沖液。(4)復(fù)性好的蛋白利用超濾管進(jìn)行濃縮。(5)濃縮好的蛋白儲(chǔ)存于-20 0C冰箱，用12. 5% SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純度，并用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。5. 2s-4b融合蛋白蛋白酶切
將I ml復(fù)性、濃縮后的2s-4b融合蛋白與10 μ 重組腸激酶混合，在25 °C下酶切過(guò)夜。酶切后的蛋白用His · Bind Resin Ni-charged親和層析柱進(jìn)行純化,2s_4b片段上未連有His標(biāo)簽將不會(huì)與柱子結(jié)合，而切下的硫氧還蛋白片段上連有His標(biāo)簽會(huì)與柱子結(jié)合，那么用PBS洗脫下來(lái)就是2s-4b片段。6.目的蛋白胰蛋白酶抑制活性的測(cè)定
方法參照 Norika 等(1982)和 Raya-Duarte 等(1992)。(I)取出0.1 ml復(fù)性后的2s_4b重組蛋白，加入O. I ml 2. 5 mg/ml的胰蛋白酶液，37 0C水浴20 30 min。(2)加入 I ml 的 I mM 的 BAPNA 溶液，37 °C水浴 10 min。(3)加入0.2 ml的30%醋酸終止酶反應(yīng)。(4)4 V 放置 30 min。(5)4 °C, 10, 000 X g離心5 min (保證溶液不混池)
(6)測(cè)上清液410 nm處光吸收值(Al)
以PBS緩沖液代替胰蛋白酶液作為空白對(duì)照；以PBS緩沖液代替蛋白樣品作為無(wú)抑制劑對(duì)照，測(cè)定光密度值(A2)即
權(quán)利要求
1.花生2s-4b蛋白，其特征在于由2s-4b融合蛋白酶切后得到，不含有載體蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。
2.權(quán)利要求I所述花生2s-4b蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于包括如下步驟 Cl) 2s-4b蛋白cDNA的克?。? (2)pET-32a-2s-4b原核表達(dá)載體的構(gòu)建； (3)2s-4b融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及酶切。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了花生2s清蛋白組分中2s-4b蛋白及其生產(chǎn)方法。本發(fā)明根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室得到的花生2s蛋白雙向電泳及2s-4b的MS質(zhì)譜分析結(jié)果，設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，采用RACE的方法克隆出2s-4b基因。構(gòu)建pET-32a-2s-4b融合表達(dá)載體，誘導(dǎo)得到大小約40kDa的2s-4b融合蛋白，對(duì)2s-4b融合進(jìn)行復(fù)性、腸激酶酶切得到具有蛋白酶抑制劑活性的2s-4b蛋白。本發(fā)明2s-4b蛋白能誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡，并對(duì)其凋亡機(jī)制進(jìn)行了研究。具有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明蛋白的特點(diǎn)是，可在大腸桿菌中高效表達(dá)、穩(wěn)定性好、純度高且有高活性，適合規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102816232SQ201110453668
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者賓金華, 張子明, 植智聰, 龍明慧 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)