專利名稱：一種姜花萜類花香基因Hctps1啟動子及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種姜花萜類花香基因啟動子及其應用。
背景技術(shù)：
WiVcXHedychium coronarium Koenig)是單子葉植物，為姜科姜花屬多年生草本植物。姜科花卉約有50個屬1500多種，代表性的品種有姜荷花、姜花、紅絲姜花、紅姜花、 郁金、紅花月桃、瓷玫瑰(火炬姜)等。不同的姜花品種其香氣不同，其中，白姜花花形優(yōu)美， 芳香濃郁，是園林綠化和夏季切花的優(yōu)良材料，也是提取芳香油的工業(yè)原料。高等植物發(fā)育過程中花的形成是一個十分復雜的過程，在這個過程中，大量基因的協(xié)同表達受到不同啟動子的調(diào)節(jié)和控制。例如菊花UEPl啟動子在傘形花序和花盤小花的花瓣中特異表達，其表達量是CaMV 35S啟動子的50倍(Annadana，2002，Transgenic Research，11 (4) :437-445)。將果實成熟期特異表達的E8啟動子和仙女扇的LIS基因?qū)敕?，成熟的果實合成并釋放香氣明顯的S-芳樟醇和8-羥基芳樟醇(Lewinsohn，2001， Plant Physiology, 127 (3) 1256-1265)。采用果實成熟時期的特異表達的PG啟動子，將檸檬羅烯香葉醇合成酶(GES)基因轉(zhuǎn)入番茄，該基因在轉(zhuǎn)基因番茄果實中過量表達導致香葉醇的積累量增加，改變了番茄果實風味(Davidovich，2007，Nature Biotechnology, 25 (8) 899-901)。利用APETALA1 (API)特異啟動子驅(qū)動在花分生組織和第1、2輪花器官中表達細胞分裂素合成酶(isopentyl transferase, IPT)基因IPT4，研究結(jié)果表明APETALA1啟動子驅(qū)動AtIPT4在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達導致花和花器官發(fā)育異常(于明明，2009，植物學報， 44 (1) :59-68)。番茄AOC啟動子轉(zhuǎn)化煙草發(fā)現(xiàn)，在花部器官可表達且表達受茉莉酸甲酯和傷處理的誘導(Irene Stenzel，2008，Phytochemistry 1859 - 1869)。這些特異性啟動子的應用為在植物中特異性地表達外源基因奠定了基礎(chǔ)。香氣是觀賞植物的重要品質(zhì)之一，與植物其他觀賞性狀的遺傳改良相比，植物花香代謝產(chǎn)物的多樣性及其相關(guān)酶和基因表達調(diào)控的復雜性增加了植物花香基因工程改良的難度。目前對花香基因啟動子的研究較少。旱蓮木HMGR基因hmgl啟動子可以在轉(zhuǎn)基因煙草表皮細胞中優(yōu)先表達⑶S報告基因(Burnett，1993，Plant Physiology, 103 (1) 41-48)。兩種山字草屬植物仙女扇和優(yōu)雅春再來都存在LIS基因，但后者基本沒有氣味且 LIS 基因僅在柱頭中表達(Cseke，1998，Molecular Biology and Evolution , 15 (11) 1491-1498)。對二者啟動子序列比較時發(fā)現(xiàn)，后者在推測的TATA-box和CAAT_box上游有插入片段，而其他序列則完全一致，所以可能是由于啟動子差異導致最后芳樟醇的釋放量大不相同。對姜花香氣研究發(fā)現(xiàn)，在姜花釋香中起作用的主要是萜類化合物，包括沉香醇、 羅勒烯、1，8_桉油醇、月桂烯、檜烯等(范燕萍等，2003，園藝學報，30 (4) :475_475)，并且 4種不同顏色姜花的釋香成分和含量都有顯著性差異(范燕萍等，2007，園藝學報，34 (1) 231-234)。在不同轉(zhuǎn)化體植物中，目標轉(zhuǎn)基因表達水平差異大，存在限速酶基因表達與目標產(chǎn)物合成有時不一致等問題(孫明等，2007，安徽農(nóng)業(yè)科學，35(11) :3169-3171)。在萜
3類和苯丙素類物質(zhì)及其衍生物中，除了花香物質(zhì)外還有大量的生理活性物質(zhì)，因此在改造相關(guān)代謝途徑的過程中，還可能會發(fā)生一些意想不到的代謝紊亂，采用花朵特異表達啟動子控制相關(guān)酶的表達可能會降低這一問題發(fā)生的概率(繆昊抿等，2007，分子植物育種， 5(6) 67-74)。通過啟動子的研究應用來調(diào)控基因表達，使植物目標產(chǎn)物在特定部位、特定時期和一定誘導條件下表達，為今后采用該花器官特異表達和在傷害、病蟲害誘導條件下改良植物的花香、花色和提高抗性有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中植物某一基因不能人為調(diào)控的缺陷，提供一種姜花萜類花香基因啟動子。本發(fā)明的另一目的是提供上述姜花萜類花香基因啟動子的應用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的
一種姜花萜類花香基因啟動子，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。啟動子是指基因上游一段可與RNA聚合酶及其他一些影響轉(zhuǎn)錄的反式因子結(jié)合而準確有效地起始轉(zhuǎn)錄的DNA序列。本發(fā)明克隆了姜花萜類花香基因端的上游調(diào)控序列，總長為1131bp，該序列具有啟動子活性，并且在花器官部分特異表達，是一個花特異性啟動子。本發(fā)明把所克隆的啟動子用在線軟件進行了轉(zhuǎn)錄起點的確定和相關(guān)作用元件的預測，ZfcTPW的5’端上游序列除了具有大多數(shù)高等植物啟動子所有的TATA-box和 CAAT-box等保守序列外，還具有許多與光調(diào)控有關(guān)的元件，如G-box、GAG-moti f、ATCT -motif等反應元件；許多與逆境調(diào)控相關(guān)的元件，如CGTCA-motif、CAT_box、TCA-element 等響應元件。一種表達載體，其特征在于含有上述姜花萜類花香基因啟動子，如將該啟動子序列插入載體PCAMBIA1300G的多克隆位點構(gòu)建而成的表達載體等。含有上述表達載體的基因工程菌，優(yōu)選宿主菌為大腸桿菌DH5 α，即表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(五co/i)DH5a。本發(fā)明的姜花萜類花香基因啟動子在調(diào)控下游基因表達中的應用。如制備轉(zhuǎn)基因植物，將該姜花萜類花香基因連接到植物轉(zhuǎn)化載體中，然后導入姜花或其它植物細胞中，獲得表達所述姜花萜類花香基因啟動子的轉(zhuǎn)基因花香品種或抗性品種。在姜花萜類花香基因論啟動子在調(diào)控下游基因表達時，可以通過茉莉酸甲酯或損傷處理進行誘導。本發(fā)明的姜花萜類花香基因啟動子還可以用于鑒定姜花或其它植物的花香基因型，如根據(jù)該基因產(chǎn)生的特異性分子標記，制備分子探針進行鑒別。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明的姜花萜類花香基因啟動子啟動活性高，能夠調(diào)控植物花香形成的相關(guān)萜類合成酶，且可人為控制，為以后采用基因工程技術(shù)研究TPS基因家族成員的姜花花香中的作用、改良植物的觀賞性狀、花卉品質(zhì)等提供了有用的分子工具，在植物基因工程領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。


圖1.實施例2 Hctpsl啟動子轉(zhuǎn)基因煙草植株特異PCR檢測，其中質(zhì)粒-.Hctpsl 啟動子_gus重組質(zhì)粒；M =DNA DL 2000分子量標準；CK 未轉(zhuǎn)化植株；0_16 特異引物擴增的PCR產(chǎn)物。圖2.實施例Wctpsl啟動子轉(zhuǎn)化煙草后的⑶S活性表達，A，野生型煙草花瓣；B， 未誘導轉(zhuǎn)基因煙草花瓣；C，MeJA處理后花瓣中；D，傷害處理后花瓣中；E，未誘導花萼；F， 傷害處理后花萼；G，未誘導莖中；H，傷害處理后莖中；I，未誘導葉；J，MeJA處理后葉中；K， 蟲害處理后葉和維管束中；L，傷害處理后幼嫩葉子。
具體實施例方式實施例1白姜花花香基因&啟動子的獲得 1.實驗材料和試劑
白姜花材料白姜花的葉片。菌種大腸桿菌五coli DH5a。載體pCAMBIA1300G。工具酶和修飾酶各種限制性內(nèi)切酶和修飾酶購自Promega公司和TAKARA公司?；瘜W試劑 化學藥品均為國產(chǎn)分析純。試劑盒質(zhì)粒DNA提取用試劑盒為上海生工公司產(chǎn)品；回收DNA 用試劑盒為上海生工公司的DNA片段快速純化/回收試劑盒；引物合成由上海生工公司合成。測序由深圳華大基因科技有限公司完成。2. DNA 的提取
實驗以姜花的葉片為材料，用改良的CTAB法提取DNA，具體步驟如下 (1)取姜花葉片0. Γ0. 2g在液氮中研磨后轉(zhuǎn)移至1. 5ml離心管中。(2)加入 1 ml CTAB (Tris 100 mM，NaCl 1.4 Μ, 20 mM EDTA，CTAB 2%，巰基乙醇 0. 1%)，65°C，30分鐘。每隔10分鐘，顛倒一次。(3)加Iml酚氯仿(1 1)混合液，顛倒幾次，10000 rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清至一新的離心管，加等體積的氯仿異戊醇04 1)，混勻，10000 rpm離心10分鐘。轉(zhuǎn)
移上清至一新的離心管。(4)加等體積的異丙醇，顛倒混勻，10000 rpm離心10分鐘，除去上清，70%乙醇洗一次，真空抽干，溶于30 μ L的無菌水中，用于PCR檢測。3.論77^/啟動子全長序列的獲得
采用hiTAIL-PCR技術(shù)克隆論7757的5'端上游調(diào)控序列。根據(jù)已知的論7757的 DNA序列，在其5'端設(shè)計3個向外的特異性巢式引物spl、sp2、sp3，隨機簡并引物參照 Liu 禾口 Chen 等(2007, High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences.Biotechniques,43 (5) :649- 650,652, 654)文獻中設(shè)計的5個隨機簡并引物(LAD-I、2、3、4和ACl)，具體引物序列如下 spl 5' - CTG GTA ATT GGC CGA TCG CCT CGA -3，(SEQ ID N0:2)； sp2 5'- GCA TCG GAT GAG TGT GAG GCA CGG TTG CTT GAC G -3，(SEQ ID N0:3)； sp3 5'- GGT GGC GCA TCG CCG GAG TGC AAA GAG GTG -3， (SEQ ID N0:4)。擴增的體系和程序參照文獻(Liu和Chen等，High-efficiency thermalasymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences , Biotechniques，43 (5) :649- 650，652，654)中的進行。把擴增出DNA片段從瓊脂糖膠中回收并連接到PMD-19T vector，轉(zhuǎn)化五coli. DH5 α，酶切鑒定后測序，獲得論77^/基因5 ‘ 端上游調(diào)控序列，如SEQ ID NO: 1所示。實施例2 HcTPSl基因5'端啟動子功能分析 1.啟動子表達載體構(gòu)建
根據(jù)啟動子序列設(shè)計片段相對應的包含私BamHl酶切位點的特異引物，上下游引物分別命名為Pl和P2。片段引物序列
Pl 5' - GGC GCA TGC ATT ACG ATG GAC TCC AGA GC S Sphl (SEQ ID N0:5)； P2 5' - GGC GGA TCC GAT TTA GTG GCT TTT TGT TTT AG -3’3mHI (SEQ ID N0:6), 常規(guī)PCR擴增HcTPSl基因5 ‘端上游調(diào)控序列。pCAMBIA1300G植物表達載體用SphY稱BamHl限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠回收大片段。利用T4 DNA連接酶將目的片段(帶有酶切位點的論爐幻基因5'端上游調(diào)控序列)定向插入到植物表達載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(五colOm^a感受態(tài)細胞，經(jīng)酶切和測序鑒定后，獲得重組植物表達載體。制備根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞，將上述重組植物表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。2.啟動子表達載體在煙草的遺傳轉(zhuǎn)化
(1)預培養(yǎng)將無菌葉片切成0.5 cmX0.5 cm的小塊，接種在誘導培養(yǎng)基上進行預培養(yǎng)，光照培養(yǎng)纊3 d。2)農(nóng)桿菌侵染及共培養(yǎng)取預培養(yǎng)2 3 d后的材料，加入制備好的農(nóng)桿菌懸浮菌液，侵染5 10 min，倒掉菌液，取出外植體置于無菌吸水紙上吸去附著的菌液，重新置于原預培養(yǎng)基上，28 °C暗培養(yǎng)3 d。3)抑菌和篩選培養(yǎng)將共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)接到抑菌篩選培養(yǎng)基(MS+1. 0mg/L 6-BA+0. 2 mg/L NAA+250mg/LCarb+30 mg/L Hyp)上選擇培養(yǎng)20 d后，外植體的轉(zhuǎn)化細胞將產(chǎn)生抗性愈傷組織，將這些抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入相應的選擇分化培養(yǎng)基(MS+0. 1 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA +250 g/L Carb + 30 mg/L Hyp)上進行分化出芽培養(yǎng)。4)誘導生根在選擇生根培養(yǎng)基(l/^MS+250 mg/L Carb)上誘導約4周后，不定芽長至2 cm以上，將葉盤邊緣長出的幼芽從基部與葉盤切下，插入含有選擇壓的生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。5)煉苗、移栽及管理待植株生長出大量根時，準備移栽。先進行煉苗將組培苗從組培室拿出，旋松瓶蓋，在室內(nèi)放置廣7 d，每天曬廣2 h太陽；然后取出苗子，洗凈根系上的培養(yǎng)基，移栽到滅過菌的培養(yǎng)土中，移栽后罩上打有小孔的透明塑料，以保持759Γ85% 的濕度，25°C，光照150(T2500 Lux，光周期以每天光照14 16 h/8^10 h小時黑暗。培養(yǎng) 1(T15 d左右，移到室外進行適應生長。(6)轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測CTAB法提取抗性植株葉片基因組DNA，用預先設(shè)計的包含私BamHl酶切位點的論77^/基因特異引物及潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因引物如 II 進行PCR擴增，能擴增出條帶的為陽性植株。hpt II 引物上游引物5' -CTT CTA CAC AGC CAT CGG TCC AGA-3‘ (SEQ IDN0:7)；
下游引物5' -GAT GTA GGA GGG CGT GGA TAT GTC-3‘ (SEQ ID NO:8)。檢測結(jié)果見圖1，通過圖1可以看出，啟動子已經(jīng)轉(zhuǎn)化到煙草植株中。實施例3轉(zhuǎn)基因植株⑶S組織化學檢測 1.轉(zhuǎn)基因植株GUS組織化學染色
實驗材料為經(jīng)過PCR檢測初步確認的轉(zhuǎn)基因植株，用非轉(zhuǎn)基因植株作為陰性對照，取不同發(fā)育時期的根、莖、葉、花瓣、花萼、柱頭、花絲、花藥及花梗等部位進行染色、脫色，肉眼觀察并拍照記錄。GUS染色液的配制
權(quán)利要求
1.一種姜花萜類花香基因啟動子，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.一種表達載體，其特征在于含有權(quán)利要求1所述姜花萜類花香基因啟動子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達載體，其特征在于由權(quán)利要求1所述姜花萜類花香基因 Hctpsl啟動子插入載體pCAMBIA1300G的多克隆位點構(gòu)建而成。
4.一種基因工程菌，其特征在于含有權(quán)利要求2或3所述表達載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因工程菌，其特征在于宿主菌為大腸桿菌DH5α。
6.權(quán)利要求1所述啟動子在調(diào)控下游基因表達中的應用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于通過茉莉酸甲酯或損傷處理進行誘導表達。
8.權(quán)利要求1所述啟動子在鑒定姜花萜類花香基因中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種姜花萜類花香基因Hctps1啟動子及其應用。該姜花萜類花香基因Hctps1啟動子核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，總長為1131bp，是一個花特異性啟動子。本發(fā)明的姜花萜類花香基因Hctps1啟動子啟動活性高，能夠調(diào)控植物花香形成的相關(guān)萜類合成酶，且可人為控制，為以后采用基因工程技術(shù)研究TPS基因家族成員的姜花花香中的作用、改良植物的觀賞性狀、花卉品質(zhì)等提供了一種高效的分子工具，在植物基因工程領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/63GK102586250SQ201110453640
公開日2012年7月18日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者余讓才, 李昕悅, 玉云祎, 范燕萍, 鄭少緣 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學