專利名稱：阿維菌素的優(yōu)化生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種阿維菌素的優(yōu)化生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
阿維菌素具有高效、廣譜的抗各種線蟲和人類寄生蟲的活性，被廣泛地用于農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的病蟲害防治。從阿維鏈霉菌中共可分離得到八種阿維菌素組分，其中唯一有抗蟲活性的是組分Bla。另外，阿維鏈霉菌在發(fā)酵生產(chǎn)的過程中還會(huì)產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物寡霉素。阿維鏈霉菌的全基因組測序已經(jīng)完成，阿維菌素生物合成基因簇也已經(jīng)克隆定位 (Ikeda H, Ishikawa J, Hanamoto A, Shinose M, Kikuchi H, Shiba T, Sakaki Y, Hattori M, Omura S. Complete genome sequence and comparative analysis of the industrial microorganism Streptomyces avermitilis.(對(duì)工業(yè)微生物阿維鏈霉菌進(jìn)行完整的基因組測序和比較分析)Nat Biotechnol2003,21 :526-531) 0但是目前很多調(diào)節(jié)阿維菌素產(chǎn)量的因子尚不知其功能。雖然已有不少關(guān)于提高阿維菌素產(chǎn)量的研究，但是目前還沒有基于提高阿維菌素的外排效率來提高其產(chǎn)量的研究。腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由于含有一個(gè)腺苷三磷酸結(jié)合盒(ATP-binding cassette, ABC)而得名，可簡稱為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是膜整合蛋白，它利用水解ATP的能量對(duì)溶質(zhì)中各種生物分子進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。其轉(zhuǎn)運(yùn)的底物包括糖、氨基酸、 金屬離子、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞代謝產(chǎn)物和藥物等(Hollenstein K，Dawson RJ, Locher KP. Structure and mechanism of ABC transporter proteins. (ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)禾口機(jī)制)Curr Opin Struc Biol2007，17 :412-418)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核心結(jié)構(gòu)通常由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，包括2個(gè)高度疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembrane domain，TMD)，禾口 2 個(gè)核苷酸結(jié)合域(Nucleotide-binding domain， NBD)。TMD和NBD結(jié)構(gòu)域只有在形成二聚體時(shí)才具有轉(zhuǎn)運(yùn)活性。真核生物的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白比較常見的是，4個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域位于同一條多肽鏈上，稱為“全分子”ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；2個(gè)結(jié)構(gòu)域在1個(gè)亞基上(1個(gè)TMD與1個(gè)NBD融合)的情況也會(huì)發(fā)生，稱為“半分子” ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。而在原核生物中，常見的是每1個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成1個(gè)亞基，稱為“1/4分子”ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但也會(huì)存在1個(gè)亞基上具有2個(gè)或2個(gè)以上的結(jié)構(gòu)域(Kerr ID, Jones PM, George AM. Multidrug efflux pumps :the structures of prokaryotic ATP-binding cassette transporter efflux pumps and implications for our understanding of eukaryotic P-glycoproteins and homologues.(多藥物外排蛋白原核生物ABC外排蛋白的結(jié)構(gòu)及其對(duì)于理解真核生物P-糖蛋白與其同源物的啟示)FEBS J 2010,277:550-563)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白廣泛存在于真核和原核生物中，目前已知人類基因組中有48個(gè)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員。在大腸桿菌K-12基因組中，至少有80個(gè)編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因， 約占基因組的5%。近些年，對(duì)于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究熱點(diǎn)主要集中在與多藥耐藥性(Multidrugresistance,MDR)相關(guān)的人類ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上。腫瘤細(xì)胞的MDR是導(dǎo)致化療失敗的主要原因。早期的研究發(fā)現(xiàn)，MDR與細(xì)胞膜上某些蛋白的表達(dá)水平密切相關(guān)，由此找到了第一個(gè)與 MDR相關(guān)的人類ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白——P-糖蛋白(P-glycoproteimPgp)。隨后，研究者們又發(fā)現(xiàn)了以多種機(jī)制參與MDR形成的其它ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均具有藥物排出泵的功能。現(xiàn)在人們將腫瘤細(xì)胞MDR的主要原因歸于一個(gè)高度保守(從細(xì)菌到人類)的跨膜蛋白家族某些成員的過度表達(dá)，而這個(gè)家族正是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族。對(duì)全基因組已測序的阿維鏈霉菌進(jìn)行生物信息學(xué)的分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在阿維鏈霉菌的基因組里包含NBD結(jié)構(gòu)域的蛋白有148個(gè)，包含TMD結(jié)構(gòu)域的蛋白有183個(gè)，約占基因組的4.4%。阿維鏈霉菌擁有如此眾多的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因主要有兩個(gè)原因。一是它能產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物。從阿維鏈霉菌中能分離到大環(huán)內(nèi)酯、萜類等多種不同的次生代謝產(chǎn)物，如果不跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞質(zhì)或者通過區(qū)室化使其離開細(xì)胞質(zhì)，則其中大多數(shù)都會(huì)對(duì)鏈霉菌本身產(chǎn)生毒害作用。二是鏈霉菌直接接觸的環(huán)境中化合物豐富，化學(xué)成分極其復(fù)雜，很多化合物對(duì)其具有毒性?？缒まD(zhuǎn)運(yùn)一些對(duì)細(xì)胞有毒的物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的存活至關(guān)重要，而ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能在其中起著重要作用。sav933, sav934是位于阿維菌素生物合成基因簇上游的兩個(gè)基因，緊鄰全局調(diào)控因子 aveR(Kitani S, Ikeda H, Sakamoto Τ, Noguchi S, Nihira Τ. Characterization of a regulatory gene, aveR, for the biosynthesis of avermectin in Streptomyces avermitilis.(闡明阿維鏈霉菌中一個(gè)與阿維菌素生物合成相關(guān)的調(diào)控基因aveR)Appl Microbiol Biotech 2009，82 1089-1096)。對(duì) sav933、sav934 進(jìn)行生物信息學(xué)的分析，推測它們編碼的產(chǎn)物是屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族。sav933編碼一個(gè)核苷酸結(jié)合域(NBD)，推測它是位于胞內(nèi)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP結(jié)合亞基。sav934編碼一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD)，具有6 個(gè)典型的跨膜區(qū)，推測它是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白跨膜亞基。它們是典型的原核生物“每1個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成1個(gè)亞基”模式。1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域TMD和1個(gè)核苷酸結(jié)合域NBD并不能形成有功能的 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，只有當(dāng)它們再形成同源二聚體的時(shí)候，才能成為有功能的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。目前，與阿維菌素外排相關(guān)的基因并沒有相關(guān)研究報(bào)道。對(duì)SAV933、SAV934進(jìn)行詳細(xì)的生物信息學(xué)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們與崔西桿菌素外排蛋白BcrA有較高的同源性，并且與人類抗伊維菌素的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pgp具有較高的二級(jí)結(jié)構(gòu)同源性。這說明SAV933、SAV934 極有可能與阿維菌素或者其中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。通過構(gòu)建sav933、sav934的缺失突變株、定量分析胞內(nèi)胞外阿維菌素，證實(shí)了 SaV933、sav934與阿維菌素的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。本發(fā)明根據(jù)之前研究的空白和這一發(fā)現(xiàn)，設(shè)計(jì)了一個(gè)全新的提高阿維菌素產(chǎn)量的方法及質(zhì)粒，將負(fù)責(zé)阿維菌素外排的基因構(gòu)建在高拷貝載體上，構(gòu)建的質(zhì)?？梢栽诎⒕S鏈霉菌菌株中進(jìn)行表達(dá)，最大限度地減少胞內(nèi)反饋抑制，增加代謝產(chǎn)物的積累，有效提高阿維菌素有效組分Bla 的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種阿維菌素的優(yōu)化生產(chǎn)方法及其質(zhì)粒，通過在抗生素生產(chǎn)菌株里超量表達(dá)相應(yīng)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以增加抗生素的外排效率，從而通過減少反饋抑制來增加其產(chǎn)量。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明涉及一種阿維菌素的優(yōu)化生產(chǎn)方法，通過構(gòu)建帶sav933基因和sav934基因的高拷貝質(zhì)粒pFAveT，并將所述的高拷貝質(zhì)粒轉(zhuǎn)入阿維鏈霉菌NRRL 8165或阿維鏈霉菌 3-115中，實(shí)現(xiàn)阿維菌素產(chǎn)量的提高。所述的sav933基因如kq ID No. 1所示，是指ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP結(jié)合亞基基因；所述的sav934基因如kq ID No. 2所示，是指ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白跨膜亞基基因；所述的構(gòu)建是指將質(zhì)粒!^osmid 20B4用KpnI酶切，回收包含有sav933、sav934 的4. 5kb片段，回收的片段插入載體pJTU1278 KpnI酶切位點(diǎn)中。所述的高拷貝是指因?yàn)槟繕?biāo)質(zhì)粒帶PlJlOl復(fù)制子，所以每個(gè)鏈霉菌細(xì)胞中目標(biāo)質(zhì)粒的拷貝數(shù)達(dá)40-300的現(xiàn)象，首次記載于公開文獻(xiàn)《plJlOl，a multi-copy broad host-range Streptomyces plasmid :functional analysis and development of DNA cloning vectors.(一個(gè)高拷貝且具有廣譜宿主性的鏈霉菌質(zhì)粒plJlOl的功能分析和DNA 克隆載體的發(fā)展)》中，作者Kieser T, Hopwood DA, Wright HM, Thompson CJ. (Mol Gen Genet, 1982，185 :223-228)。所述的載體PJTU1278是含有硫鏈絲菌素抗性基因帶piJlOl復(fù)制子的高拷貝鏈霉菌游離型載體，首次記載于公開文獻(xiàn)《Two pHZ1358-derivative vectors for efficient gene knockout in Str印tomyces.(用于鏈霉菌屬高效基因敲除的兩種pHZ1358衍生載 #)》巾，## :He Y, Wang Ζ, Bai L, Liang J, Zhou X,Deng Z. (Journal of Microbiology and Biotechnology, 2010，20 :678-682),該載體保存于大腸桿菌菌株 DH10B, DHIOB/ pJTU1278(大腸埃希氏菌hcherichia coli DH10B/pJTU1278)已提交位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編100101 (中國微生物研究所)的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，其保藏登記編號(hào)為CGMCC N0. 5594，保藏日期2011-12-15。所述的質(zhì)粒R)smid 20B4,是指對(duì)阿維鏈霉菌構(gòu)建基因組文庫，阿維鏈霉菌的DNA 片段被克隆到含有大腸桿菌F因子的黏粒中，F(xiàn)osmid 20B4包含阿維菌素生物合成基因簇及其上游的部分基因。所述的轉(zhuǎn)入是指將構(gòu)建的質(zhì)粒pFAveT轉(zhuǎn)入大腸桿菌ET12567/pUZ8002中，與經(jīng)水浴熱激后的鏈霉菌孢子置于培養(yǎng)基平板上進(jìn)行共培養(yǎng)。具體步驟包括將構(gòu)建的質(zhì)粒 PFAveT轉(zhuǎn)入大腸桿菌ET12567/pUZ8002中并挑轉(zhuǎn)化子在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)攜帶有轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的大腸桿菌ET12567/pUZ8002，37°C培養(yǎng)，OD600 = 0. 4-0. 6左右時(shí)收集菌體，用新鮮LB 培養(yǎng)基洗滌菌體2次備用；將鏈霉菌孢子懸浮于3mLTES緩沖液中，然后在50°C水浴中熱激 lOmin，冷卻至室溫后加入等體積孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)2-2. 5小時(shí)，離心收集孢子并用新鮮LB培養(yǎng)基洗滌1次，重新懸浮于適量的LB培養(yǎng)基中，按2女IO8 IO8與大腸桿菌細(xì)胞混合后涂在SFM培養(yǎng)基平板上，吹干后放在30°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，16-24小時(shí)后用含萘啶酮酸和硫鏈絲菌素的ImL無菌水覆蓋平板，置30°C培養(yǎng)4-7天后即可看到接合轉(zhuǎn)移子。所述的液體LB培養(yǎng)基內(nèi)含有終濃度為25 μ g/mL的氯霉素，50 μ g/mL的卡那霉素和100 μ g/mL的氨芐青霉素。所述的TES緩沖液的濃度為0. 05mol/L, pH值為8. 0。所述的孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基組分為=Difco酵母粉(m/v)，Difco酪蛋白氨基酸 1% (m/v)，CaCl2 0. 01mol/L。
所述的SFM培養(yǎng)基平板組分為2%瓊脂(m/v)，2%甘露醇(m/v)，2 %黃豆餅粉 (m/v)，培養(yǎng)平板pH值為7. 2 7. 5。所述的無菌水覆蓋平板，添加萘啶酮酸的終濃度為50yg/mL，硫鏈絲菌素為 12.5 μ g/mL0所述的大腸桿菌ET12567/pUZ8002首次記載于公開文獻(xiàn)《Evidence that the extracytoplasmic function sigma factor σ E is required for normal cell wall structure in Streptomyces coelicolor A3Q)(位于外細(xì)胞質(zhì)的σ E是天藍(lán)色鏈霉菌 A3 (2)正常細(xì)胞壁形成所必須的功能因子)》，作者Paget MS, Chamberlin L，Atrih A, Foster SJ, Buttner MJ. (J Bacteriol,1999,181 :204-211)。所述的阿維鏈霉菌NRRL 8165是指阿維菌素的原始產(chǎn)生菌株，首次記載于公開文獻(xiàn)《Avermectins，new family of potent anthelmintic agent !Producing organism and fermentation.(高效殺蟲劑的新家族阿維菌素的產(chǎn)生菌株及發(fā)酵)》，作者Burg Rff, Miller BM, Baker EE, Birnbaum J, Currie SA, Hartman R, Kong YL, Monaghan RL, Olson G, Putter I, Tunac JB, Wallick H, Stapley E0, Oiwa R, Omura S. (Antimicrob Agents Chemother, 1979，15 :361-367)。該菌株保藏在位于華盛頓特區(qū)獨(dú)立大道1400號(hào)，郵編 20250的美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心NRRL，編號(hào)為NRRL 8165，該菌株可通過購買的方式公開獲得。所述的阿維鏈霉菌3-115 (CGMCC No. 3229)是指阿維菌素Bla的工業(yè)高產(chǎn)菌株， 張立新實(shí)驗(yàn)室通過多輪傳統(tǒng)誘變育種的方式制備得到，阿維菌素Bla組分的產(chǎn)量相比于 ATCC31267 提高了 ；35 倍，達(dá)到 4167mg/L。上述阿維鏈霉菌3-115首次記載于公開文獻(xiàn)《Identification of avermectin-high-producing strains by high-throughput screening methods (通過高通量篩選法確定阿維菌素高產(chǎn)菌株)》，作者=Gao H，Liu M，Zhou X，Liu J，Zhuo Y，Gou Z， Xu B, Zhang W, Liu X, Luo A, Zheng C, Chen X, Zhang L. (Appl Microbiol Biotechnol, 2010,85 :1219-1225)，在此文獻(xiàn)中公開了其保藏編號(hào)為CGMCC N0. 32四。所述的阿維鏈霉菌3-115(阿維鏈霉菌 Mi^ptomyces avermitilis ZLX6003) 已提交位于北京市朝陽區(qū)大屯路，郵編100101(中國微生物研究所)的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，其保藏登記編號(hào)為CGMCC N0. 3229，保藏日期 2009-8-18，其保藏名稱為ZLX6003。上述基因工程菌株可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)阿維菌素，阿維菌素為獸用殺蟲、殺螨劑，對(duì)螨類和昆蟲具有胃毒和觸殺作用，主要用于清除家禽、家畜體內(nèi)外寄生蟲和農(nóng)作物害蟲。本發(fā)明提供了一種提高鏈霉菌抗生素產(chǎn)量的方法和質(zhì)粒，將對(duì)抗生素的外排有促進(jìn)作用的2個(gè)基因構(gòu)建在一個(gè)載體上，利用接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入鏈霉菌中同時(shí)進(jìn)行高效表達(dá)以提
高抗生素的產(chǎn)量。


圖1為表達(dá)質(zhì)粒pFAveT的構(gòu)建圖。圖2為菌株8165/pFAveT中aveAIII、sav933、sav9;34基因表達(dá)量的實(shí)時(shí)定量 RT-PCR檢測圖。
圖3為高效液相色譜法定量分析SaV933、SaV934基因高拷貝菌株8165/pFAveT相比于帶空載體的對(duì)照菌株8165/pJTU1278阿維菌素Bla組分和副產(chǎn)物寡霉素A組分的產(chǎn)量變化圖。圖4為阿維菌素Bla組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖5為定量分析工業(yè)高拷貝菌株3-115/pFAveT相比于對(duì)照菌株3_115/pJTU1278 阿維菌素Bla組分的產(chǎn)量變化圖。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1阿維鏈霉菌目標(biāo)抗生素產(chǎn)量的提高隨著分子生物學(xué)以及生物工程技術(shù)在抗生素育種領(lǐng)域的應(yīng)用，基因工程育種技術(shù)已成為主要的工業(yè)生產(chǎn)菌種改良手段。本發(fā)明是通過提高抗生素的主動(dòng)外排效率來提高抗生素的產(chǎn)量。具體的操作是通過基因工程技術(shù)將負(fù)責(zé)抗生素外排的目的基因與載體在體外連接，然后轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，使抗生素外排基因在受體中高效表達(dá)遺傳。(一)質(zhì)粒的構(gòu)建(用于轉(zhuǎn)入宿主高表達(dá)目的基因)用于sav933、sav934基因超量表達(dá)的質(zhì)粒構(gòu)建KpnI酶解阿維鏈霉菌NRRL 8165基因組文庫F黏粒i^osmid 20B4,回收包含有 sav933、sav9;34基因的4. 5-1Λ KpnI-KpnI DNA片段?；厥掌伪豢寺≡趐JTU1278 (大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒)KpnI位點(diǎn)，從而得到用于在阿維鏈霉菌中超量表達(dá)sav933、sav934 基因的質(zhì)粒pFAveT。圖1為本實(shí)施例中涉及的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建圖。保存于大腸桿菌菌株DHlOB 中的該表達(dá)質(zhì)粒，即大腸埃希氏菌Escherichia coli DHlOB/pFAveT已于2011年12月15 日提交位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編100101 (中國微生物研究所)的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，其保藏登記編號(hào)為CGMCC No. 5595。(二)把sav933、sav934基因高拷貝質(zhì)粒轉(zhuǎn)入野生型宿主通過電轉(zhuǎn)把PJTU1278衍生質(zhì)粒pFAveT和空載體pJTU1278分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌 ET12567(攜帶接合轉(zhuǎn)移輔助質(zhì)粒pUZ8002)中，以便于pFAveT在輔助質(zhì)粒pUZ8002的協(xié)助下，通過接合轉(zhuǎn)移進(jìn)入受體阿維鏈霉菌NRRL 8165細(xì)胞中。將過夜培養(yǎng)的攜帶pUZ8002和待轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的大腸桿菌ET12567以1 10的接種量轉(zhuǎn)接到帶合適的抗生素(終濃度氨芐青霉素100 μ g/mL、卡那霉素50 μ g/mL、氯霉素25 μ g/mL)的新鮮LB培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，0. 5% NaCl，pH7. 0)中 37°C培養(yǎng)。2-2. 5 小時(shí)后(OD600 = 0. 4-0. 6 左右)收集菌體，用新鮮LB培養(yǎng)基洗滌菌體2次備用。作為受體的鏈霉菌孢子需經(jīng)熱激和預(yù)萌發(fā)處理。將培養(yǎng)3-5天的鏈霉菌孢子懸浮于TES緩沖液(3mL 0. 05mol/L, pH 8.0)中， 在50°C水浴中熱激lOmin，冷卻至室溫后加入等體積孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基(Difco酵母粉1 %， Difco酪蛋白氨基酸1 %，CaCl2 0. 01mol/L)，37°C搖床Q20rpm)培養(yǎng)2-2. 5小時(shí)，離心收集孢子并用新鮮LB培養(yǎng)基洗滌1次，重新均勻懸浮于適量的LB培養(yǎng)基中，按2 1與大腸桿菌細(xì)胞混合后涂在培養(yǎng)平板瓊脂糖，2%甘露醇，2%黃豆餅粉，pH 7. 2 7. 5)上， 進(jìn)行細(xì)菌雙親接合轉(zhuǎn)移。16-M小時(shí)后用含萘啶酮酸(抑制大腸桿菌的生長)和硫鏈絲菌素(轉(zhuǎn)入質(zhì)粒帶有此抗性)的ImL無菌水覆蓋平板(終濃度萘啶酮酸50 μ g/mL ；硫鏈絲菌素12. 5 μ g/mL)，置30°C培養(yǎng)4_7天后即可看到接合轉(zhuǎn)移子。(三)基因工程菌株的篩選和驗(yàn)證從覆蓋板上挑選單個(gè)接合轉(zhuǎn)移子接種到抗性(硫鏈絲菌素)平板上進(jìn)一步確認(rèn)抗性。將抗性驗(yàn)證正確的單菌落在SFM平板上擴(kuò)大培養(yǎng)。將收下的孢子接入20mL含硫鏈絲菌素(8 μ g/mL)的TSBY培養(yǎng)基(3%胰豆蛋白胨，0. 5% Difco酵母粉，10. 3%蔗糖)中30°C 搖床培養(yǎng)，從中提質(zhì)粒并反轉(zhuǎn)大腸桿菌DH10B，證實(shí)目標(biāo)質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入鏈霉菌中，從而最終確證了目標(biāo)基因工程菌株的正確性。篩選到的基因工程菌株命名為8165/pFAveT。上述8165/pFAveT，即阿維鏈霉菌 Mi^ptomyces avermitilis 8165/pFAveT 已于 2011年12月15日提交位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編100101 (中國微生物研究所)的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，其保藏登記編號(hào)為 CGMCC No. 5592。(四)基因工程菌株中目標(biāo)基因表達(dá)量的實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(1)阿維鏈霉菌RNA的提取待檢測的菌種8165/pJTU1278、8165/pFAveT在TSBY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)小時(shí)后涂于SFM平板。30°C在SFM平板上生長3天后用牙簽刮下平板表面的菌絲體。將刮出的菌絲體浸入含ImL Redzol的勻漿柱，震蕩均勻。15_30°C勻漿。12，500轉(zhuǎn)離心1分鐘 (4°C )，取上清至新的1.5mL離心管中。加入0.2mL氯仿，震蕩均勻，15-30°C放置10分鐘。 13，000轉(zhuǎn)離心15分鐘。將無色上層(RNA在無色上層)轉(zhuǎn)入新的1. 5mL離心管，加入200 μ L 乙醇。顛倒混勻后轉(zhuǎn)入SiMax membrane spin column，放置3分鐘，10，000轉(zhuǎn)離心3分鐘。棄廢液，加入600 μ L RNA washing buffer, 10, 000轉(zhuǎn)離心1分鐘，棄廢液。14，800轉(zhuǎn)離心2分鐘，將上柱放入新的1.5mL離心管，重復(fù)一次。管子在空氣中放置5-10分鐘徹底晾干。加50 μ L DEPC水在膜中間溶解RNA，30°C放置1-2分鐘，14，800轉(zhuǎn)離心1分鐘。再加30 μ L DEPC水在膜中間，重復(fù)一遍，增加RNA的得率。O) DNA 的消化取適量RNA (1-10 μ g)，加入 10 * 反應(yīng)緩沖液 5 μ 1，RNase 抑制劑 0. 5 μ 1，DNase Idu/μ 1)5μ 1，用DEPC處理過的水定容到50μ 1。37°C溫浴4小時(shí)。1 10加入25mM EDTA (保護(hù)RNA)，65°C干浴10分鐘，失活DNase I。(3)反轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)cDNA鏈PCR 反應(yīng)體系0. 1-5 μ g 模板總 RNA, 1 μ 1 弓丨物 random hexamer primer,用 DEPC 處理過的水定容至Ι μ 。對(duì)于高GC的模板，65°C溫浴5分鐘后，在冰上冷卻。再按順序加入 4 μ 15 * 反應(yīng)緩沖液，1 μ 1 RNase 抑制劑(20u/ μ 1)，2 μ 1 dNTP (IOmM)，2 μ 1 M-MuLV Reverse Transcriptase(20u/μ 1)。PCR反應(yīng)的循環(huán)條件為25 °C (5分鐘),42V (60分鐘)，70°C (5分鐘)。(4) SYBR GREEN法實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測目標(biāo)基因的表達(dá)量SYBR Green I是高靈敏的DNA熒光染料，使用以它作為熒光染料的試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR。以從阿維鏈霉菌提取的總RNA反轉(zhuǎn)的cDNA為模板，hrdB為內(nèi)參，選用 Δ ACT法，擴(kuò)增sav9333、sav934基因和阿維菌素結(jié)構(gòu)基因aveAIII，檢測其在基因工程菌株中的表達(dá)量。檢測結(jié)果表明sav933、sav934基因高拷貝菌株8165/pFAveT相比于帶空載體的對(duì)照菌株8165/pJTU1278，sav9333、sav9;34基因的表達(dá)量提高了 100 7)倍左右，而阿維菌素結(jié)構(gòu)基因aveAIII的表達(dá)量則沒有明顯變化(見圖2)。實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測目標(biāo)基因表達(dá)量的條件引物DQ18F (hrdB 正向引物)，5 ‘ -GCAGCCTCAACCAGATCCTC-3 ‘
DQ18R(hrdB 反向引物)，5 ‘ -TTGGCAGTCACCGTCTTCG-3 ‘AveA3-R3，5‘ -ATCCGCAGCAGCGGTTGT-3‘AveA3-R4，5‘ -CGTTGCCGATGTAGCCCTC-3‘SAV933-R3，5‘ -GCGGGTGGCGGTCATTCT-3‘SAV933-R4,5' -GCTTGGTCAGATCCGTGACTTCG-3‘SAV934-R3，5‘ -CTGCTGCTGGCCTTCGTGC-3‘SAV934-R4,5' -GAAGAGCGGACTGAAGTTGACG-3‘PCR 反應(yīng)體系12· 5μ 1 2 * Maxima SYBR Green qPCR Master Mix，引物各 0.311|1，5001^模板0嫩，用不含核酸酶的水定容至25111。PCR反應(yīng)的循環(huán)條件為50°C (20 秒)，95°C (10分鐘)；40個(gè)循環(huán)的95°C (15秒)，60°C (1分鐘)；最后是95°C (15秒)， 600C (1 分鐘)，95°C (30 秒)，60°C (15 秒)。(五)突變菌株的發(fā)酵培養(yǎng)平板發(fā)酵2 %瓊脂糖，2 %甘露醇，2 %黃豆餅粉(煮沸熬制后過濾去渣)，pH7. 2 7. 5，TSBY中培養(yǎng)了 36小時(shí)的菌絲體取ImL接種，30°C發(fā)酵14天。液體發(fā)酵14%玉米淀粉，2. 8%豆粕粉，1.0%酵母粉，0.5% (NH4) 2S04 (5 % ), 0. 2% CoCl2(l% ) ,0. 22% Na2MoO4(1% ) ,0. 23% MnSO4(0. 1% ) ,0. 01%淀粉酶，0· 08% (調(diào) pH后加入)CaCO3, ρΗ7· 45 7. 5，裝量30mL/瓶，種子培養(yǎng)基3. 0 %玉米淀粉，0. 8 %豆粕粉，1. 0%花生餅粉，0. 4%酵母粉，0. 3% CoCl2(1% ),0.01%淀粉酶淀粉酶，pH 6. 86 6. 9，裝量40mL/瓶中生長40 48小時(shí)的菌絲體取1. 5mL接種，28°C發(fā)酵10天。(六)抗生素的分離純化平板發(fā)酵將平板浸泡在甲醇中，過夜萃取，萃取液45°C旋轉(zhuǎn)蒸干后重溶于ImL甲醇，0. 22微米濾膜過濾后-30°C保存以備檢測。液體發(fā)酵取ImL發(fā)酵液加入盛有9mL甲醇的50mL管中，200轉(zhuǎn)振搖6小時(shí)以上， 8000轉(zhuǎn)離心5分鐘；取上清ImL左右，以0. 22微米的濾膜過濾后_30°C保存以備檢測。(七)高效液相色譜法檢測發(fā)酵產(chǎn)物高效液相色譜(HPLC)檢測結(jié)果表明基因工程菌株8165/pFAveT中阿維菌素Bla 組分的產(chǎn)量相比于對(duì)照菌株提高到1. 7-4. 3倍，而寡霉素A組分的產(chǎn)量卻沒有明顯的變化 (見圖3)。檢測是在安捷倫公司的儀器Agilent Technologies 1200 series HPLC上進(jìn)行。 高效液相色譜的工作條件為柱子(Agilent SB C18 column, 2. 1 X 150mm, 3. 5 μ m)；流速 0. lmL/min ；流動(dòng)相85%甲醇和15%去離子水；檢測波長:246nm ；柱溫25°C。實(shí)施例2制備阿維菌素的工業(yè)高產(chǎn)菌株步驟一，把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入鏈霉菌宿主以及接合轉(zhuǎn)移子的篩選和驗(yàn)證把sav933、sav934高拷貝質(zhì)粒pFAveT通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入阿維鏈霉菌工業(yè)菌株3-115細(xì)胞中，通過硫鏈絲菌素抗性驗(yàn)證、從鏈霉菌中提質(zhì)粒并反轉(zhuǎn)大腸桿菌DH10B，篩選到一株正確的基因工程菌株，將其命名為3-115/pFAveT。再把空載體pJTU1278通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入阿維鏈霉菌3-115細(xì)胞中，同樣的方法篩選并得到對(duì)照菌株3-115/pJTU1278。上述3-115/pFAveT，即阿維鏈霉菌 Mi^ptomyces avermitilis 3-115/pFAveT 已于2011年12月15日提交位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編100101 (中國微生物研究所)的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，其保藏登記編號(hào)為 CGMCC No. 5593。步驟二，菌株發(fā)酵以及抗生素的提取和檢測。采用平板發(fā)酵和液體發(fā)酵兩種發(fā)酵方式，對(duì)3-115/pJTU1278、3-115/pFAVeT這兩株菌進(jìn)行了發(fā)酵。并對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中阿維菌素Bla組分進(jìn)行了提取和檢測。從Sigma公司購買阿維菌素Bla組分的標(biāo)準(zhǔn)品，將其配制成0mg/mL、0. 25mg/mL、 0. 50mg/mL、0. 75mg/mL、1. Omg/mL這5個(gè)濃度。用HPLC檢測這5個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于計(jì)算不同峰面積對(duì)應(yīng)的阿維菌素Bla的濃度，從而定量分析基因工程菌株中阿維菌素Bla組分的產(chǎn)量(圖4)。圖5為基因工程菌株3-115/pFAveT以對(duì)照菌株3_115/pJTU1278的發(fā)酵液作為空白對(duì)照，對(duì)產(chǎn)生的阿維菌素Bla組分的產(chǎn)量進(jìn)行分析。所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，基因工程菌株與對(duì)照菌株同時(shí)進(jìn)行平行發(fā)酵檢測，結(jié)果表明，固體發(fā)酵時(shí)基因工程菌株中阿維菌素 Bla組分的產(chǎn)量提高了 90%，平均產(chǎn)量大約從96mg/l(3-115/pJTU1278)提高到約18ang/ 1 (3-115/pFAveT)；液體發(fā)酵時(shí)基因工程菌株3-115/pFAveT中阿維菌素Bla組分的產(chǎn)量提高了約 30%。平均產(chǎn)量從 3. 3g/l (3-115/pJTU1278)提高到約 4. 3g/l (3-115/pFAveT)。
權(quán)利要求
1.一種阿維菌素的優(yōu)化生產(chǎn)方法，其特征在于，通過構(gòu)建帶sav933基因和sav934基因的高拷貝質(zhì)粒pFAveT，并將所述的高拷貝質(zhì)粒轉(zhuǎn)入阿維鏈霉菌NRRL 8165或阿維鏈霉菌 3-115中，實(shí)現(xiàn)阿維菌素產(chǎn)量的提高；所述的sav933基因如kq ID No. 1所示，是指ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP結(jié)合亞基基因；所述的sav934基因如kq ID No. 2所示，是指ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白跨膜亞基基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的構(gòu)建是指將質(zhì)粒R)smid20B4用 KpnI酶切，回收包含有sav933、sav934的4. 5kb片段，回收的片段插入載體pJTU1278 KpnI 酶切位點(diǎn)中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的載體PJTU1278是含有硫鏈絲菌素抗性基因帶PiJioi復(fù)制子的鏈霉菌游離型載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的質(zhì)粒R)smid20B4，是指對(duì)阿維鏈霉菌構(gòu)建基因組文庫，阿維鏈霉菌的DNA片段被克隆到含有大腸桿菌F因子的黏粒中， Fosmid20B4包含阿維菌素生物合成基因簇及其上游的部分基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的轉(zhuǎn)入是指將構(gòu)建的質(zhì)粒PFAveT轉(zhuǎn)入大腸桿菌ET12567/pUZ8002中，與經(jīng)水浴熱激后的鏈霉菌孢子置于培養(yǎng)基平板上進(jìn)行共培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征是，所述的轉(zhuǎn)入具體步驟包括將構(gòu)建的質(zhì)粒pFAveT轉(zhuǎn)入大腸桿菌ET12567/pUZ8002中并挑轉(zhuǎn)化子在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)攜帶有轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的大腸桿菌ET12567/pUZ8002，37°C培養(yǎng)，OD600 = 0. 4-0. 6左右時(shí)收集菌體，用新鮮 LB培養(yǎng)基洗滌菌體2次備用；將阿維鏈霉菌3-115的孢子懸浮于3mL TES緩沖液中，然后在50°C水浴中熱激lOmin， 冷卻至室溫后加入等體積孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)2-2. 5小時(shí)，離心收集孢子并用新鮮LB培養(yǎng)基洗滌1次，重新懸浮于適量的LB培養(yǎng)基中，按2 * IO8 IO8與大腸桿菌細(xì)胞混合后涂在SFM培養(yǎng)基平板上吹干后放在30°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，16-24小時(shí)后用含萘啶酮酸和硫鏈絲菌素的ImL無菌水覆蓋平板，置30°C培養(yǎng)4-7天后即可看到接合轉(zhuǎn)移子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是，所述的液體LB培養(yǎng)基內(nèi)含有終濃度為 25 μ g/mL的氯霉素，50 μ g/mL的卡那霉素和100 μ g/mL的氨芐青霉素。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是，所述的TES緩沖液的濃度為0.05mol/L, pH 值為8.0。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是，所述的孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基組分為=DfTco酵母粉 (m/v)，Difco 酪蛋白氨基酸 (m/v), CaCl2 0. Olmol/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是，所述的培養(yǎng)基平板組分為2%瓊脂糖(m/ ν)，2%甘露醇(m/v)，2%黃豆餅粉(m/v)，培養(yǎng)平板pH值為7. 2 7. 5。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是，所述的無菌水覆蓋平板上萘啶酮酸的終濃度為50 μ g/mL，硫鏈絲菌素為12. 5 μ g/mL。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是，所述的阿維鏈霉菌3-115，即阿維鏈霉菌 Streptomyces avermitilis ZLX6003，其保藏號(hào)為 CGMCC No. 3229。
13.一種質(zhì)粒pFAveT，其特征在于，通過將質(zhì)粒R)smid 20B4用KpnI酶切，回收包含有 sav933、sav934的4. 5kb片段，回收的片段插入載體pJTU1278KpnI酶切位點(diǎn)中得到。
14.一種質(zhì)粒pFAveT的應(yīng)用，其特征在于，將該質(zhì)粒用于制備阿維菌素的工業(yè)菌株。
15.一種基因工程菌株，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一所述方法制備得到； 該基因工程菌株包括阿維鏈霉菌Mi^ptomyces avermitilis 8165/pFAveT和阿維鏈霉菌 Mi^ptomyces avermitilis 3-115/pFAveT，其保藏登記編號(hào)分別為 CGMCC No. 5592 和 CGMCCNo. 5593。
16.一種根據(jù)權(quán)利要求15所述基因工程菌株的應(yīng)用，其特征在于，將所述基因工程菌株生產(chǎn)用于清除家禽、家畜體內(nèi)外寄生蟲和農(nóng)作物害蟲的阿維菌素。
全文摘要
一種生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的阿維菌素的優(yōu)化生產(chǎn)方法，通過構(gòu)建包含sav933基因和sav934基因的超量表達(dá)質(zhì)粒pFAveT，并將所述的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入阿維鏈霉菌3-115中，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量的提高。本發(fā)明在抗生素工業(yè)生產(chǎn)菌株里超量表達(dá)外排基因以增加特定抗生素的產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102517321SQ201110448749
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者朱冬青, 白林泉, 鄧子新, 邱競帆 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)