專利名稱：荷包豬sla-3基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及我國(guó)特色品種荷包豬SLA-3等位基因cDNA的擴(kuò)增、序列測(cè)定和分析； SLA-3功能基因分子進(jìn)化圖譜的繪制，荷包豬SLA-3-HB基因特征可用于荷包豬品系鑒別， 該分子進(jìn)化樹(shù)可用于荷包豬的優(yōu)勢(shì)雜交育種及計(jì)算等位基因之間的遺傳距離(即氨基酸位點(diǎn)變異率)。
背景技術(shù)：
荷包豬屬于東北民豬的一個(gè)小型類群，分布于遼西交通不便的山區(qū)一帶，因外形酷似“荷包”而得名。該品種豬長(zhǎng)期自繁自育，自然進(jìn)化，已有300多年歷史；該品種豬野生性強(qiáng)，具有良好的抗病能力；另外該品種豬肌間脂高，肌纖維細(xì)密，大理石花紋明顯，而且肉質(zhì)鮮美，味感香濃，俗有“北方香豬”之稱。1987年被農(nóng)業(yè)部列為國(guó)家一級(jí)保護(hù)豬種，2002年被列入《國(guó)家畜禽遺傳資源保護(hù)名錄》，2006年被確定為《國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)品種》， 是東北地區(qū)唯一得到國(guó)家保護(hù)的豬種。由于荷包豬還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出利用市場(chǎng)，其保種目前完全依靠國(guó)家投入，成本昂貴，保種壓力非常大。為了維持荷包豬數(shù)量的穩(wěn)定，除了自繁自育外，每年要從一些山區(qū)農(nóng)戶收購(gòu)一些散落的荷包豬。目前，主要依靠外形特征進(jìn)行鑒別，而缺乏對(duì)其更加科學(xué)的的品種鑒別；另外，為了促進(jìn)荷包豬的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)，也需要加快科學(xué)的育種。本申請(qǐng)的發(fā)明人通過(guò)長(zhǎng)期對(duì)荷包豬種質(zhì)資源的調(diào)查研究，考慮到該品種獨(dú)特的性能和地位，推測(cè)其在重要功能基因的分子進(jìn)化上具有獨(dú)特性。豬的主要組織相容性復(fù)合體 (major histocompatibility complex, MHC)，又禾爾之為豬白細(xì)胞抗原(swine leukocyte antigen, SLA)，其中SLA-I是一類重要的功能基因。Piontkivska等(2003)報(bào)道，脊椎動(dòng)物的MHC分子代表物種的進(jìn)化特征，據(jù)此推測(cè)豬MHC類分子重要功能基因SLA-I類分子等位基因有可能反映荷包豬的分子進(jìn)化背景。SLA-I類分子據(jù)前述報(bào)道共有3個(gè)功能基因，分別是SLA-1，SLA-2和SLA-3。其中，SLA-3基因相對(duì)于SLA-I和SLA-2比較保守，但也呈現(xiàn)一定的多態(tài)性，即特殊的品系，其SLA-3基因具有獨(dú)特的分子特征，而且該特征從一定程度上可以反應(yīng)該品系豬品系差異?；诖耍旧暾?qǐng)的發(fā)明人擬從荷包豬SLA-I另外一功能基因SLA-3入手，針對(duì)性地研發(fā)準(zhǔn)確可靠的品種鑒別方法，分析其基因的分子進(jìn)化特征，為荷包豬品系優(yōu)化和培育新品種提供指導(dǎo)性的數(shù)據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供荷包豬SLA-3基因序列，發(fā)明人通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增荷包豬SLA-3基因cDNA，再克隆至pMD_18T載體，然后測(cè)序。結(jié)果顯示， 從多個(gè)個(gè)體中克隆并歸類為2類荷包豬SLA-3等位基因，即SLA-3-HB 01 02，其堿基序列如 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示。本申請(qǐng)的發(fā)明人利用RT-PCR擴(kuò)增得到上述荷包豬SLA-3等位基因，擴(kuò)增所用的引物序列是
上游引物pM-3Fl :5，-GGCTGAGGATCATGGGGCCCCG-3，(SEQ ID NO 3)；下游引物pM-3R2 :5，-GAACCCTGCCTTTGGAACTGTG-3，(SEQ ID NO 4)；擴(kuò)增PCR程序?yàn)?4"C 5min ；940C 45s，64°C 30s，72°C lmin，3 循環(huán)；94°C 45s, 62°C 30s，72°C lmin，3 循環(huán)；94°C 45s, 60°C 30s，72°C lmin，28 循環(huán)；72°C IOmin。本發(fā)明的另一目的是提供用于荷包豬品種鑒別及指導(dǎo)遺傳育種的方法。基于上述克隆得到的荷包豬SLA-3基因的2個(gè)等位基因序列，發(fā)明人調(diào)集DDBJ/EMBL/GenBank上除荷包豬外其他 43 個(gè) SLA-3 等位基因，利用 Gentyx 9. 0 (Software Development co.，Ltd) 推導(dǎo)基因的氨基酸序列、DNAMAN Version5. 2. 2 (Lynnon Biosoft)對(duì)SLA-3各等位基因進(jìn)行序列對(duì)比，最后通過(guò)Mega5(Mega software Co. , Ltd)的neighbor-joining法繪制各基因的分子進(jìn)化圖譜。發(fā)明人通過(guò)分析荷包豬SLA-3-HB的基因分子特征，發(fā)現(xiàn)荷包豬SLA_3_HB 01 02 基因?qū)?yīng)的特征性氨基酸位點(diǎn)在其編碼區(qū)的7位(V)、56位(W)、74位(Q)、137位(F)、237 位(S)、320 位(M)、357 位(Q)。此外，荷包豬SLA-3-HB 02除了具有上述的特征性氨基酸位點(diǎn)之外，還包括位于其基因編碼區(qū)所編碼的氨基酸序列的334-344之間缺失。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述荷包豬SLA-3基因在荷包豬優(yōu)化遺傳育種上的應(yīng)用。根據(jù)上述特征性氨基酸位點(diǎn)，可以進(jìn)行荷包豬品種的鑒別。根據(jù)荷包豬SLA-3等位基因的分子進(jìn)化樹(shù)，可以分析得出與其親緣關(guān)系近或遠(yuǎn)的品系，從而可以選擇進(jìn)行優(yōu)勢(shì)雜交育種。根據(jù)上文所述，本發(fā)明的荷包豬SLA-3基因序列及以此為基礎(chǔ)所得到的基因分子特征及分子進(jìn)化圖譜可用于荷包豬基因庫(kù)的構(gòu)建、荷包豬的品種鑒別及指導(dǎo)荷包豬的遺傳育種。


本發(fā)明附圖3幅，圖1是荷包豬SLA-3-HB 01基因及氨基酸序列分析結(jié)果；圖2是荷包豬SLA-3-HB 02基因及氨基酸序列分析結(jié)果；圖3是荷包豬SLA-3-HB分子進(jìn)化關(guān)系圖譜；其中，圖1 3中加下劃線的氨基酸為荷包豬SLA-3-HB基因的特異性氨基酸位
點(diǎn)ο
具體實(shí)施例方式以下以具體實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說(shuō)明，該部分內(nèi)容不以任何形式限制本發(fā)明的內(nèi)容。
本部分內(nèi)容所使用的荷包豬樣品采自遼寧省荷包豬原種場(chǎng)，所使用的儀器包括高速冷凍離心機(jī)(J-250，BECKMAN)、PCR儀(iCycler，BI0RAD)、核酸電泳儀(DYY-7C，北京市六一儀器公司)、凝膠成像系統(tǒng)(UVP⑶S-8000，美國(guó)UVP公司)、紫外分析儀(WD-9403C，北京市六一儀器公司)、空氣浴振蕩器(HZQ-C，哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠)等。實(shí)施例1 克隆荷包豬SLA-3等位基因1、引物設(shè)計(jì)利用RT-PCR擴(kuò)增上述荷包豬SLA-3等位基因，擴(kuò)增所用的引物序列是上游引物pM-3Fl :5，-GGCTGAGGATCATGGGGCCCCG-3，(SEQ ID NO 3)；下游引物pM-3R2 :5，-GAACCCTGCCTTTGGAACTGTG-3，(SEQ ID NO 4)；2、提取荷包豬總RNA采集荷包豬脾臟，采用TRIZOL試劑盒(BS409，Canada Bio Basic he.)提取核酸總RNA，方法按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。3、RT-PCR以O(shè)ligo dT做為反轉(zhuǎn)錄引物，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(M-MLV，RNase H_，寶生物工程 (大連)有限公司)說(shuō)明將核酸反轉(zhuǎn)錄為cDNA;然后以PCR擴(kuò)增引物pM-3Fl/pM-3R2擴(kuò)增 SLA-3。擴(kuò)增RT-PCR程序?yàn)?4"C 5min ；940C 45s,64°C 30s, 72°C lmin, 3 循環(huán)；94°C 45s, 62°C 30s, 72°C lmin, 3 循環(huán)；94°C 45s, 60°C 30s，72°C lmin，28 循環(huán)；72°C IOmin。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒(TaKaRa DNA Fragment Purif ication，寶生物工程 (大連)有限公司)回收。4、基因克隆及重組子篩選將純化后的SLA-3與pMD-18-T (寶生物工程(大連)有限公司)載體連接，并轉(zhuǎn)化宿主菌JM109 (寶生物工程(大連)有限公司)。重組菌含Amp抗性，重組菌經(jīng)培養(yǎng)堿裂解法提質(zhì)粒，EcoR 1(寶生物工程(大連)有限公司)和Hind 111(寶生物工程(大連)有限公司)雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)酶切電泳結(jié)果篩選陽(yáng)性重組菌，保存至-80°C備用。5、測(cè)序重組菌陽(yáng)性克隆送至上海生工測(cè)序。實(shí)施例2 序列分析及品種的鑒別實(shí)施例 1 所得基因序列經(jīng)過(guò)Gentyx9. 0 (Software Development co. ,Ltd)進(jìn)行基因分析，并推導(dǎo)其氨基酸序列；調(diào)集DDBJ/EMBL/GenBank上除荷包豬外其他43個(gè)SLA-3等位基因氨基酸序列，氨基酸序列對(duì)比采用DNAMAN Version5. 2. 2 (Lynnon Biosoft)。分析結(jié)果如圖1 2，在荷包豬SLA-3-HB等位基因的編碼區(qū)的7位(V)、56位(W)、 74位(Q)、137位(F)、237位(S)、320位(M)、357位(Q)均為特征性氨基酸。另外，SLA-3-HB 02在334-344之間缺失。具體信息如下表
位置氨基酸氨基酸英文名稱氨基酸縮寫序列名稱7纈氨酸ValineV 或 Val56色氨酸TryptophanW 或 Trp74谷氨酰胺GlutamineQ 或 Gln137苯丙氨酸PhenylalanineF 或 I^heSLA-3-HB 01SLA-3-HB 02237絲氨酸SerineS或&『320甲硫氨酸MethionineM 或 Met357谷氨酰胺GlutamineQ 或 Gln334-344缺失根據(jù)這些位點(diǎn)特征的氨基酸信息，可以進(jìn)行荷包豬品種的鑒別。參考荷包豬SLA-3-HB等位基因的分子特征，遼寧省荷包豬原種場(chǎng)保種中心人員已從建昌、青龍、奈曼、庫(kù)倫等產(chǎn)區(qū)縣40多頭當(dāng)?shù)仄废地i中篩選到了 14頭帶有荷包豬 SLA-3-HB基因特征(同時(shí)帶有SLA-2-HB基因特征)的民間荷包豬以補(bǔ)充荷包豬群體，而且篩選到的豬外形特征及性能均符合典型荷包豬特征，經(jīng)過(guò)3代繁育，荷包豬的典型特征仍存在。與之前僅通過(guò)豬外觀特征判斷是否為荷包豬的方法比較，本方法更具有科學(xué)性。目前研究人員在基因水平上可以很方便的區(qū)分民間荷包豬與其它品系豬，有利于荷包豬種質(zhì)資源的保護(hù)。實(shí)施例3 分子進(jìn)化圖譜的繪制及其在優(yōu)化遺傳育種中的應(yīng)用分子進(jìn)化圖譜采用DNAMAN 禾口 Mega5 軟件(Mega software Co.，Ltd)的 neighbor-joining法繪制。分子進(jìn)化圖譜如附圖3。通過(guò)分子進(jìn)化圖譜，所有SLA-3等位基因聚類為3大類，即A I類、A II類和A III類，荷包豬SLA-3等位基因?qū)儆贏 III類。 由此可以很清楚地判斷出荷包豬品系與美國(guó)Hanford AY135601、美國(guó)Sinclair AF464042、 美國(guó)Hanford AF464041及細(xì)胞系ESK-4EU432094的遺傳關(guān)系接近；而與韓國(guó)的DQ992514、 DQ992512及DQ992517等遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。根據(jù)遺傳育種的原則，在優(yōu)勢(shì)性狀同等條件下，盡量選擇遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)的品系，才能體現(xiàn)雜交優(yōu)勢(shì)；而為了保種選育，又應(yīng)該盡量選擇遺傳關(guān)系較近的品系?；谝陨闲畔⒓坝N原則，遼寧省荷包豬原種場(chǎng)制定合理的選配計(jì)劃，避免親緣選配(三代之內(nèi)避開(kāi)血緣關(guān)系)、采取同質(zhì)選配。優(yōu)秀公豬加大配種強(qiáng)度，優(yōu)良組合可重復(fù)選配。選留種的重點(diǎn)放在體型外貌、生產(chǎn)性能、遺傳缺陷等性狀的選擇上。經(jīng)過(guò)三個(gè)世代的選育，各項(xiàng)指標(biāo)具體為成年公豬體重91kg、成年母豬體重76kg，公豬體高64cm，母豬體高 57cm，公豬體長(zhǎng)11 lcm，母豬體長(zhǎng)l(Mcm，公豬性成熟年齡135d，母豬90d。初產(chǎn)母豬產(chǎn)仔數(shù) 9頭，經(jīng)產(chǎn)母豬產(chǎn)仔數(shù)10頭；肥育期日增重410克，料肉比3.9 1 ；屠宰率74%，瘦肉率 48%，肌內(nèi)脂肪含量5. 1% ；與零世代相比初產(chǎn)母豬產(chǎn)仔數(shù)提高0. 4頭，經(jīng)產(chǎn)母豬提高0. 5 頭；肥育期日增重提高52克；料重比降低0.4個(gè)比例點(diǎn)；瘦肉率提高0.9個(gè)百分點(diǎn)；種豬體尺、體重、體型外貌達(dá)到育種指標(biāo)。
權(quán)利要求
1.荷包豬SLA-3基因，包括2個(gè)SLA-3等位基因，其堿基序列如SEQID NO =USEQ ID NO 2所示。
2.權(quán)利要求1所述的荷包豬SLA-3基因，其特征在于利用RT-PCR擴(kuò)增荷包豬SLA-3基因，擴(kuò)增所用的上、下游引物序列分別如SEQ ID NO 3和SEQ ID NO :4所示；擴(kuò)增PCR程序?yàn)?40C 5min ；940C 45s，64°C 30s, 72°C lmin，3 循環(huán)；94°C 45s, 62°C 30s, 72°C lmin，3 循環(huán)；94°C 45s, 60°C 30s, 72°C lmin，28 循環(huán)；72°C IOmin。
3.權(quán)利要求1所述的荷包豬SLA-3基因在荷包豬品種鑒別上的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求3所述的荷包豬SLA-3基因在荷包豬品種鑒別上的應(yīng)用，是根據(jù)荷包豬 SLA-3基因編碼區(qū)所編碼的氨基酸序列的特征性氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行鑒別，其特征在于所述的特征性氨基酸位點(diǎn)包括，位于荷包豬SLA-3基因編碼區(qū)所編碼的氨基酸序列的7位(V)、56 位(W) >74 位(Q)、137 位(F)、237 位(S)、320 位(M)、357 位(Q)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的特征性氨基酸位點(diǎn)還包括，位于荷包豬SLA-3基因編碼區(qū)所編碼的氨基酸序列的334-344之間缺失。
6.權(quán)利要求1所述的荷包豬SLA-3基因在荷包豬優(yōu)化遺傳育種上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)荷包豬SLA-3基因及其應(yīng)用，包括對(duì)我國(guó)特色品種荷包豬包括2個(gè)SLA-3等位基因cDNA的擴(kuò)增、序列測(cè)定和分析。所述的2個(gè)SLA-3等位基因堿基序列如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2所示。這些基因序列及以此為基礎(chǔ)所得到的基因分子特征及分子進(jìn)化圖譜可用于荷包豬基因庫(kù)的構(gòu)建、荷包豬的品種鑒別及指導(dǎo)荷包豬的遺傳育種。
文檔編號(hào)C12N15/12GK102559690SQ20111044852
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者喬翠, 馮磊, 趙德, 高鳳山 申請(qǐng)人:大連大學(xué)