專利名稱：異源表達內(nèi)切葡聚糖酶基因的木霉工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明屬于微生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種異源表達內(nèi)切葡聚糖酶基因的工程菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
纖維素是由β -1，4-糖苷鍵連接而成D-吡喃式葡萄糖聚合物，是地球上最豐富且可再生的資源。據(jù)估計，地球上每年光合作用產(chǎn)生1.5 X IO11億噸纖維素(Ryu，D.D等，1980，Enzyme and Microbial Technology)。多數(shù)情況下,要高值化利用纖維素首先必須通過纖維素酶對其進行有效降解。自然界中產(chǎn)纖維素酶的生物很多，主要是微生物，如絲狀真菌、細菌和放線菌等。因此，對產(chǎn)纖維素酶微生物的篩選或遺傳改造研究及應(yīng)用就受到了普遍的關(guān)注。自然界中各種微生物所產(chǎn)的纖維素酶組分和比例不盡相同，例如絲狀真菌纖維素酶系(Cellulase system) 一般包括3種水解酶，即內(nèi)切型β _1，4_葡聚糖(Endoglucanase, EC3.2.1.4)、外切型 β -1,4-葡聚糖酶(Exo-glucanase, EC3.2.1.91)和β _ 葡萄糖苷酶(β -Glucosidase, EC3.2.1.21) (Fogarty M, Kelly C Τ, 1990, MicrobialEnzymes and Biotechnology), 3種纖維素酶組分協(xié)同作用才能將纖維素水解成葡萄糖。其中木霉(Trichoderma sp.)作為工業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶的菌株，其纖維素酶系中有2個外切酶組分(Cbh I和Cbh II)和5個內(nèi)切酶組分(Eg 1、Eg II,Eg III,Eg IV和Eg V)。由于木霉具有高效分泌表達和高密度發(fā)酵等優(yōu)點，常被用來構(gòu)建工程菌生產(chǎn)其它工業(yè)酶。而利用基因工程手段高效表達外源基因，也是改變木霉宿主酶系組成的重要方法之一，如通過高效表達異源β_葡萄糖苷酶基因，可以有效彌補木霉纖維素酶系中β_葡萄糖苷酶的不足，提高菌株的濾紙酶活(Jiwei Zhang等,2010, Bioresource Technology)。目前,纖維素酶系中的各組分均可在木霉中得到有效表達需要提及的是，木霉纖維素酶系的最適pH值為4.5-5.5，在近中性和堿性條件下(pH6.5-8.0)幾乎沒有效果。因此，在織布除毛、牛仔布磨損和洗舊的現(xiàn)有工藝中，必須先調(diào)pH至酸性，再加纖維素酶。為了進一步簡化工序,節(jié)約生產(chǎn)成本和勞動量,急需通過遺傳工程方法獲得在中性和堿性條件下適用的纖維素酶系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種異源表達內(nèi)切葡聚糖酶基因的木霉工程菌及其應(yīng)用，即利用基因工程手段，將特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的內(nèi)切葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)化入木霉中，構(gòu)建木霉工程菌株。該工程菌能高效表達內(nèi)切葡聚糖酶基因，從而增加了其纖維素酶系的內(nèi)切酶組分，提高了酶活性；而意想不到的是，與未轉(zhuǎn)化的木霉相比，本發(fā)明構(gòu)建的木霉工程菌的纖維素酶系的PH適用范圍得到了顯著擴大，可以在中性或偏堿性條件下直接應(yīng)用。申請人:在經(jīng)過長期的篩選后發(fā)現(xiàn) ，將來自于特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的內(nèi)切葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)化入木霉中，木霉纖維素酶系的pH適用范圍得到了顯著擴大，從而促成了本發(fā)明。本發(fā)明的一個方面涉及一種木霉工程菌，該工程菌攜帶有能表達特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的內(nèi)切葡聚糖酶的表達載體。
所述的木霉為里氏木霉(Trichoderma reesei)、康氏木霉(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、綠色木霉(Trichoderma viride)、鉤狀木霉(Trichoderma hamatum)中的任一種。其中里氏木霉YFZX-1 (hph+, egV) (Trichoderma reesei YFZX-1 (hph+, egV))工程菌，已于2011年12月13日，保藏于地址為武漢大學生命科學學院武漢市武昌珞珈山的“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號為CCTCC NO:M 2011469?？凳夏久筜FZX-2 (egv) (Trichoderma koningii YFZX-2 (egv))工程菌，已于 2011年12月13日，保藏于“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號為CCTCC NO:M 2011470。綠色木霉YFZX-3 (hph+, egV) (Trichoderma viride YFZX-3 (hph+, egV))工程菌，已于2011年12月13日，保藏于“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號為CCTCC NO:M 2011471。上述的特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的內(nèi)切葡聚糖酶,其特征在于:I)其氨基酸序列為SEQ ID NO:1的內(nèi)切葡聚糖酶；2)在I)中限定的氨基酸中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有特異腐質(zhì)霉的內(nèi)切葡聚糖酶功能的，由I)衍生的蛋白質(zhì)。上述的特異腐質(zhì)霉的內(nèi)切葡聚糖酶的編碼基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO:2。所述的表達載體，其啟動子序列為木霉cbhl啟動子，終止子序列為木霉cbhl終止子，篩選標記為潮霉素，其一種圖譜如圖1所示。本發(fā)明另一方面涉及上述木霉工程菌的應(yīng)用，用于生產(chǎn)纖維素酶系，所述纖維素酶系可在中性或堿性條件下適用。上述生產(chǎn)的纖維素酶在紡織工業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用，尤其在針織面料、梭織面料的表面除毛，針織面料、梭織面料的除毛染色一浴工藝，針織面料、梭織面料的除毛除氧一浴工藝以及牛仔面料的起花及除毛等領(lǐng)域的使用方法。本發(fā)明的木霉工程菌能高效表達特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的內(nèi)切葡聚糖酶基因，從而增加了其纖維素酶系的內(nèi)切酶組分，改變了酶學PH特性，明顯擴大了其纖維素酶系在中性和堿性條件下的適用范圍；本發(fā)明生產(chǎn)的纖維素酶產(chǎn)品在PH 4.0-8.0范圍內(nèi)，無需調(diào)酸可直接應(yīng)用于水洗做舊、織布拋光等紡織工業(yè)領(lǐng)域，且效果良好，從而簡化了應(yīng)用工藝，節(jié)約成本。


圖1:構(gòu)建的重組表達載體不意圖；圖2:PCR擴增鑒定轉(zhuǎn)化子的電泳圖；其中:A為PCR擴增潮霉素基因部分序列；B為PCR擴增目的基因；圖3 =SDS-PAGE鑒定木霉工程菌所表達的目的蛋白:箭頭所示為內(nèi)切葡聚糖酶。圖4:木霉工程菌YFZX-1所產(chǎn)纖維素酶的pH特性分析。
具體實施例方式下面結(jié)合實例對本發(fā)明的方法做進一步說明。但實例僅限于說明，并不限于此。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常可按常規(guī)條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員可以借助實施例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護和權(quán)利要求范圍不限于所提供的案例。實施例1特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆1.1提取特異腐質(zhì)霉總基因組DNA將特異腐質(zhì)霉(Humicola sp.)過夜培養(yǎng),取適量菌體置于離心管中，13000rpm離心 5min，棄上清；加入 400 μ I 抽提緩沖液(IOOmM Tris-HCl, IOOmM EDTA, 250mM NaCl, I %SDS);然后加IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打儀劇烈振蕩2min左右；65°C水浴20min后，力口Λ 200 μ I IOM NH4AC,冰浴IOmin ；13000rpm離心lOmin，取上清；加入2倍體積的無水乙醇，-20°C放置30min ;13000rpm離心lOmin，棄上清；用70%乙醇洗滌2次；晾干，加入水溶解,于-20°C保存。1.2基因克隆以1.1中提取的基因組總DNA為模板，分別利用引物eg-F (SEQ ID NO:3)和eg-R(SEQ ID NO:4)進行 PCR 擴增。PCR 擴增條件為 95 °C 4min ；94 °C 30S ；55 °C 40S,720C Imin 30個循環(huán)；72°C，7min ;凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產(chǎn)物。1.3測序分析將1.2中回收的擴增產(chǎn)物分別連接到pMD18-T載體，獲得克隆載體pMD-EG，送至北京華大基因研究中心進行測序 分析，獲得的核苷酸序列為SEQID NO:2，用blast分析表明擴增片段為特異腐質(zhì)霉的內(nèi)切葡聚糖酶基因，其翻譯出的內(nèi)切葡聚糖酶蛋白序列為SEQ IDNO:1。本發(fā)明還包括對SEQ ID NO:1中限定的氨基酸中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有特異腐質(zhì)霉的內(nèi)切葡聚糖酶功能的，由I)衍生的蛋白質(zhì)。所述的衍生蛋白可以用人工合成的方法來構(gòu)建，也可以是通過點突變方法對SEQ ID NO:2的核苷酸進行改造后重組表達的蛋白，并通過測定纖維素酶酶活的方法來驗證是否具有特異腐質(zhì)霉的內(nèi)切葡聚糖酶的功能:以10mg/ml的羧甲基纖維素鈉(CMC)為底物，以ρΗ6.0的檸檬酸緩沖液將待測酶液稀釋至適當倍數(shù)，取0.5mL酶液加入到已預(yù)熱的0.5mL底物溶液中，在50°C水浴中精確反應(yīng)15min，加入1.5mL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴中加熱5min，迅速冷卻后加入2.5mL蒸餾水，混勻后測定415nm波長下的吸光度，并計算酶活力。酶活定義為，在50°C、pH6.0條件下，每分鐘從濃度為5mg/ml的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放Iumol還原糖所需要的酶量為一個活力單位(IU)，還原糖以葡萄糖等量。例如，為提高SEQ ID NO:1編碼內(nèi)切葡聚糖酶的pH穩(wěn)定性和耐堿性，確定第59位異亮氨酸(Ile59)、第91位亮氨酸(Leu91)和第243位天冬氨酸(Asn243)為目標氨基酸后，通過重疊引物PCR法對目標位點進行體外定點誘變，以亮氨酸(Leu59)替代Ile59，以苯丙氨酸(Phe91)替代Leu91和以甘氨酸(Gly243)替代Asp243 ;構(gòu)建含突變體的木霉工程菌，表達內(nèi)切葡聚糖酶衍生物，其氨基酸序列為SEQ ID NO:5，其編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:6 ;然后通過測定纖維素酶酶活的方法驗證了其具有特異腐質(zhì)霉的內(nèi)切葡聚糖酶的功能。通過上述的方法即獲得了內(nèi)切葡聚糖酶的衍生蛋白。實施例2表達載體的構(gòu)建設(shè)計引物Ter-s (SEQ ID NO:7)和Ter_a(SEQ ID NO:8)，以里氏木霉基因組為模板進行 PCR 擴增 cbhl 終止子序列。PCR 條件為:95°C 4min ；94°C 40s, 56°C 40s, 72°C 1.5min,共30個循環(huán)；72°C 7min。凝膠回收PCR產(chǎn)物，并以Sac RI和EcoR I雙酶切。同樣，以SacRI和EcoR I雙酶切pUC18，然后把兩個酶切產(chǎn)物連接過夜后導(dǎo)入大腸桿菌DH5a，獲得重組表達質(zhì)粒pUC-ter。設(shè)計引物用引物Pro-s (SEQ ID NO:9)和Pro_a(SEQ ID NO:10)，以里氏木霉基因組為模板進行PCR擴增cbhl啟動子序列。PCR條件為:95°C 4min ；94°C 40s, 56°C 40s，72°C2min，共30個循環(huán)；72°C7min。凝膠回收PCR產(chǎn)物，并以BamH I和KpnI雙酶切。同樣，以BamH I和KpnI雙酶切pUC_ter，然后把兩個酶切產(chǎn)物連接過夜后導(dǎo)入大腸桿菌DH5 α，獲得重組表達質(zhì)粒pUC-pro-ter。設(shè)計引物MH-S(SEQ ID NO:11)和 MH_A(SEQ ID NO: 12)，以質(zhì)粒 pTG(含潮霉素hph 基因)為模板進行 PCR 擴增。PCR 條件為:95°C 4min ；94V 40s, 56°C 40s, 72°C 1.5min,共30個循環(huán)；72°C 7min。凝膠回收PCR產(chǎn)物，并以Bam HI和Sph I雙酶切；同樣，Bam HI和Sph I雙酶切pUC- piO-ter，然后把兩個酶切產(chǎn)物連接過夜后導(dǎo)入大腸桿菌DH5 α，獲得重組表達質(zhì)粒PKDN-5 (圖1A)。設(shè)計引物兩對引物Hin-1F (SEQ ID NO:13)和 Hin-1R (SEQ ID NO:14)；Hin-2F (SEQ ID NO:15)和 Hin_2R(SEQ ID NO:16)，以 pMD_EG(實施例1)為模板分別進行擴增。PCR 條件為:95°C 4min ；94V 40s, 56°C 40s, 72°C 40s，共 30 個循環(huán)；72°C 7min。凝膠回收PCR產(chǎn)物；各取2μ I回收產(chǎn)物混合于16μ I的ddH20中，然后在PCR儀上先進行95°C5min變性，接著關(guān)閉PCR儀進行自然降溫至室溫而復(fù)性；取2 μ I復(fù)性產(chǎn)物與NcoI和KpnI雙酶切pKDN-5載體連接過夜導(dǎo)入大腸桿菌DH5 α，獲得重組表達質(zhì)粒pKDN_EG(圖1B)。實施例3轉(zhuǎn)化與篩選(I)原生質(zhì)體制備接種里氏木霉菌絲于PDA平板上生長4天；切取直徑約3cm的菌落置于約60mlYEG(0.5 %酵母粉、I %葡萄糖)的液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；多層紗布過濾收集菌絲；將菌絲置于盛有10-20ml裂解酶液(Sigma L1412)酶解2_3小時；取出酶解液，加入0.7M NaCl溶液，輕輕搖晃，倒于三層滅菌擦鏡紙過濾，收集濾液，3000rpm，離心 IOmin ;棄上清，加 10-20ml STC 液(20 % 蔗糖，50mM Tris-Cl, 50mM CaCl2)懸浮，然后3000rpm,離心IOmin ;加適量STC懸浮分裝(150 μ I/管，IO8個/ml)。(2)轉(zhuǎn)化與驗證取2μ g pKDN-EG DNA加入到150μ I原生質(zhì)體中，接著加入500μ I 25%PEG輕輕混勻，室溫靜置25min ;然后分2_3次再加Iml 25% PEG,輕輕混勻，室溫靜置25min，把原生質(zhì)體加到50ml左右熔化后冷卻至45-55°C的上層半固體培養(yǎng)基(0.1 % MgSO4,1 % KH2P04，0.6% (NH4)2SO4,1 %葡萄糖，18.3%山梨醇，0.35%瓊脂糖)，輕輕混勻后倒入含IOOyg/ml潮霉素下層基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板(2%葡萄糖，0.5% (NH4)2S04，1.5% KH2PO4,0.06% MgSO4,0.06% CaCl2,1.5%瓊脂)，28°C黑暗培養(yǎng)數(shù)天至轉(zhuǎn)化子長出。按照實施例1中的方法提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，利用引物Hcds531_s(SEQID NO:17)和Hcds531-a(SEQ ID NO:18)擴增潮霉素基因驗證轉(zhuǎn)化子(圖2A)。利用實施例I中引物eg-F和eg-R進行PCR擴增目的基因。PCR擴增條件為95°C 4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C Imin 30個循環(huán)；72°C 7min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產(chǎn)物并進行測序分析(圖2B)，即經(jīng)過上述兩個PCR反應(yīng)選育和驗證陽性轉(zhuǎn)化子。實施例4發(fā)酵驗證和酶學性質(zhì)測定將陽性轉(zhuǎn)化子和出發(fā)菌株(陰性對照)接種于麗發(fā)酵培養(yǎng)基(1.5%葡萄糖，
1.7%乳糖，2.5%玉米漿，0.44% (NH4)2SO4,0.09% MgSO4, 2% KH2PO4,0.04% CaCl2,0.018%吐溫-80，0.018%微量元素，0.018%聚丙二醇-2000)，28°C培養(yǎng)48小時，然后25°C培養(yǎng)48小時；取上清樣進行SDS-PAGE檢測(圖3)。將I株陽性轉(zhuǎn)化子命名為Trichoderma reeseiYFZX-U 保藏號:CCTCC NO:M 2011469)。工程菌 Trichoderma reesei YFZX-1 纖維素酶的pH特性分析顯示:與出發(fā)菌株相比，工程菌酶液的pH適用范圍更寬泛，在pH4.0-8.0條件下，都具有較高的酶活水平。(圖4)同樣的，采用實施例1-4中所述步驟，分別轉(zhuǎn)化康氏木霉(Trichoderma.koningii)和綠色木霉(Trichoderma.viride),獲得表達特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶基因的康氏木霉陽性轉(zhuǎn)化子，命名為Trichoderma.Koningii YFZX-2 (保藏號:CCTCC NO:M 2011470)和綠色木霉陽性轉(zhuǎn)化子 Trichoderma.viride YFZX-3 (保藏號:CCTCC NO:M2011471)。與出發(fā)菌株相比，康氏木霉工程菌和綠色木霉工程菌酶液的pH適用范圍也更寬泛了。同時，還將表達載體轉(zhuǎn)入了長枝木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、鉤狀木霉(Trichoderma hamatum),獲得的工程菌的酶液 pH 適用范圍也更寬泛了。上述結(jié)果表明木霉類的微生物對來源于特異腐質(zhì)霉的內(nèi)切葡聚糖酶具有一種未知的修飾作用。對衍生酶(例如SEQ ID NO:5)的實驗也具有類似的結(jié)果。實施例5纖維素酶產(chǎn)品的制備將上述木霉工程菌接種于搖瓶種子培養(yǎng)基(葡萄糖10_30g/L，土豆100-200g/L)，30°C，200rpm搖床培養(yǎng)48h之后，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)入I噸種子罐(培養(yǎng)基為:葡萄糖20_50g/L，硫酸銨10-30g/L，硫酸鎂5-10g/L，磷酸二氫鉀15_30g/L)，溫度控制在25 土 1°C，pH值
5.0±0.2，在種子罐培養(yǎng)48h之后，將種子液轉(zhuǎn)入30噸發(fā)酵罐(培養(yǎng)基為:葡萄糖30-50g/L,乳糖2.0-10g/L,玉米漿20-50g/L,硫酸銨10_30g/L，硫酸鎂5-lOg/L，磷酸二氫鉀15-30g/L)，溫度控制在25 ± I °C，pH值控制在5.0±0.2，在發(fā)酵罐培養(yǎng)IOh到15h之后，開始補加乳糖誘導(dǎo)菌體產(chǎn)酶，發(fā)酵時間約為200h到230h制成發(fā)酵菌液。發(fā)酵菌液可以直接用來對纖維素進行降解，也可以用來制備纖維素酶。 制備纖維素酶可以按照如下步驟進行:將發(fā)酵液放入40噸儲罐，按照發(fā)酵液體積加入0.5-1.0 %的硅藻土和0.1-0.5%的珍珠巖。攪拌混勻之后，靜止8h后采用板框過濾。采用以下步驟分別制備液體酶制劑或固體酶制劑:(I)通過過濾獲得澄清的濾液進行超濾，溫度控制在15°C ;最后在超濾濃縮液加入添加保護劑(16%山梨醇，3%氯化鈉)，防腐劑(山梨酸鉀0.12%，苯甲酸鈉0.17% )獲得液體酶制劑成品，CMC酶活為5000-15000IU/ml ； (2)將超濾濃縮后的濾液和載體(淀粉)混合均勻，采用噴霧干燥的方法將其噴干即得到固體酶制劑產(chǎn)品，CMC酶活10000-20000IU/ml。實施例6纖維素酶的應(yīng)用(A)針織面料、梭織面料的表面除毛，其應(yīng)用條件為35_55°C，處理時間為20_90分鐘，pH范圍為4.0-9.5，特別適用于6.5-7.0 ;適用的浴比范圍為1: 5_1: 30，使用的設(shè)備類型為溢流染色機，卷染機，水洗機等，纖維素酶的用量為0.1-3.0g/L，該酶具有除毛干凈，對織物強力損失小的特點，其滅活條件為添加純堿至PH值到10，或升溫到70°C以上并保持10分鐘。(B)針織面料、梭織面料的除毛染色一浴工藝及除毛、除氧、染色一浴工藝，其應(yīng)用條件為35-55°C，處理時間為30-150分鐘，pH范圍為4.0-9.5，特別適用于染色同浴的情況；適用的浴比范圍為1: 5-1: 30，使用的設(shè)備類型為溢流染色機，卷染機，水洗機等，纖維素酶的用量為0.1-3.0g/L，且纖維素酶的耐鹽范圍為硫酸鈉10-100g/L，該酶具有除毛干凈，對織物強力損失小的特點，其滅活條件為添加純堿至PH值到10，或升溫到70°C以上并保持10分鐘。(C)牛仔面料的起花及除毛應(yīng)用，其應(yīng)用條件為35_55°C，處理時間為10_60分鐘，pH范圍為4.0-9.5，可應(yīng)用 于退漿及單獨石磨洗條件下的除毛、起花工藝；適用的浴比范圍為1: 5-1: 30，使用的設(shè)備類型為工業(yè)水洗機等，纖維素酶的用量為0.1-3.0g/L，該酶具有除毛干凈，起花均勻，花點較小，對織物強力損失小的特點，其滅活條件為添加純堿至PH值到10，或升溫到70°C以上并保持10分鐘。(D)針織面料、梭織面料的除毛除氧一浴工藝，其應(yīng)用條件為35_55°C，處理時間為30-150分鐘，pH范圍為4.0-9.5，特別適用于與除氧酶等其它生物酶等復(fù)合應(yīng)用的情況；適用的浴比范圍為1: 5-1: 30，使用的設(shè)備類型為溢流染色機，卷染機，水洗機等，纖維素酶的用量為0.1-3.0g/L，該酶具有除毛干凈，對織物強力損失小的特點，其滅活條件為添加純堿至PH值到10，或升溫到70°C以上并保持10分鐘。結(jié)果顯示本發(fā)明生產(chǎn)的纖維素酶在pH 4.0-8.0范圍內(nèi)應(yīng)用，無需調(diào)酸可直接使用，效果良好。布料強力損失特別小，回沾及串色最??；牛仔水洗，起花小，風格獨特，批差穩(wěn)定；在除氧、拋光、染色一浴產(chǎn)品方面，耐鹽性好，直接使用可用于中和除氧后的拋光、染色一浴工藝，節(jié)能省時。
權(quán)利要求
1.一種木霉工程菌,為攜帶有能表達特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)內(nèi)切葡聚糖酶的表達載體的木霉。
2.如權(quán)利要求1所述的木霉工程菌，其特征在于所述的木霉為里氏木霉(Trichodermareesei)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、長枝木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、綠色木霉(Trichoderma viride)、鉤狀木霉(Trichoderma hamatum)中的任一種。
3.權(quán)利要求2所述的里氏木霉(Trichodermareesei)工程菌,其保藏號為CCTCC NO:M 2011469。
4.權(quán)利要求2所述的康氏木霉(Trichodermakoningii)工程菌,其保藏號為CCTCCNO:M 2011470。
5.權(quán)利要求2所述的綠色木霉(Trichoderma.viride)工程菌,其保藏號為CCTCC NO:M 2011471。
6.如權(quán)利要求1所述的木霉工程菌，其特征在于所述的特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)的內(nèi)切葡聚糖酶,包括有: 1)其氨基酸序列為SEQID NO:1的內(nèi)切葡聚糖酶； 2)在I)中限定的氨基酸中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有特異腐質(zhì)霉的內(nèi)切葡聚糖酶功能的，由I)衍生的蛋白質(zhì)。
7.如權(quán)利要求6所述的木霉工程菌，其特征在于所述的特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)的內(nèi)切葡聚糖酶的編碼基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO:2。
8.如權(quán)利要求1所 述的木霉工程菌，其特征在于所述表達載體其啟動子為木霉cbhl啟動子，終止子為木霉cbhl終止子，篩選標記為潮霉素。
9.權(quán)利要求1所述的木霉工程菌用于生產(chǎn)纖維素酶系。
10.權(quán)利要求9所述的纖維素酶系在紡織工業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種異源表達內(nèi)切葡聚糖酶基因的木霉工程菌及其應(yīng)用，所述的工程菌攜帶有能表達特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的內(nèi)切葡聚糖酶的表達載體。本發(fā)明的木霉工程菌能高效表達特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的內(nèi)切葡聚糖酶基因，從而增加了其纖維素酶系的內(nèi)切酶組分，改變了酶學pH特性，明顯擴大了其纖維素酶系在中性和堿性條件下的適用范圍；本發(fā)明生產(chǎn)的纖維素酶產(chǎn)品在pH 4.0-8.0范圍內(nèi)，無需調(diào)酸可直接應(yīng)用于水洗做舊、織布拋光等紡織工業(yè)領(lǐng)域，且效果良好，從而簡化了應(yīng)用工藝，節(jié)約成本。
文檔編號C12N15/63GK103184163SQ20111044823
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者黃亦鈞, 張青, 王華明, 許韡 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司, 上?？档囟魃锟萍加邢薰?br>