專利名稱：一個(gè)具LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白基因TaLRR3及其表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
一個(gè)具LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白基因TaLRR3及其表達(dá)載體和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開(kāi)了一個(gè)具LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白基因TaLRR3及其表達(dá)載體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥(Triticum aestivum)的整個(gè)生育期受到多種病蟲(chóng)的危害，其中由小麥條銹 M (Puccinia striiformis f. sp. tritic)侵染引起的條銹病發(fā)生部位主要是葉片，其次為葉鞘和莖上，穗部穎殼和芒上亦可發(fā)生。條銹病是威脅我國(guó)西北、西南、黃淮冬麥區(qū)和西北春麥區(qū)的最重要病害之一，在高緯度或高海拔的冷涼地區(qū)尤為嚴(yán)重。該病害常造成小麥嚴(yán)重減產(chǎn)，如中等流行年份減產(chǎn)10-20 %，大流行年份則減產(chǎn)30 %，特大流行年份可減產(chǎn) 50-60%,在少數(shù)地塊甚至顆粒無(wú)收。建國(guó)以來(lái)，我國(guó)曾發(fā)生16次中等規(guī)模、10次較大規(guī)模的小麥條銹病流行，2005年更是波及波及全國(guó)14個(gè)省區(qū)，發(fā)生面積達(dá)5700多萬(wàn)畝。由于小麥條銹病具有流行頻率高、爆發(fā)性強(qiáng)、傳播速度快、發(fā)生范圍廣、預(yù)防難度大等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅著小麥高產(chǎn)與穩(wěn)產(chǎn)，因此加強(qiáng)小麥條銹病的抗病研究，從而有效防治小麥條銹病大面積流行刻不容緩。
目前小麥條銹病的防治目前采取“以種植抗條銹品種為主，藥劑防治和栽培防治為輔”的綜合防治策略。選育并合理利用抗、耐條銹品種，并進(jìn)行合理品種布局，可有效減少越冬越夏菌源，是防治小麥條銹病最為經(jīng)濟(jì)、安全和有效的措施。我國(guó)培育出了大批抗銹小麥品種，這些品種在控制我國(guó)小麥條銹病的流行過(guò)程中起到了重要作用。小麥條銹菌生理小種具有高度變異性，目前小麥主栽品種中的抗病基因已逐漸被條中四、31、32號(hào)及新變異的生理小種所克服，還十分缺乏新的抗源，一旦條件適宜，條銹病將有可能再次大爆發(fā)， 從而造成重大經(jīng)濟(jì)損失。因此，基于優(yōu)良條銹病抗源，加快新型抗條銹病基因的發(fā)掘、克隆和利用，并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)育成優(yōu)良抗病品種，是加快抗病基因利用和提高抗病育種進(jìn)程的快捷途徑。
南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所利用四倍體圓錐小麥與二倍體簇毛麥雜交，再與普通小麥回交多代后，選育出了普通小麥-簇毛麥易位系92R137，自1994年進(jìn)入國(guó)內(nèi)育種利用以來(lái)，在四川、云南、陜西等條銹病常發(fā)區(qū)進(jìn)行了多年種植，對(duì)條銹病表現(xiàn)出了穩(wěn)定的高度抗性，尤其是對(duì)小麥條銹菌優(yōu)勢(shì)小種條中四、30、32表現(xiàn)高抗-免疫。遺傳分析表明， 92R137中的抗性由單基因控制，并呈顯性遺傳，該基因來(lái)自圓錐小麥，被國(guó)際小麥基因命名委員會(huì)命名為撲26。
Yr26是一個(gè)具有重要應(yīng)用價(jià)值的抗條銹病基因資源，成功克隆該基因或其抗病途徑中的某些關(guān)鍵基因，則可以為利用轉(zhuǎn)基因手段培育出抗條銹病轉(zhuǎn)基因小麥新品種奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種具LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白基因 iTaLRI^。
本發(fā)明的另一目的是提供該基因的表達(dá)載體。
本發(fā)明的又一目的是提供該基因和表達(dá)載體的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
具LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白基因TaLRR3，來(lái)自普通小麥(Triticum asetivum L. )92R137，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
該具LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)TaLRR3，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
含有所述的具LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白基因TaLRR3的表達(dá)載體。
所述的含有所述的具LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白基因TaLRR3的表達(dá)載體優(yōu)選以 PBI220為出發(fā)載體，將所述的TaLRR3基因插入pBI220的BamH I和I酶切位點(diǎn)間所得。
所述的具LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白基因TaLRR3在培育抗條銹病小麥品種中的應(yīng)用。
所述的含具LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白基因TaLRR3的表達(dá)載體在培育抗條銹病小麥品種中的應(yīng)用。
有益效果
本發(fā)明從小麥中克隆得到了一個(gè)具LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白基因TaLRR3及其所編碼的蛋白質(zhì)TaLRR3，為小麥中首次報(bào)道。TaLRR3可用于基因工程育種，將其插入表達(dá)載體 PBI220，得到的該基因的過(guò)量表達(dá)載體導(dǎo)入感病小麥品種中，可以提高感條銹病小麥品種對(duì)條銹病的抗性。


圖1利用Q-PCR分析TaLRR3在抗條銹病92R137和感條銹病揚(yáng)麥158中的表達(dá)橫坐標(biāo)0、6、12、24、72表示條銹菌誘導(dǎo)0小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)的小麥葉片樣PΡΠ O
圖2TaLRR3超量表達(dá)載體的構(gòu)建
A 植物表達(dá)載體 pBI220 ；B :pBI220 TaLRR3 表達(dá)載體。
圖3TaLRR3轉(zhuǎn)化揚(yáng)麥158的Ttl代陽(yáng)性植株的PCR分子鑒定
M :DL2000 ；1 水陰性對(duì)照；2 揚(yáng)麥158陰性對(duì)照；3 質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；6，13 陽(yáng)性植株；4-5，7-12，14 陰性植株。
圖4TaLRR3轉(zhuǎn)化揚(yáng)麥158的Ttl代陽(yáng)性植株的條銹病抗性鑒定
1 抗病對(duì)照92R137 ；2 感病對(duì)照揚(yáng)麥158 ；3-11 陽(yáng)性植株中的抗病植株。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 92R137中受條銹菌誘導(dǎo)表達(dá)的具LRR結(jié)構(gòu)域跨膜蛋白基因Ta-LRR的克隆
92R137是南京農(nóng)業(yè)大學(xué)用四倍體圓錐小麥(Triticum turgitum)與二倍體簇毛麥(Haynaldia villosa)雜交后的雙二倍體再與六倍體普通小麥多次回交后創(chuàng)造出的易位系(Chen, P. D. , Qi, L. L.，Zhou, B.，S. Z. Zhang, D. J. Liu. 1995Development and molecular cytogenetic analysis of wheat-Haynaldia villosa 6VS/6AL translocation lines specifying resistance to powdery mildew. TAG, (91) :1125-1128.)。92R137 的 IB 染色體上含有抗小麥條銹病基因％^6，該基因?qū)?qiáng)毒性小種條中四、31、32等優(yōu)勢(shì)小種的抗性達(dá)至丨J高抗-免疫水平(Chunmei Wang, Yiping Zhang, Dejun Han, Zhensheng Kang, Guiping Li,Aizhong Cao,Peidu Chen. SSR and STS markers for wheat stripe rust resistance gene Yr26. Euphytica, 2008，159 :359-366.)。
為了克隆抗病途徑中的抗病相關(guān)基因，本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中，采用基因芯片雜交法篩選抗條銹病小麥92R137與感條銹病小麥揚(yáng)麥158中的差異表達(dá)基因。具體流程如下將抗條銹病小麥92R137的種子和感條銹病小麥揚(yáng)麥158的種子播于培養(yǎng)皿中發(fā)芽，露白后移栽到盆缽，一葉期把從感條銹病小麥材料上搜集的條銹菌孢子接種到苗上進(jìn)行誘導(dǎo)，并于接種后12和36小時(shí)取樣，分別提取RNA(用hvitrogen公司的Trizol試劑提取)，形成兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組R12 (92R137誘導(dǎo)12小時(shí)的樣品)、R36 (92R137誘導(dǎo)36小時(shí)的樣品)和兩個(gè)對(duì)照組S12 (揚(yáng)麥158誘導(dǎo)12小時(shí)的樣品)、S36 (揚(yáng)麥158誘導(dǎo)36小時(shí)的樣品)。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組和兩個(gè)對(duì)照組的RNA樣品分別用Superscript 〗〗反轉(zhuǎn)錄成cDNA(試劑盒購(gòu)自Gibco/BRL，Gaithersburg，MD, USA)，并進(jìn)一步在體外轉(zhuǎn)錄成cRNA。2個(gè)實(shí)驗(yàn)組和2 個(gè)對(duì)照組的cRNA樣品分別與四張小麥表達(dá)譜芯片GeneChip (Affymetrix小麥基因表達(dá)譜芯片，part number 900515)雜交，芯片雜交實(shí)驗(yàn)在“上海國(guó)家生物芯片工程中心”完成，實(shí)驗(yàn)步驟參照 Affymetrix 公司說(shuō)明書(shū)"Expressed Analysis Technical Manual”(http:// www. affymetrix. com/support/technical/manual/expression_manual. affx)。以片 實(shí)驗(yàn)組雜交信號(hào)與對(duì)照組雜交信號(hào)的比值大于2為標(biāo)準(zhǔn)，篩選抗條銹病材料92R137中的上調(diào)表達(dá)基因。其中一個(gè)差異表達(dá)基因?yàn)門(mén)a. 22666，該基因是一個(gè)抗病基因類似物，并且在實(shí)驗(yàn)組R12與對(duì)照組S12的相比以及在實(shí)驗(yàn)組R36與對(duì)照組S36相比，該基因都存在差異表達(dá)，所以初步判斷該基因與條銹病抗性具有密切相關(guān)性。
以92R137經(jīng)條銹菌誘導(dǎo)12小時(shí)的葉片提取出的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板、 以根據(jù)芯片探針 Ta. 22666 設(shè)計(jì)的引物 Pl (CAGCTGACATCTCTGGATCT, SEQ ID N0. 3)和 P2 (GAAGCAGTGCGGAAGTAG, SEQ ID N0. 4)為引物進(jìn)行 RT-PCR，獲得了 92R137 中 Ta. 22666 基因的同源片段，并進(jìn)一步利用RACE方法獲得了該基因的全長(zhǎng)序列。該基因全長(zhǎng)IlMbp的序列，序列如SEQ ID NO. 1所示，序列分析顯示該序列包含一個(gè)全長(zhǎng)0RF，其中5，-UTR(非翻譯區(qū))99bp、3，-UTR 254bp、0RF(開(kāi)放閱讀框)80Ibp，編碼266個(gè)氨基酸，序列如SEQ ID N0. 2 所示。經(jīng) SMART 軟件(http://smart, embl-heidelberg. de/)分析，該基因編碼了一種跨膜蛋白，N端包含LRR結(jié)構(gòu)域，近C端有一個(gè)由M個(gè)氨基酸組成的疏水跨膜區(qū)域，所以該基因?yàn)橐粋€(gè)具有LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白(LRR containing transmembrane protein)，將該基因命名為T(mén)aLRR3。
實(shí)施例2TaLRR3基因受條銹菌誘導(dǎo)的表達(dá)特征
為了研究TaLRR3在抗感條銹病材料中的表達(dá)模式，利用抗病材料92R137和感病材料揚(yáng)麥158經(jīng)條銹菌誘導(dǎo)0、6、12、24、72小時(shí)的RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，利用Pl和P2 為引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR)分析。PCR程序?yàn)镻CR反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 (MylQ, Bio-Rad公司，美國(guó))上擴(kuò)增并檢測(cè)熒光。20uL PCR反應(yīng)體系中含2 X STOR GreenPCR Master Mix 10uL，0. 5 μ M引物Pl和P2，反轉(zhuǎn)錄cDNA模板2uL，用水補(bǔ)充至20uL。擴(kuò)增參數(shù)為95°C 10分鐘，然后95°C 15秒、60°C 30秒，72°C 1分鐘，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后， 進(jìn)行熔解曲線的測(cè)定。檢測(cè)基因表達(dá)水平用MyiQ系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在92R137 中，TaLRR3受條銹菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，12小時(shí)上調(diào)顯著，24h后表達(dá)水平最高，72小時(shí)表達(dá)已下降；在揚(yáng)麥158中，TaLRR3各個(gè)時(shí)間段的表達(dá)量均低于在92R137中的表達(dá)量，尤其在接種12小時(shí)和M小時(shí)這兩個(gè)關(guān)鍵時(shí)間段差異最顯著(圖1)。
實(shí)施例3TaLRR3超表達(dá)載體構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化普通小麥揚(yáng)麥158及抗條銹病鑒定
以來(lái)自92R137的cDNA為模板，以利用RACE方法獲得的TaLRR3的基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)橫跨 ORF 的弓丨物 P3 (CGCGGATCCATGGCTGATGATACCAAG, SEQ ID NO. 5)和 P4 (CGAGCTCTCATATCCGGACGACGTA, SEQ ID NO. 6)，且P3 帶有 BamHI 的酶切位點(diǎn)，P4 帶有 McI 的酶切位點(diǎn)。使用引物對(duì)P3和P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增片段。用BamHI和McI對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物插入到BamHI和McI雙酶切后的載體pBI220 (Jefferson RA, Kavanagh ΤΑ, Bevan Mff.GUS fusions :beta_glucuronidase as a sensitive andversatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 1987,6 :3901-3907.)中， 將TaLRR3置于35S啟動(dòng)子后面的多克隆位點(diǎn)處，替換掉載體本身帶有的⑶S基因。由此將目標(biāo)基因TaLRR3克隆到強(qiáng)啟動(dòng)子35S的下游，獲得表達(dá)載體pBI220 TaLRR3 (圖2)。
利用基因槍轉(zhuǎn)化方法TaLRR3轉(zhuǎn)入感條銹病受體的轉(zhuǎn)化方法如下1、挑取預(yù)培養(yǎng)7 天約2000塊揚(yáng)麥158幼胚愈傷組織，在高滲培養(yǎng)基(MS+ABA0. 5mg/L+水解酪蛋白500mg/ L+2，4-D2mg/L+葡萄糖30g/L+0. 4mol/L甘露醇，ρΗ5· 8)上預(yù)處理4-5小時(shí)；2、將攜有目的基因TaLRR3的過(guò)量表達(dá)載體pBI220 TaLRR3通過(guò)基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化到揚(yáng)麥158愈傷組織，轟擊后在高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)。3、將愈傷組織轉(zhuǎn)移至恢復(fù)培養(yǎng)基(1/2MS+水解酪蛋白500mg/L+2，4-Dang/L+蔗糖30g/L，pH5. 8)上暗培養(yǎng)2周；4、將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有除草劑的篩選培養(yǎng)基上(1/2MS+ABA0. 5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2，4-Dlmg/L+蔗糖 30g/L+4mg/LBialaphos, pH5. 8)篩選培養(yǎng)2周；5、將具有除草劑抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中(1/2MS+L-谷氨酞胺 lmmol/L+水解酪蛋白 200mg/L+KT lmg/L+IAA 0. 5mg/L+ 蔗糖30g/L+瓊脂0. 8%，pH5. 8)進(jìn)行分化，待分化芽長(zhǎng)至2-4cm時(shí)將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基 (l/2MS+KTlmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂0. 8%，pH5. 8)中。6、至再生苗長(zhǎng)約8cm、根系較健壯時(shí)，即可開(kāi)管煉苗1-2天，最后洗去根系攜帶的培養(yǎng)基殘?jiān)憧梢圃匀肱枥彙＋@得再生植株共307棵。
提取所有再生植株基因組DNA，對(duì)轉(zhuǎn)化植株利用啟動(dòng)子內(nèi)部引物 P5 (GTTATGCTGGAGGTTGAGGAGA, SEQ ID N0. 7)和基因內(nèi)部引物 P6 (GACCAAAGGGCAATTGAGAC， SEQ ID N0. 8)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以鑒定陽(yáng)性植株。PCR程序10-50ng基因組DNA模板，10 μ M 的 Ρ5 禾口 Ρ6 各 0· 5μ 1 ;2· 5μ 1 IOXbuffer ；2. 5μ 1 2. 5mM 的 dNTP ;1. 5 μ 1 25mM 的 Mg2+; 0. 25 μ 1 (5U/ μ l)Taqpolymerase (TaKaRa)，加水至 25 μ 1。PCR 反應(yīng)條件為:94°C 預(yù)變性 3 分鐘；94°C 45秒，550C 45秒，72°C 2分鐘，33個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。其中沈株可以擴(kuò)增約1200bp的目的條帶，鑒定為陽(yáng)性植株。圖3 所示為T(mén)tl代陽(yáng)性植株的PCR分子鑒定，從11株轉(zhuǎn)基因植株中鑒定出2株陽(yáng)性植株。
對(duì)部分鑒定的陽(yáng)性植株、陰性植株、抗病對(duì)照植株92R137和感病對(duì)照植株揚(yáng)麥 158，在一葉期接種條銹菌，15天后進(jìn)行表型統(tǒng)計(jì)和抗病性鑒定?？共?duì)照植株92R137對(duì)條銹菌表現(xiàn)高抗，葉片上產(chǎn)生過(guò)敏性壞死斑，無(wú)孢子生長(zhǎng)；感病對(duì)照植株揚(yáng)麥158對(duì)條銹菌表現(xiàn)高感，無(wú)過(guò)敏性壞死斑，葉片上布滿條銹菌孢子；轉(zhuǎn)基因Ttl代陽(yáng)性植株與未轉(zhuǎn)化揚(yáng)麥 158相比，條銹菌抗性水平得到顯著提高，葉片上只有少量孢子，而且葉片上產(chǎn)生了與抗病 92R137相似的過(guò)敏性壞死斑，這是葉片對(duì)條銹菌產(chǎn)生抗性的標(biāo)志(圖4)。
權(quán)利要求
1.一種具LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白基因TaLRR3，其特征在于其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
2.權(quán)利要求1所述具LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)TaLRR3，其特征在于其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
3.含有權(quán)利要求1所述的具LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白基因TaLRR3的表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的含有具LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白基因TaLRR3的表達(dá)載體是以pBI220為出發(fā)載體，將權(quán)利要求1所述的TaLRR3基因插入 PBI220的BamH I和&ic I酶切位點(diǎn)間所得。
5.權(quán)利要求1所述的具LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白基因TaLRR3在培育抗條銹病小麥品種中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3或4所述的含具LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白基因TaLRR3的表達(dá)載體在培育抗條銹病小麥品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開(kāi)了一個(gè)具LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白基因TaLRR3及其表達(dá)載體和應(yīng)用。具LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白基因TaLRR3的cDNA序列為SEQ ID NO.1及其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.2。該基因來(lái)自普通小麥(Triticum asetivum L.)92R137，為在小麥中首次報(bào)道。TaLRR3在抗條銹病小麥品種92R137中受條銹菌誘導(dǎo)表達(dá)增強(qiáng)，且表達(dá)水平遠(yuǎn)高于在感病小麥品種揚(yáng)麥158中的表達(dá)水平。將該基因插入pBI220獲得過(guò)量表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化感條銹病小麥品種揚(yáng)麥158，T0代抗條銹病鑒定結(jié)果表明TaLRR3的過(guò)量表達(dá)可以提高感條銹病小麥品種對(duì)條銹病的抗性。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102505016SQ20111044845
公開(kāi)日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者康振生, 徐磊, 曹愛(ài)忠, 王曉杰, 王秀娥, 葛帥, 蔣正寧, 邢莉萍, 陳佩度, 韓德俊 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)