專利名稱：一種使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種利用微生物發(fā)酵糖類的方法，尤其是關(guān)于一種使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法。
背景技術(shù)：
由再生資源來(lái)生產(chǎn)替代性能源和取代石油衍生性的化學(xué)品是目前國(guó)際市場(chǎng)的主流，也是必然的趨勢(shì)。再生資源中，尤以植物生質(zhì)(即木質(zhì)纖維素)的蘊(yùn)藏量最豐，而木質(zhì)纖維素包含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，其中纖維素和半纖維素經(jīng)酵素水解后，主要可生成葡萄糖(glucose)和木糖(xylose),本發(fā)明可以將細(xì)菌(如:大腸桿菌)改質(zhì)，經(jīng)改質(zhì)后的菌株即具有同時(shí)且快速代謝葡萄糖和木糖的能力，并能發(fā)酵轉(zhuǎn)化生成能源(如:酒精)和其他大宗化學(xué)品(如:乳酸)。習(xí)知技術(shù)中，常見利用大腸桿菌對(duì)糖類進(jìn)行發(fā)酵的技術(shù)，然而此一方法存在著若干尚待解決的問(wèn)題。大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)在于生長(zhǎng)快速、培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單且易于調(diào)配、發(fā)酵過(guò)程易于操作、并且可以代謝多種不同的糖類，然而在同時(shí)具有多種糖類的生長(zhǎng)環(huán)境之下，大腸桿菌會(huì)優(yōu)先代謝葡萄糖，待生長(zhǎng)環(huán)境中的葡萄糖消耗完畢后，才會(huì)開始依序代謝其他糖類，因此無(wú)法同時(shí)代謝不同的糖類，使得整體糖類的代謝速率無(wú)法提升，甚至造成非葡萄糖的其他糖類代謝不完全，導(dǎo)致糖類代謝的效率低落。先前技術(shù)利用紫外光、伽瑪射線、亞硝基胍(nitrosoguanidine)等致突變劑使得菌種產(chǎn)生突變，接著透過(guò)篩選的方式找出可以同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的菌株，然而此一方法步驟繁瑣，亦非在了解菌種糖類代謝機(jī)制的情況下將菌種改良而得到可同時(shí)代謝五碳糖與六碳糖的菌株，而是藉由重復(fù)篩選的方式摸索尋找可能適合的變種菌株，因此效果較 差。由于大腸桿菌在代謝葡萄糖時(shí)所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物會(huì)抑制其他糖類的代謝路徑，因此有習(xí)知技術(shù)讓大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)移酵素系統(tǒng)產(chǎn)生缺陷，以期降低大腸桿菌代謝葡萄糖時(shí)所造成的降解產(chǎn)物抑制效應(yīng)，希望藉此提高其他糖類的代謝速率。然而，具有缺陷的大腸桿菌雖然可以因此同時(shí)代謝葡萄糖與木糖，但是其對(duì)于葡萄糖的代謝速率卻明顯降低，反而不利于整體的代謝流程及產(chǎn)物生成效率。若干先前技術(shù)會(huì)在糖類發(fā)酵過(guò)程中同時(shí)采用兩種分別代謝葡萄糖和木糖的菌株，希望能藉由兩種菌株分工的方式達(dá)到同時(shí)代謝五碳糖與六碳糖的目的。但是這樣的發(fā)酵過(guò)程操作不易，必須多次嘗試與調(diào)整才能達(dá)到最佳的發(fā)酵成效，并且必須事先培養(yǎng)兩種菌株，因此也會(huì)導(dǎo)致整體發(fā)酵成本的增加,并不利于工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用。由于必須克服前述習(xí)知技術(shù)的缺點(diǎn)，例如發(fā)酵成本過(guò)高、發(fā)酵速率與效率不佳、發(fā)酵操作程序困難繁復(fù)等，因此有必要找到能夠利用易于制備的單一菌株同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，以便改善與簡(jiǎn)化糖類發(fā)酵的程序并提升糖類發(fā)酵的效能，藉此提升相關(guān)產(chǎn)業(yè)界的技術(shù)，尤其在生質(zhì)能源的領(lǐng)域更有其必要性。

發(fā)明內(nèi)容
人類第四次工業(yè)革命的產(chǎn)業(yè)實(shí)系于綠色的制程，其中生物產(chǎn)業(yè)被視為綠色工業(yè)的代表，生物產(chǎn)業(yè)有賴于生物技術(shù)為基礎(chǔ)，相對(duì)于以化石能源為基礎(chǔ)的化學(xué)工業(yè)，生物技術(shù)可有效降低能源的消耗和污染的排放，尤其生物技術(shù)可利用再生資源，達(dá)到永續(xù)發(fā)展和改善環(huán)境的目的。再生資源是指以生物質(zhì)(biomass)為原料，范圍主要包括作物、農(nóng)林漁牧加工后的廢棄物和工業(yè)及都市排放的有機(jī)廢棄物，透過(guò)生物精煉制程(biorefinery process)可將這些生物質(zhì)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)替代性能源、取代石油衍生性的產(chǎn)品和新產(chǎn)品，這類新興產(chǎn)業(yè)的市場(chǎng)以每年約15%的速率成長(zhǎng)，預(yù)計(jì)2012年的全球總產(chǎn)值可達(dá)到1215億美元(Gobina E，2007, report code EGY054A, BCC Research publications)。再生資源中，尤以木質(zhì)纖維素(Iignocellulose)的蘊(yùn)藏量最豐,木質(zhì)纖維素的來(lái)源廣泛，但目前被研究可做為發(fā)酵料源的，包括(I)農(nóng)業(yè)殘留物如甘蔗渣、稻桿、榖殼、玉米桿等，(2)非糧食作物，如芒草等，(3)木本生物質(zhì)，如麻瘋樹等，(4)生物質(zhì)廢棄物，如蔬菜和水果廢棄物、紙漿廢棄物和都市排放固態(tài)廢棄物等(Dietmar P, 2006, Biotechnol J.1:806-814)。一般而言，木質(zhì)纖維素的組成包含30-60%纖維素(cellulose)、20_40%半纖維素(hemicellulose)和10-30%木質(zhì)素(Iignin)。而纖維素是一種由葡萄糖以β_1,4糖鍵結(jié)(glycosidic linkage)的聚合糖，由于其本身分子和分子間的氫鍵鍵結(jié)，以致造成結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)的結(jié)構(gòu)；半纖維素則是一種由六碳糖和五碳糖所構(gòu)成的具有復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)的聚合糖，軟木的半纖維素組成分主要是六碳糖如葡萄糖，而硬木的半纖維素組成分主要是五碳糖如木糖(Ganapathy S.et al.2010,Eng.Life Sc1.10:8_18)。纖維素和半纖維素經(jīng)水解后，主要可生成葡萄糖和木糖，絕大部分的微生物皆可有效代謝葡萄糖，然僅有少數(shù)的微生物可以發(fā)酵木糖，不過(guò)代謝效能不彰，以致影響了以木質(zhì)纖維素為基礎(chǔ)的微生物發(fā)酵精煉制程的工業(yè)發(fā)展。相較于其他細(xì)菌，大腸桿菌是一株工業(yè)實(shí)用友善性極高的菌種，它的優(yōu)勢(shì)在于生長(zhǎng)快速、培養(yǎng)基質(zhì)配方簡(jiǎn)單、發(fā)酵易操作，尤其大腸桿菌具有代謝多種類糖(包括木糖)的能力，不過(guò)當(dāng)有多種糖類同時(shí)存在的環(huán)境下，大腸桿菌將優(yōu)先使用葡萄糖，其他糖類(如木糖)的代謝則受到抑制，待葡萄糖消耗完后，其他糖類再依次代謝，因此遲緩了糖的代謝速率，甚至造成其他糖類代謝的不完全，以致效率不佳?；诖?，本發(fā)明技術(shù)就是運(yùn)用代謝工程的技術(shù)來(lái)改質(zhì)大腸桿菌，根據(jù)大腸桿菌的葡萄糖和木糖代謝路徑，剔除大腸桿菌的PtsG基因，以緩和葡萄糖降解物抑制的現(xiàn)象，再引介運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)的葡萄糖促進(jìn)基因(glucose facilitatorgene) gif,以增進(jìn)大腸桿菌的葡萄糖代謝速率，且加強(qiáng)五碳糖磷酸代謝路徑的rpiA、tktA、rpe、talB基因表現(xiàn)，以增加大腸桿菌木糖代謝的速率，最后移除生產(chǎn)其他有機(jī)酸的ldhA、frdA、pta、poxB基因，以便移除生成的有機(jī)酸對(duì)于五碳糖磷酸的回饋抑制作用。整合以上的代謝工程技術(shù)，經(jīng)改質(zhì)后的單一菌株即能同時(shí)代謝葡萄糖和木糖，且葡萄糖和木糖的消耗速率可幾乎達(dá)到同步，操作簡(jiǎn)易方便，亦可簡(jiǎn)化發(fā)酵程序，以生產(chǎn)能源(如酒精)和其他大宗化學(xué)品(如乳酸)為最佳實(shí)施例，可有效提升發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)效能，極具發(fā)展前瞻性和潛力。圖3.大腸桿菌的葡萄糖和木 糖代謝路徑。本發(fā)明是利用基因工程的方式改良大腸桿菌的代謝路徑，使大腸桿菌得以同時(shí)且快速地代謝五碳糖與六碳糖，包含以下步驟:剔除大腸桿菌的PtsG基因，以緩和葡萄糖降解物抑制的現(xiàn)象；引介運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)的葡萄糖促進(jìn)基因(glucose facilitator gene) gif,以增進(jìn)大腸桿菌的葡萄糖代謝速率；引入一起動(dòng)子以加強(qiáng)五碳糖磷酸代謝路徑的rpiA、tktA、rpe、talB基因表現(xiàn)，藉此增加大腸桿菌木糖代謝的速率；剔除生產(chǎn)其他有機(jī)酸的ldhA、frdA、pta、p0XB基因，以便移除代謝過(guò)程中生成的有機(jī)酸對(duì)于五碳糖磷酸的回饋抑制作用。因此，本發(fā)明的一種利用微生物發(fā)酵糖類的方法不但可以增進(jìn)菌株發(fā)酵植物生質(zhì)水解產(chǎn)物的速率，亦可簡(jiǎn)化發(fā)酵程序，并且有效提升發(fā)酵產(chǎn)品的生成效能，具有國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求的潛力。


圖1為本發(fā)明的一種實(shí)施方式的流程圖。圖2為本發(fā)明的另一實(shí)施方式的流程圖。圖3.大腸桿菌的葡萄糖和木糖代謝路徑。圖4.DNA電泳圖。圖5.質(zhì)體 pND-glf 圖譜。圖6.質(zhì)體 pHK-glf 圖譜。圖7.DNA電泳圖。圖8.質(zhì)體 pPhi80_rTA 圖譜。

圖9.DNA電泳圖。圖10.質(zhì)體 pLam-rTB 圖譜。圖11.DNA 電泳圖。圖12.質(zhì)體 pMC-poxKm 圖譜。圖13.DNA 電泳圖。圖14.質(zhì)體 pMC-ptaKm 圖譜。圖15.DNA 電泳圖。圖16.質(zhì)體 pND-pet 圖譜。圖17.重組菌株BL21/pND_pet和BL-G/pND-pet的混合糖消耗曲線。圖18.重組菌株BL21/pND_pet和BL-G/pND-pet發(fā)酵混合糖生產(chǎn)酒精曲線。圖19.重組菌株BL-Gf/pND-pet和BL21e-RB/pND_pet的混合糖消耗曲線。圖20.重組菌株BL21/pND_pet和BL-G/pND-pet發(fā)酵混合糖生產(chǎn)酒精曲線。圖21.重組菌株BL-A4/pND_pet的混合糖消耗曲線。圖22.重組菌株BL-A4/pND-pet發(fā)酵混合糖生產(chǎn)酒精曲線。圖23.質(zhì)體 pTrc-H/D-ldh 圖譜。圖24.BL-A4/pTrc-H/D-Ldh的混合糖發(fā)酵生產(chǎn)乳酸曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明于實(shí)施例中所提及的實(shí)驗(yàn)操作方法，優(yōu)先說(shuō)明如下:一般實(shí)驗(yàn)方法與材料
本發(fā)明技術(shù)中采用的一般實(shí)驗(yàn)方法和DNA選殖(DNA cloning)主要可參考本技藝中所詳知的教科書:Sambrook J, Russell Dff, 2001, Molecular Cloning:a LaboratoryManual.3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York,其中例如限制酶剪切DNA 片段反應(yīng)(cleavage reaction by restricting enzyme)、使用 T4DNA黏接酶(ligase)黏接 DNA 片段反應(yīng)(DNA ligation with T4DNA ligase)、聚合酶連鎖反應(yīng)(polymerasechain reaction, PCR)、瓊脂凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)、硫酸十二酯鈉-聚丙烯酸胺電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)和質(zhì)體轉(zhuǎn)形(transform)等,這些技術(shù)都是熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士可根據(jù)本身的專業(yè)素養(yǎng)來(lái)實(shí)施。此外、細(xì)菌培養(yǎng)液密度是使用分光亮度計(jì)(V530，Jasco)測(cè)量，測(cè)定波長(zhǎng)為550nm，所得到的吸光值記錄為0D550。蛋白質(zhì)濃度分析則是使用蛋白質(zhì)分析試劑(Proteinassay Reagent, BioRad C0.),進(jìn)行總蛋白質(zhì)的定量,個(gè)別標(biāo)的的蛋白質(zhì)則是以影像分析儀(AlphalmagerEP, AlphaInnotech)來(lái)分析經(jīng)凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)加以定量。細(xì)菌及卩遼菌體染色體(chromosome)、質(zhì)體(plasmid)和DNA片段的純化則分別使用 Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega C0.)、High-Speed Plasmid Minikit (Geneaid C0.)和 Ge I/PCR DNA Fragments Extraction Kit (Geneaid C0.)等商業(yè)純化藥品組。DNA核苷酸定點(diǎn)突變則使用QuickChange Site-Directed MutagenesisKit (Stratagene C0.)、限制酶(Restriction enzyme)購(gòu)自 New England Biolabs 以及Fermentas Life Science, T4 DNA 黏接酶和 Pfu DNA 聚合酶(polymerase)購(gòu)自 PromegaC0.，聚合酶連鎖反應(yīng)中所須的引子(primers)委由明欣生物科技公司(臺(tái)北)及源資生物科技公司(臺(tái)北)合成。DNA選殖過(guò)程中所使用的中介細(xì)胞為大腸桿菌DH5 a (Stratagene C0.)、BW25142(Haldimann and Wanner,2001, J.Bacteriol.,183:6384-93)與 BL21(DE3)(Invitrogen C0.),細(xì)菌以 LB 營(yíng)養(yǎng)基(Miller JH, 1972, Experiments in MolecularGenetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)培養(yǎng)，而經(jīng)轉(zhuǎn)形的菌種則在培養(yǎng)基中添加抗生素培養(yǎng)，抗生素用量如安培西林(ampicillin)為50 μ g/mL，康納霉素(kanamicin)為 50 μ g/mL。實(shí)施例一:1.剔除大腸桿菌染色體的ptsG基因:根據(jù)前人的研究，移除ptsG基因產(chǎn)物的功能后，可減緩大腸桿菌中葡萄糖降解物抑制的效應(yīng)，使得大腸桿菌可以同時(shí)利用木糖和葡萄糖。因此，首先剔除大腸桿菌染色體的PtsG基因，其進(jìn)行步驟如下所述。根據(jù)EcoCyc基因體數(shù)據(jù)庫(kù)中ptsG基因周遭的核苷酸序列來(lái)合成以下兩個(gè)引子:順向引子1:(5，-TGGGTGAAACCGGGCTGG)反向引子2:(5， -AGCCGTCTGACCACCACG)使用Wizard Genomic DNA purification kit (Promega C0.)來(lái)純化菌株 CGSC9031 (E.coli Genetic Stock Center, USA)的染色體，以純化后的染色體為DNA模版(template)，使用上述兩個(gè)引子進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出一段DNA(2.8kb)，其兩端包含ptsG基因N端及ptsG基因C端的同源區(qū)域，而其中間部分則包含一個(gè)兩端被FRT位置(sites)鑲夾的抗康納霉素基因，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進(jìn)行純化。接著，依照前述的“化學(xué)轉(zhuǎn)形法”，將協(xié)助型質(zhì)體pKD46 (Datsenko K.A.and Wanner
B.L., 2000, Proc.Natl.Aca.Sc1.USA, 97:6640-6645)轉(zhuǎn)形入大腸桿菌亞型 B BL21 中，得到菌株BL21/pKD46。依照前述的“電穿孔法”，準(zhǔn)備菌株BL21/pKD46的勝任細(xì)胞，再利用電穿孔法將上述所得的線性DNA送入菌株BL21/pKD46中，隨后以SOC培養(yǎng)基于30°C下培養(yǎng)，同時(shí)加入ImM阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)生產(chǎn)質(zhì)體PKD46上的λ -Red基因，以幫助此增幅出來(lái)的線性DNA與染色體ptsG基因進(jìn)行同源重組(homologous recombination),誘導(dǎo)二小時(shí)后,將培養(yǎng)溫度提升到42°C，經(jīng)二小時(shí)后以離心機(jī)將細(xì)胞離心下來(lái)，移除上清液，將細(xì)胞涂灑在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基上。隨意挑選生長(zhǎng)于固態(tài)培養(yǎng)基的菌落，以順向引子3和反向引子4 (如下)，使用前述的“原位PCR反應(yīng)”來(lái)確認(rèn)染色體基因ptsG中所鑲嵌的抗康納霉素基因，如圖4中所示，挑選出的菌株可增幅出抗康納霉素基因的DNA片段，然而原生型菌株BL21則無(wú)法增幅出抗康納霉素基因的DNA片段。最后選擇其中一株菌株，根據(jù)前述的“抗抗生素基因移除法”來(lái)移除該菌株染色體上鑲嵌的抗康納霉素基因，經(jīng)溫度誘導(dǎo)協(xié)助型質(zhì)體pCP20產(chǎn)生FLP蛋白質(zhì)，經(jīng)作用于兩個(gè)FRT位置后，將抗康納霉素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株無(wú)法在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌株，重新命名為BL-G。圖4.DNA電泳圖。徑1:原生型菌株BL21 ;徑2 =DNA標(biāo)準(zhǔn)物；徑3:染色體鑲嵌抗康納霉素基因的菌株。順向引子3:(5`， -GATTGAACAAGATGGATTGC)反向引子4:(5， -GAAGAACTCGTCAAGAAGGC)2.建構(gòu)含有g(shù)if基因的重組大腸桿菌菌株:根據(jù)前人的研究報(bào)導(dǎo)，ptsG基因缺陷大腸桿菌的葡萄糖消耗速率將大幅降低，另一方面，過(guò)去的研究顯示來(lái)自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)的葡萄糖促進(jìn)基因(glucose facilitator gene) gif產(chǎn)物可提供大腸桿菌運(yùn)輸葡萄糖到胞內(nèi)的功能(ParkerC et al.，1995，Mol Microbiol.15:795-802)，為了設(shè)法提升此缺陷菌BL-G的葡萄糖消耗速率，因此將gif基因引介入PtsG基因缺陷大腸桿菌中。建構(gòu)過(guò)程如下，首先根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物科技信息中心(NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫(kù)gif的核苷酸序列(GenBank:M60615.1)來(lái)合成gif基因引子:順向引子5:(5， -TGTCTCTAGAAGCATGCAGGAGGAATCG)反向引子6:(5， -AGCAACTCGAGTTACTTCTGGGAGCGCCAC)上述順向引子被設(shè)計(jì)含有限制酶XbaI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)，而反向引子設(shè)計(jì)含有XhoI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)。以Z.mobilis的染色體做為DNA模板，并以上述兩個(gè)引子進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出一含有g(shù)if的片段(1.4kb)，以Gel/PCR DNAFragments Extraction Kit將增幅的基因片段進(jìn)行純化后,使用限制酵素XbaI以及XhoI切割此基因片段；另一方面，利用High-Speed Plasmid Mini kit純化質(zhì)體pND707 (LoveCA et al.，1996，Gene，176:49-53),以限制酵素 XbaI 以及 XhoI 切割，使用 Gel/PCR DNAFragments Extraction Kit將酵素切割過(guò)的DNA片段回收。接著利用T4黏合酶(T4ligase)將上述兩個(gè)片段黏合后，依照前述“一般實(shí)驗(yàn)方法”，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌株DH5a中，而得到質(zhì)體pND-glf,如下圖5所示。圖5.質(zhì)體pND-glf圖譜。符號(hào)簡(jiǎn)寫說(shuō)明:bla，抗安培西林基因；CI857，抑制子；lambda PR, λ PR 啟動(dòng)子；lambda PL, λ PL 啟動(dòng)子。接著，構(gòu)筑鑲嵌式質(zhì)體(integrationplasmid) pHK-glf,根據(jù)質(zhì)體 pND-glf 的 DNA序列，設(shè)計(jì)以下的引子:順向引子7:(5’ -AAGGGGGATCCATCTAACACCGTGCGTGTTG)反向引子8:(5， -AGCAACTCGAGTTACTTCTGGGAGCGCCAC)上述順向引子被設(shè)計(jì)含有限制酶BamHI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)。以質(zhì)體pND-glf做為DNA模板，并以上述兩個(gè)引子進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，增幅出一段含有受 λ PRPL 啟動(dòng)子調(diào)控 gif 的 DNA 片段(1.8kb),以 Gel/PCR DNAFragments ExtractionKit將增幅的基因片段進(jìn)行純化后，使用限制酵素BamHI以及SmaI切割；另一方面，利用 High-Speed Plasmid Mini kit 純化的壤嵌式質(zhì)體 pHK_Km(Chiang CJ et al., 2008,Biotechnol.Bioeng.101:985-995)，以限制酵素 BamHI 以及 SmaI 切割；接著使用 Gel/PCRDNA Fragments Extraction Kit將上述被酵素切割過(guò)的DNA片段回收,利用T4黏合酶(Τ4l igase)將上述兩個(gè)片段黏合后，依照前述“一般實(shí)驗(yàn)方法”，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌株DH5a (pir)中，而得到鑲嵌式質(zhì)體pHK-glf,質(zhì)體圖譜如下圖6所示。圖6.質(zhì)體pHK-glf圖譜。符號(hào)簡(jiǎn)寫說(shuō)明:Km，康納霉素抗性基因；R6K origin，大腸桿菌R6K復(fù)制源點(diǎn)；HK attP,前嗜菌體(prophage)HK鑲嵌位置；lambda PR, Pk啟動(dòng)子；lambda PL, Plj 啟動(dòng)子。其次，將受λ PRPL啟動(dòng)子調(diào)控gif基因鑲嵌至ptsG基因缺陷菌株BL-G的染色體上，因此將協(xié)助型質(zhì)體 pAH69 (Haldimann A and Wanner BL., 2001, J Bacteriol., 183:6384-6393)依照前述的“化學(xué)轉(zhuǎn)形法”轉(zhuǎn)形進(jìn)入大腸桿菌菌株BL-G中，得到菌株BL-G/PAH69;接著根據(jù)前述的“質(zhì)體鑲嵌細(xì)菌染色體法”，將鑲嵌式質(zhì)體pHK-glf再轉(zhuǎn)形入菌株BL-G/pAH69中，進(jìn)行基因鑲嵌入菌株染色體，以含有康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基來(lái)篩選菌株。挑選單一菌落，利用順向引子7和反向引子8，使用前述的“原位PCR反應(yīng)”來(lái)確認(rèn)染色體鑲嵌一個(gè)gif基因，經(jīng)挑選出的菌株可增幅出一個(gè)受λ PRPL啟動(dòng)子調(diào)控gif基因片段(徑3)，如下圖7所示。圖7.DNA電泳圖。徑1:DNA標(biāo)準(zhǔn)物；徑2:質(zhì)體pHK-glf ;徑3:染色體鑲嵌gif基因菌株。最后，根據(jù)前述的“抗抗生素基因移除法”來(lái)移除該菌株染色體上鑲嵌的抗康納霉素基因，經(jīng)溫度誘導(dǎo)協(xié)助型質(zhì)體PCP20產(chǎn)生FLP蛋白質(zhì)，經(jīng)作用于兩個(gè)FRT位置后，將抗康納霉素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株無(wú)法在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌株，重新命名為BL-Gf。
3.強(qiáng)化大腸桿菌的rpe和tktA基因:為了增進(jìn)菌株代謝木糖的速率，因此將強(qiáng)化菌株的五碳糖磷酸代謝路徑中的rpe和tktA基因。其執(zhí)行流程如下，首先根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物科技信息中心(NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫(kù)rpe的核苷酸序列來(lái)合成引子:順向引子9:(5’ -TATACATATGAAACAGTATTTGATTGC)反向引子10:
(5， -CCTGAATTCAAACTTATTCATGACTTACC)上述順向引子被設(shè)計(jì)含有限制酶NdeI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)，而反向引子設(shè)計(jì)含有EcoRI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)。以大腸桿菌BL21的染色體做為模板，并以上述兩個(gè)引子進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出一含有rpe基因的片段(0.7kb)，以Gel/PCR DNAFragments Extraction Kit將增幅的基因片段進(jìn)行純化后,用限制酵素NdeI以及EcoRI切害lJ,再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過(guò)的DNA片段回收；另一方面，根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物科技信息中心(NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫(kù)tktA的核苷酸序列來(lái)合成引子:順向引子11:(5， -ACGGGAATTCAGGAGGAGTCAAAATG)反向引子12:(5’ -GGGCCTCGAGTTACAGCAGTTCTTTTC)上述順向引子被設(shè)計(jì)含有限制酶EcoRI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)，而反向引子設(shè)計(jì)含有XhoI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)。以大腸桿菌BL21的染色體做為模板，并以上述兩個(gè)引子進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出一含有tktA基因的片段(2.0lkb)，以Gel/PCR DNAFragments Extraction Kit將增幅的基因片段進(jìn)行純化后,用限制酵素EcoRI以及XhoI切害I]，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過(guò)的DNA片段回收；同時(shí)利用 High-Speed Plasmid Mini kit 純化質(zhì)體 pND707 (Love CA et al., 1996, Gene, 176:49-53),以限制酵素 NdeI 以及 XhoI 切割，使用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過(guò)的DNA片段回收。接著利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述三個(gè)DNA片段黏合后，依照前述“一般實(shí)驗(yàn)方法”，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌株DH5 α中，而得到質(zhì)體pND-rTA。最后依據(jù)質(zhì)體pND-rTA的DNA序列，設(shè)計(jì)以下的引子:順向引子13:(5， AAGGGGGATCCATCTAACACCGTGCGTGTTG 3，)反向引子14:(5， -GGGCCTCGAGTTACAGCAGTTCTTTTC)上述順向引子被設(shè)計(jì)含有限制酶BamHI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)。以質(zhì)體pND-rTA做為模板，并以上述兩個(gè)引子進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出一含有受λ PRPL啟動(dòng)子調(diào)控 rpe-tktA 基因的片段(2.7kb),以 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit 將增幅的基因片段進(jìn)行純化后，用限制酵素BamHI切割；另一方面,利用High-Speed Plasmid Minikit 純化的壤嵌式質(zhì)體 pPhi80_Km (Chiang CJ et al.,2008, Biotechnol.Bioeng.101:985-995)，以限制酵素 BamHI 以及 SmaI 切害I];接著使用 Gel/PCR DNA FragmentsExtraction Kit將上述被酵素切割過(guò)的DNA片段回收，利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述兩個(gè)片段黏合后，依照前述“一般實(shí)驗(yàn)方法”，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌株DH5a (pir)中，而得到鑲嵌式質(zhì)pPhi80_rTA。 圖8.質(zhì)體pPhi80-rTA圖譜。符號(hào)簡(jiǎn)寫說(shuō)明:Km，康納霉素抗性基因；R6Korigin，大腸桿菌R6K復(fù)制源點(diǎn)；Phi80 attP,前嗜菌體(prophage) 80鑲嵌位置；lambda PR, Pk啟動(dòng)子；lambda PL, Pl啟動(dòng)子。其次，將受λ PRPL啟動(dòng)子調(diào)控rpe-tktA基因鑲嵌至步驟2建構(gòu)的菌株BL-Gf的染色體上，因此將協(xié)助型質(zhì)體 pAH123 (Haldimann A and Wanner BL., 2001, J Bacteriol.，183:6384-6393)依照前述的“化學(xué)轉(zhuǎn)形法”轉(zhuǎn)形進(jìn)入大腸桿菌菌株BL-Gf中，得到菌株BL-Gf/pAHl23 ;接著根據(jù)前述的“質(zhì)體鑲嵌細(xì)菌染色體法”，將鑲嵌式質(zhì)體PPhi80_rTA再轉(zhuǎn)形入菌株BL-Gf/pAH123中，進(jìn)行基因鑲嵌入菌株染色體，以含有康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基來(lái)篩選菌株。挑選單一菌落，利用順向引子13和反向引子14，使用前述的“原位PCR反應(yīng)”來(lái)確認(rèn)染色體鑲嵌一個(gè)rpe-tktA基因，經(jīng)挑選出的菌株可增幅出一個(gè)受λ PRPL啟動(dòng)子調(diào)控rpe-tktA基因片段(徑3)。圖9.DNA電泳圖。徑1:DNA標(biāo)準(zhǔn)物；徑2:質(zhì)體pPhi80_rTA ;徑3:染色體鑲嵌rpe-tktA基因菌株。最后，根據(jù)前述的“抗抗生素基因移除法”來(lái)移除該菌株染色體上鑲嵌的抗康納霉素基因，經(jīng)溫度誘導(dǎo)協(xié)助型質(zhì)體PCP20產(chǎn)生FLP蛋白質(zhì)，經(jīng)作用于兩個(gè)FRT位置后，將抗康納霉素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株無(wú)法在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌株，重新命名為BL21e。4.強(qiáng)化大腸桿菌的rpiA和talB基因:為了增進(jìn)菌株代謝木糖的速率，因此將強(qiáng)化菌株的五碳糖磷酸代謝路徑中的rpiA和talB基因。其執(zhí)行流程如下，首先根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物科技信息中心(NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫(kù)rpiA的核苷酸序列來(lái)合成引子:順向引子15:(5， -AATGCCATATGAATTTCATACCACAGGCGAAAC)反向引子16:(5， -TGGAGGAATTCCCGTCAGATCATTTCACAATG)上述順向引子被設(shè)計(jì)含有限制酶NdeI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)，而反向引子設(shè)計(jì)含有EcoRI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)。以大腸桿菌BL21的染色體做為模板，并以上述兩個(gè)引子進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出一含有rpiA基因的片段(0.7kb)，以Gel/PCR DNAFragments Extraction Kit將增幅的基因片段進(jìn)行純化后,用限制酵素NdeI以及EcoRI切害lJ,再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過(guò)的DNA片段回收；另一方面，根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物科技信息中心(NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫(kù)talB的核苷酸序列來(lái)合成引子:順向引子17:(5， -TTTGAATTCAGGAGGATACTATCATGACG)反向引子18:(5， -CTAACTCGAGGTCGACGTTACAGCAGATCGCCGATC 3，)
上述順向引子被設(shè)計(jì)含有限制酶EcoRI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)，而反向引子設(shè)計(jì)含有XhoI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)。以大腸桿菌BL21的染色體做為模板，并以上述兩個(gè)引子進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出一含有talB基因的片段(1.0kb)，以Gel/PCR DNAFragments Extraction Kit將增幅的基因片段進(jìn)行純化后,用限制酵素EcoRI以及XhoI切害I]，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過(guò)的DNA片段回收；同時(shí)利用 High-Speed Plasmid Mini kit 純化質(zhì)體 pND707 (Love CA et al., 1996, Gene, 176:49-53),以限制酵素 NdeI 以及 XhoI 切割，使用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過(guò)的DNA片段回收。接著利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述三個(gè)DNA片段黏合后，依照前述“一般實(shí)驗(yàn)方法”，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌株DH5ci中，而得到質(zhì)體pND-rTB。最后依據(jù)質(zhì)體pND-rTB的DNA序列，設(shè)計(jì)以下的引子:順向引子19:(5’ AAGGGGGATCCATCTAACACCGTGCGTGTTG 3’ )反向引子20:(5，-CTAACTCGAGGTCGACGTTACAGCAGATCGCCGATC 3，)上述反向引子被設(shè)計(jì)含有限制酶SalI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)。以質(zhì)體pND-rTB做為模板，并以上述兩個(gè)引子進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出一含有受λ PRPL啟動(dòng)子調(diào)控rpiA-talB基因的片段(1.7kb),以 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進(jìn)行純化后，用限制酵素Sail切割；另一方面,利用High-Speed Plasmid Mini kit純化的壤嵌式質(zhì)體pLamda-Km(Chiang CJ et al., 2008, Biotechnol.Bioeng.101:985-995),以限制酵素Sa il以及SmaI切割；接著使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將上述被酵素切割過(guò)的DNA片段回收，利用T4黏合酶(Τ4 ligase)將上述兩個(gè)片段黏合后，依照前述“一般實(shí)驗(yàn)方法”，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌株DH5ci (pir)中，而得到鑲嵌式質(zhì)pLam-rTB，質(zhì)體圖譜如圖10所示。圖10.質(zhì)體pLam-rTB圖譜。符號(hào)簡(jiǎn)寫說(shuō)明:Km,康納霉素抗性基因；R6K origin,大腸桿菌R6K復(fù)制源點(diǎn)；Lambda attP,前嗜菌體(prophage)鑲嵌位置；lambda PR,Pk啟動(dòng)子；lambda PL, Pl 啟動(dòng)子。其次，將受λ PRPL啟動(dòng)子調(diào)控rpiA-talB基因鑲嵌至步驟3建構(gòu)的菌株BL21e的染色體上，因此將協(xié)助型質(zhì)體 pAH121 (Haldimann A and Wanner BL., 2001, J Bacteriol.，183:6384-6393)依照前述的“化學(xué)轉(zhuǎn)形法”轉(zhuǎn)形進(jìn)入大腸桿菌菌株BL-Gf中，得到菌株BL21e/pAH121 ;接著根據(jù)前述的“質(zhì)體鑲嵌細(xì)菌染色體法”，將鑲嵌式質(zhì)體pLam-rTB再轉(zhuǎn)形入菌株BL21e/pAH121中，進(jìn)行基因鑲嵌入菌株染色體，以含有康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基來(lái)篩選菌株。挑選單一菌落，利用順向引子19和反向引子20，使用前述的“原位PCR反應(yīng)”來(lái)確認(rèn)染色體鑲嵌一個(gè)rpiA-talB基因，經(jīng)挑選出的菌株可增幅出一個(gè)受λ PRPL啟動(dòng)子調(diào)控rpiA-talB基因片段(徑3)。圖11.DNA電泳圖。徑1:DNA標(biāo)準(zhǔn)物；徑2:質(zhì)體pLam-rTB ;徑3:染色體鑲嵌rpiA-talB基因菌株。最后，根據(jù)前述的“抗抗生素基因移除法”來(lái)移除該菌株染色體上鑲嵌的抗康納霉素基因，經(jīng)溫度誘導(dǎo)協(xié)助型質(zhì)體PCP20產(chǎn)生FLP蛋白質(zhì)，經(jīng)作用于兩個(gè)FRT位置后，將抗康納霉素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株無(wú)法在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌株，重新命名為BL21e-RB。5.剔除大腸桿菌染色體的ldhA、poxB、pta、frdA基因:大腸桿菌主要進(jìn)行混合酸發(fā)酵，所生產(chǎn)的混合酸或混合酸相關(guān)代謝路徑中生產(chǎn)的中間代謝物，可能產(chǎn)生回饋抑制五碳糖磷酸代謝的作用，為了免除這個(gè)抑制機(jī)制，因此將混合酸生成代謝路徑中的ldhA、poxB、pta、frdA基因逐一剔除。進(jìn)行步驟如下:5.1根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物科技信息中心(NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫(kù)poxB的核苷酸序列來(lái)合成以下引子:順向引子21:(5， -ATTAGAAGCTTGCAGGGGTGAAACGCATCTG)反向引子22:(5’ -ATTAGACTAGTGGCTGGGTTGATATCAATC)上述順向引子被設(shè)計(jì)含有限制酶HindIII的切割位置(如底線所標(biāo)示者)，而反向引子設(shè)計(jì)含有SpeI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)。以大腸桿菌BL21的染色體做為模板，并以上述兩個(gè)引子進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出一含有poxB基因的片段(0.84kb)，以Gel/PCRDNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進(jìn)行純化后,用限制酵素HindIII以及SpeI切割,再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過(guò)的DNA片段回收；同時(shí)利用 High-Speed Plasmid Mini kit 純化質(zhì)體 pMCS-5 (Mo Bi Tec,Germany),以限制酵素 HindIII 以及 SpeI 切割，使用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit 將酵素切割過(guò)的DNA片段回收。接著利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述二個(gè)DNA片段黏合后，依照前述“一般實(shí)驗(yàn)方法”，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌株DH5 α中，而得到質(zhì)體pMC-pox。再依據(jù)美國(guó)國(guó)家生物科技信息中心(NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫(kù)poxB的核苷酸序列來(lái)合成以下引子:順向引子23:(5， -ATTAGGAATTCGTGATTGCGGTGGCAATC)反向引子24:(5， -ATTAGGTCGACGGTACCAAACTGGCGCAACTGCTG)上述順向引子被設(shè)計(jì)含有限制酶EcoRI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)，而反向引子設(shè)計(jì)含有SalI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)。以質(zhì)體pMC-pox做為模板，并以上述兩個(gè)引子進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，增幅出一段 DNA 片段(3.5kb)，以 Gel/PCR DNA Fragments ExtractionKit將增幅的基因片段進(jìn)行純化后，用限制酵素EcoRI以及SalI切割，再使用Gel/PCR DNAFragments Extraction Kit將酵素切割過(guò)的DNA片段回收；同時(shí)依據(jù)美國(guó)國(guó)家生物科技信息中心(NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫(kù)中質(zhì)體 pKD13 (Datsenko K.A.and Wanner B.L., 2000, Proc.Natl.Aca.Sc1.USA, 97:6640-6645)的核苷酸序列來(lái)合成以下引子:順向引子25:(5， -TTAGGAATTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC)
反向引子26:(5， -ATTCCGGGGATCCGTCGACC)上述順向引子被設(shè)計(jì)含有限制酶EcoRI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)，而反向引子設(shè)計(jì)含有SalI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)。以質(zhì)體PKD13做為模板，并以上述兩個(gè)引子進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出一段包含一個(gè)兩端被FRT位置(sites)鑲夾的抗康納霉素基因片段(1.3kb),以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進(jìn)行純化后，用限制酵素 EcoRI 以及 SalI 切割，再使用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit 將酵素切割過(guò)的DNA片段回收；接著利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述二個(gè)DNA片段黏合后，依照前述“一般實(shí)驗(yàn)方法”，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌株DH5 α中，而得到質(zhì)體pMC-poxKm,質(zhì)體圖譜如圖12所示。圖12.質(zhì)體pMC-poxKm圖譜。符號(hào)簡(jiǎn)寫說(shuō)明:Ap，安培西林抗性基因；ColElorigin,大腸桿菌ColEl復(fù)制源點(diǎn);poxB_l, poxB基因的N端；poxB-2, poxB基因的C端；Km，康納霉素抗性基因；FRT，F(xiàn)RT位置。以質(zhì)體pMC-poxKm做為模板，使用順向引子21和反向引子22進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出一段DNA(1.9kb),其兩端包含poxB基因N端及poxB基因C端的同源區(qū)域,而其中間部分則包含一個(gè)兩端被FRT位置(sites)鑲夾的抗康納霉素基因，以Gel/PCR DNA FragmentsExtraction Kit將增幅的基因片段進(jìn)行純化。接著，依照前述的“化學(xué)轉(zhuǎn)形法”，將協(xié)助型質(zhì)體pKD46(Datsenko K.A.and Wanner B.L.,2000,Proc.Natl.Aca.Sc1.USA,97:6640-6645)轉(zhuǎn)形入步驟4建構(gòu)的菌株BL21e-RB中，得到菌株BL21e_RB/pKD46。依照前述的“電穿孔法”，準(zhǔn)備菌株BL21e-RB/pKD46的勝任細(xì)胞，再利用電穿孔法將上述所得的線性DNA送入菌株BL21e-RB/pKD46中，隨后以SOC培養(yǎng)基于30°C下培養(yǎng)，同時(shí)加入ImM阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)生產(chǎn)質(zhì)體PKD46上的λ -Red基因，以幫助此增幅出來(lái)的線性DNA與染色體poxB基因進(jìn)行同源重組(homologous recombination),誘導(dǎo)二小時(shí)后，將培養(yǎng)溫度提升到42°C,經(jīng)二小時(shí)后以離心機(jī)將細(xì)胞離心下來(lái)，移除上清液，將細(xì)胞涂灑在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基上。隨意挑選生長(zhǎng)于固態(tài)培養(yǎng)基的菌落，以順向引子21和反向引子22，使用前述的“原位PCR反應(yīng)”來(lái)確認(rèn)染色體基因poxB中所鑲嵌的抗康納霉素基因，挑選出的菌株可增幅出截?cái)嗟膒oxB基因內(nèi)鑲嵌抗康納霉素基因的DNA片段。最后選擇其中一株菌株，根據(jù)前述的“抗抗生素基因移除法”來(lái)移除該菌株染色體上鑲嵌的抗康納霉素基因，經(jīng)溫度誘導(dǎo)協(xié)助型質(zhì)體pCP20產(chǎn)生FLP蛋白質(zhì)，經(jīng)作用于兩個(gè)FRT位置后，將抗康納霉素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株無(wú)法在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌株，同時(shí)以順向引子21和反向引子22，使 用前述的“原位PCR反應(yīng)”來(lái)確認(rèn)抗康納霉素基因移除后所殘留的poxB基因片段(圖13，徑3)，獲得的菌株重新命名為BL-Al。圖13.DNA電泳圖。徑1:DNA標(biāo)準(zhǔn)物；徑2:截?cái)嗟膒oxB基因內(nèi)鑲嵌一個(gè)康納霉素抗性基因；徑3:康納霉素抗性基因移除后殘留的poxB基因片段。5.2根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物科技信息中心(NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫(kù)pta的核苷酸序列來(lái)合成以下引子:順向引子27:(5’ -TGTCCAAGCTTATTATGCTGATCCCTACC)反向引子28:(5， -GTTCGACTAGTTTAGAAATGCGCGCGTC)上述順向引子被設(shè)計(jì)含有限制酶HindIII的切割位置(如底線所標(biāo)示者)，而反向引子設(shè)計(jì)含有SpeI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)。以大腸桿菌BL21的染色體做為模板，并以上述兩個(gè)引子進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出一含有pta基因的片段(0.95kb)，以Gel/PCRDNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進(jìn)行純化后,用限制酵素HindIII以及SpeI切割,再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過(guò)的DNA片段回收；同時(shí)利用 High-Speed Plasmid Mini kit 純化質(zhì)體 pMCS-5 (Mo Bi Tec,Germany),以限制酵素 HindIII 以及 SpeI 切割，使用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit 將酵素切割過(guò)的DNA片段回收。接著利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述二個(gè)DNA片段黏合后，依照前述“一般實(shí)驗(yàn)方法”，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌株DH5 α中，而得到質(zhì)體pMC-pta。再依據(jù)美國(guó)國(guó)家生物科技信息中心(NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫(kù)pta的核苷酸序列來(lái)合成以下引子:順向引子29:(5， -ACGATGAATTCCATCAGCACATCTTTCTG)反向引子30:(5， -ACCGTGTCGACGGTACCTGATCGCGACTCGTGC)上述順向引子被設(shè)計(jì)含有限制酶EcoRI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)，而反向引子設(shè)計(jì)含有SalI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)。以質(zhì)體pMC-pta做為模板，并以上述兩個(gè)引子進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出一段DNA片段(3.5kb)，以Gel/PCRDNA Fragments ExtractionKit將增幅的基因片段進(jìn)行純化后，用限制酵素EcoRI以及SalI切割，再使用Gel/PCR DNAFragments Extraction Kit將酵素切割過(guò)的DNA片段回收；同時(shí)依據(jù)美國(guó)國(guó)家生物科技信息中心(NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫(kù)中質(zhì)體 pKD13 (Datsenko K.A.and Wanner B.L., 2000, Proc.Natl.Aca.Sc1.USA, 97:6640-6645)的核苷酸序列來(lái)合成以下引子:順向引子25:(5， -TTAGGAATTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC)反向引子26:(5， -ATTCCGGGGATCCGTCGACC)上述順向引子被設(shè)計(jì)含有限制酶EcoRI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)，而反向引子設(shè)計(jì)含有SalI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)。以質(zhì)體PKD13做為模板，并以上述兩個(gè)引子進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出一段包含一個(gè)兩端被FRT位置(sites)鑲夾的抗康納霉素基因片段(1.3kb),以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進(jìn)行純化后，用限制酵素 EcoRI 以及 SalI 切割，再使用 Gel/PCRDNA Fragments Extraction Kit 將酵素切割過(guò)的DNA片段回收；接著利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述二個(gè)DNA片段黏合后，依照前述“一般實(shí)驗(yàn)方法”，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌株DH5 α中，而得到質(zhì)體pMC-ptaKm，質(zhì)體圖譜如圖14所示。圖14.質(zhì)體pMC-ptaKm圖譜。符號(hào)簡(jiǎn)寫說(shuō)明:符號(hào)簡(jiǎn)寫說(shuō)明:Ap,安培西林抗性基因；ColEl origin,大腸桿菌ColEl復(fù)制源點(diǎn)；pta_l, pta基因的N端；pta_2, pta基因的C端；Km，康納霉素抗性基因；FRT，F(xiàn)RT位置。以質(zhì)體pMC-ptaKm做為模板，使用順向引子29和反向引子30進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出一段DNA(1.9kb)，其兩端包含pta基 因N端及C端的同源區(qū)域，而其中間部分則包含一個(gè)兩端被FRT位置(sites)鑲夾的抗康納霉素基因，以Gel/PCR DNA FragmentsExtraction Kit將增幅的基因片段進(jìn)行純化。接著，依照前述的“化學(xué)轉(zhuǎn)形法”，將協(xié)助型質(zhì)體pKD46(Datsenko K.A.and Wanner B.L.,2000,Proc.Natl.Aca.Sc1.USA,97:6640-6645)轉(zhuǎn)形入上述建構(gòu)的菌株BL-Al中，得到菌株BL-Al/pKD46。依照前述的“電穿孔法”，準(zhǔn)備菌株BL-Al/pKD46的勝任細(xì)胞，再利用電穿孔法將上述所得的線性DNA送入菌株BL_Al/pKD46中，隨后以SOC培養(yǎng)基于30°C下培養(yǎng)，同時(shí)加入ImM阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)生產(chǎn)質(zhì)體pKD46上的λ -Red基因，以幫助此增幅出來(lái)的線性DNA與染色體pta基因進(jìn)行同源重組(homologousrecombination)，誘導(dǎo)二小時(shí)后，將培養(yǎng)溫度提升到42°C，經(jīng)二小時(shí)后以離心機(jī)將細(xì)胞離心下來(lái)，移除上清液，將細(xì)胞涂灑在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基上。隨意挑選生長(zhǎng)于固態(tài)培養(yǎng)基的菌落，以順向引子29和反向引子30，使用前述的“原位PCR反應(yīng)”來(lái)確認(rèn)染色體基因pta中所鑲嵌的抗康納霉素基因，挑選出的菌株可增幅出截?cái)嗟膒oxB基因內(nèi)鑲嵌抗康納霉素基因的DNA片段。最后選擇其中一株菌株，根據(jù)前述的“抗抗生素基因移除法”來(lái)移除該菌株染色體上鑲嵌的抗康納霉素基因，經(jīng)溫度誘導(dǎo)協(xié)助型質(zhì)體PCP20產(chǎn)生FLP蛋白質(zhì)，經(jīng)作用于兩個(gè)FRT位置后，將抗康納霉素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株無(wú)法在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌株，同時(shí)以順向引子21和反向引子22，使用前述的“原位PCR反應(yīng)”來(lái)確認(rèn)抗康納霉素基因移除后所殘留的poxB基因片段(圖15徑3)，獲得的菌株重新命名為BL-A2。圖15.DNA電泳圖。 徑1:DNA標(biāo)準(zhǔn)物；徑2:截?cái)嗟膒ta基因內(nèi)鑲嵌一個(gè)抗康納霉素抗性基因；徑3:康納霉素抗性基因移除后殘留的Pta基因片段。5.3根據(jù)EcoCyc基因體數(shù)據(jù)庫(kù)中IdhA基因周遭的核苷酸序列來(lái)合成以下兩個(gè)引子:順向引子31:(5， -TCTTATGAAACTCGCCGTTTATAG)反向引子32:(5， -TTAAACCAGTTCGTTCGGGCAG)使用Wizard Genomic DNA purification kit (Promega C0.)來(lái)純化菌株 CGSC9216 (E.coli Genetic Stock Center, USA)的染色體，以純化后的染色體為DNA模版(template)，使用上述兩個(gè)引子進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出一段DNA(2.8kb)，其兩端包含IdhA基因N端及C端的同源區(qū)域，而其中間部分則包含一個(gè)兩端被FRT位置(sites)鑲夾的抗康納霉素基因，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進(jìn)行純化。接著，依照前述的“化學(xué)轉(zhuǎn)形法”，將協(xié)助型質(zhì)體pKD46 (Datsenko K.A.and Wanner B.L.,2000,Proc.Natl.Aca.Sc1.USA, 97:6640-6645)轉(zhuǎn)形入上述建構(gòu)的菌株 BL-A2 中，得到菌株BL-A2/pKD46。依照前述的“電穿孔法”，準(zhǔn)備菌株BL_A2/pKD46的勝任細(xì)胞，再利用電穿孔法將上述所得的線性DNA送入菌株BL-A2/pKD46中，隨后以SOC培養(yǎng)基于30°C下培養(yǎng)，同時(shí)加入ImM阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)生產(chǎn)質(zhì)體pKD46上的λ -Red基因，以幫助此增幅出來(lái)的線性DNA與染色體IdhA基因進(jìn)行同源重組(homologous recombination),誘導(dǎo)二小時(shí)后,將培養(yǎng)溫度提升到42V，經(jīng)二小時(shí)后以離心機(jī)將細(xì)胞離心下來(lái)，移除上清液，將細(xì)胞涂灑在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基上。隨意挑選生長(zhǎng)于固態(tài)培養(yǎng)基的菌落，完全依照步驟I的做法，以順向引子3和反向引子4，使用前述的“原位PCR反應(yīng)”來(lái)確認(rèn)染色體基因IdhA中所鑲嵌的抗康納霉素基因。最后選擇其中一株菌株，根據(jù)前述的“抗抗生素基因移除法”來(lái)移除該菌株染色體上鑲嵌的抗康納霉素基因，經(jīng)溫度誘導(dǎo)協(xié)助型質(zhì)體PCP20產(chǎn)生FLP蛋白質(zhì)，經(jīng)作用于兩個(gè)FRT位置后，將抗康納霉素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株無(wú)法在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌株，重新命名為BL-A3。5.4根據(jù)EcoCyc基因體數(shù)據(jù)庫(kù)中frdA基因周遭的核苷酸序列來(lái)合成以下兩個(gè)引子:順向引子33:(5， -GAAAGTCGACGAATCCCGCCCAGG)反向引子34:(5’ -CAAGAAAGCTTGTTGATAAGAAAGG)使用Wizard Genomic DNA purification kit (Promega C0.)來(lái)純化菌株 CGSC10964(E.col i Genetic Stock Center, USA)的染色體，以純化后的染色體為DNA模版(template)，使用上述兩個(gè)引子進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出一段DNA (3.0kb)，其兩端包含frdA基因N端及C端的同源區(qū)域，而其中間部分則包含一個(gè)兩端被FRT位置(sites)鑲夾的抗康納霉素基因，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進(jìn)行純化。接著，依照前述的“化學(xué)轉(zhuǎn)形法”，將協(xié)助型質(zhì)體pKD46 (Datsenko K.A.and Wanner B.L.,2000,Proc.Natl.Aca.Sc1.USA, 97:6640-6645)轉(zhuǎn)形入上述建構(gòu)的菌株 BL-A3 中，得到菌株BL-A3/pKD46。依照前述的“電穿孔法”，準(zhǔn)備菌株BL_A3/pKD46的勝任細(xì)胞，再利用電穿孔法將上述所得的線性DNA送入菌株BL-A3/pKD46中，隨后以SOC培養(yǎng)基于30°C下培養(yǎng)，同時(shí)加入ImM阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)生產(chǎn)質(zhì)體pKD46上的λ -Red基因，以幫助此增幅出來(lái)的線性DNA與染色體frdA基因進(jìn)行同源重組(homologous recombination),誘導(dǎo)二小時(shí)后，將培養(yǎng)溫度提升到42V，經(jīng)二小時(shí)后以離心機(jī)將細(xì)胞離心下來(lái)，移除上清液，將細(xì)胞涂灑在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基上。隨意挑選生長(zhǎng)于固態(tài)培養(yǎng)基的菌落，完全依照步驟I的做法，以順向引子3和反向引子4，使用前述的“原位PCR反應(yīng)”來(lái)確認(rèn)染色體基因IdhA中所鑲嵌的抗康納霉素基因。最后選擇其中一株菌株，根據(jù)前述的“抗抗生素基因移除法”來(lái)移除該菌株染色體上鑲嵌的抗康納霉素基因，經(jīng)溫度誘導(dǎo)協(xié)助型質(zhì)體PCP20產(chǎn)生FLP蛋白質(zhì)，經(jīng)作用于兩個(gè)FRT位置后，將抗康納霉素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株無(wú)法在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌株，重新命名為BL-A4。實(shí)施例二:同時(shí)發(fā)酵葡萄糖和木糖生產(chǎn)酒精為了驗(yàn)證本發(fā)明技術(shù)所建構(gòu)的菌株相對(duì)于葡萄糖和木糖同時(shí)發(fā)酵的效能，在此以生產(chǎn)酒精為例，但本發(fā)明技術(shù)的運(yùn)用范圍不以此例為限。根據(jù)前人研究(Ingram LO etal.，1987，Appl.Environ.Microbiol.53:2420-2425)，將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶(Zymomonas mobilis pdc)基因、乙醇脫氫酶基因II (adhll)基因引介至大腸桿菌中，可使得大腸桿菌具有生產(chǎn)酒精的能力。(一)建構(gòu)質(zhì)體pND-pet根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物科技信息中心(NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫(kù)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶(Zymomonas mobilis pdc)基因的核苷酸序列來(lái)合成引子:順向引子35:(5，-TATACATATGAGTTATACTGTCGGTAC)反向引子36:(5，-CCATGGATCCTTATCCTCCTCCGAGGAGCTTG)上述順向引子被設(shè)計(jì)含有限制酶NdeI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)，而反向引子設(shè)計(jì)含有BamHI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)。以運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)的染色體做為模板，并以上述兩個(gè)引子進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出一含有pdc基因的片段(1.7kb),以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進(jìn)行純化后,用限制酵素 NdeI 以及 BamHI 切害I],再使用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit 將酵素切割過(guò)的DNA片段回收；另一方面，根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物科技信息中心(NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫(kù)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的乙醇脫氫酶基因II (Zymomonas mobilis adhll)基因的核苷酸序列來(lái)合成引子:順向引子37:(5，-ATgTGGATCCAggATATAgCTATGGCTTCTTCAACTTTTTATATTC)反向引子38:(5， -AGGACTCGAGTTAGAAAGCGCTCAGGAAGAG)上述順向引子被設(shè)計(jì)含有限制酶BamHI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)，而反向引子設(shè)計(jì)含有XhoI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)。以運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)的染色體做為模板，并以上述兩個(gè)引子進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出一含有乙醇脫氫酶基因 II(adhII 基因)的片段(1.15kb),以 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit 將增幅的基因片段進(jìn)行純化后，用限制酵素BamHI以及XhoI切割，再使用Gel/PCR DNA FragmentsExtraction Kit將酵素切割過(guò)的DNA片段回收；同時(shí)利用High-Speed Plasmid Mini kit純化質(zhì)體 PND707 (Love CA et al.，1996，Gene，176:49-53)，以限制酵素 NdeI 以及 XhoI 切害1J,使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過(guò)的DNA片段回收。接著利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述三個(gè)DNA片段黏合后，依照前述“一般實(shí)驗(yàn)方法”，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌株DH5 α中，而得到質(zhì)體pND-pet,質(zhì)體圖譜如圖16所示。圖16.質(zhì)體pND-pet圖譜。符號(hào)簡(jiǎn)寫說(shuō)明:bla，安培西林抗性基因；CI857，抑制子；lambda PR, Pe 啟動(dòng)子；lambda PL, Pl 啟動(dòng)子。依照前述的“化學(xué)轉(zhuǎn)形法”，將質(zhì)體pND-pet逐一轉(zhuǎn)形入原生型菌株BL21、實(shí)施例一中步驟I建構(gòu)的菌株BL-G、實(shí)施例一中步驟2建構(gòu)的菌株BL-Gf、實(shí)施例一中步驟4建構(gòu)的菌株BL21e-RB、及實(shí)施例一中步驟5.4建構(gòu)的菌株BL-A4中，而依序獲得重組菌株BL21/pND-pet、BL-G/pND-pet、BL-Gf/ND-pet、BL21e-RB/pND-pet>BL_A4/pND_pet。(二)葡萄糖和木糖發(fā)酵生產(chǎn)酒精從固態(tài)培養(yǎng)基中分別選取重組菌株BL21/pND_pet和BL-G/pND-pet單一菌落，各培養(yǎng)于含有安培西林抗生素的LB培養(yǎng)液(5mL)的搖瓶中，以30°C、200rpm培養(yǎng)隔夜后，接種至含有安培西林抗生素的新鮮LB外加3%葡萄糖與3%木糖培養(yǎng)液(25mL)中，使得搖瓶中的初始細(xì)胞密度達(dá)到0D550 = 2.0，接著于37°C、150rpm下進(jìn)行繼代培養(yǎng)，隨著發(fā)酵時(shí)間取樣分析，其中葡萄糖、木糖和酒精濃度則依據(jù)“一般實(shí)驗(yàn)方法”來(lái)測(cè)量。發(fā)酵結(jié)果如圖9 (A)所示，菌株BL21/pND-pet可快速代謝葡萄糖，卻完全無(wú)法消耗木糖，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間結(jié)束后，生產(chǎn)的酒精達(dá)1.7% (圖9(B));相對(duì)的是，當(dāng)大腸桿菌的ptsG基因被剔除時(shí)(即重組菌株BL-G/pND-pet)，菌株BL-G/pND-pet可以同時(shí)消耗葡萄糖及木糖，不過(guò)木糖和葡萄糖的消耗速率皆緩慢(圖17)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間結(jié)束后，則可生產(chǎn)2.2%酒精(圖18)。圖17.重組菌株BL21/pND_pet和BL-G/pND-pet的混合糖消耗曲線。符號(hào):(.)菌株BL21/pND-pet的葡萄糖消耗； (〇)菌株BL21/pND_pet的木糖消耗；(■)菌株BL-G/pND-pet的葡萄糖消耗；(□)菌株BL-G/pND-pet的木糖消耗。圖18.重組菌株BL21/pND_pet和BL-G/pND-pet發(fā)酵混合糖生產(chǎn)酒精曲線。符號(hào):符號(hào):(.)菌株 BL21/pND-pet ；( ■)菌株 BL-G/pND-pet。依照上述的搖瓶培養(yǎng)方法，以含有3%葡萄糖與3%木糖的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)重組菌株BL-Gf/pND-pet和BL21e-RB/pND-pet，并隨著發(fā)酵時(shí)間取樣分析，其中葡萄糖、木糖和酒精濃度則依據(jù)“一般實(shí)驗(yàn)方法”來(lái)測(cè)量。發(fā)酵結(jié)果如圖19所示:圖19.重組菌株BL-Gf/pND-pet和BL21e-RB/pND_pet的混合糖消耗曲線。符號(hào):(.)菌株BL-Gf/pND-pet的葡萄糖消耗；(〇)菌株BL-Gf/pND-pet的木糖消耗；(■)菌株BL21e_RB/pND_pet的葡萄糖消耗；(□)菌株BL21e_RB/pND_pet的木糖消耗。當(dāng)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)的葡萄糖促進(jìn)基因(glucosefacilitator gene) gif引介到大腸桿菌中(即菌株BL-Gf/pND-pet),即可弓耳補(bǔ)菌株缺乏PtsG基因而導(dǎo)致葡萄糖代謝緩慢的問(wèn)題，可于14小時(shí)內(nèi)將3%葡萄糖消耗完畢，而于發(fā)酵時(shí)間結(jié)束后，則只能消耗掉1.8%的木糖，生產(chǎn)的酒精達(dá)2.3% (圖20)。此外，進(jìn)一步加強(qiáng)菌株五碳糖磷酸代謝路徑中的rpiA、tktA、rpe和talB(即菌株BL21e_RB/pND_pet),其葡萄糖的消耗速率大致與菌株BL-Gf/pND-pet相同，然其木糖消耗速率則增快，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間結(jié)束后，可以消耗2.3%的木糖，并能生產(chǎn)2.7%酒精(圖20)。圖20.重組菌株BL21/pND_pet和BL-G/pND-pet發(fā)酵混合糖生產(chǎn)酒精曲線。符號(hào):符號(hào):(.)菌株 BL21/pND-pet ；( ■)菌株 BL-G/pND-pet。最后，依照上述的搖瓶培養(yǎng)方法，以含有3%葡萄糖與3%木糖的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)重組菌株BL-A4/pND-pet，并隨著發(fā)酵時(shí)間取樣分析，其中葡萄糖、木糖和酒精濃度則依據(jù)“一般實(shí)驗(yàn)方法”來(lái)測(cè)量。 發(fā)酵結(jié)果如圖21所示，進(jìn)一步將大腸桿菌中產(chǎn)生其他有機(jī)酸的基因如ldhA、poxB、pta、frdA基因剃除(即菌株BL_A4/pND_pet)后,重組菌株可以十分快速的同時(shí)代謝葡萄糖和木糖，并在12小時(shí)內(nèi)將3%葡萄糖消耗完畢，在17小時(shí)內(nèi)將3%木糖消耗完畢；另如圖22所示，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間結(jié)束后，生產(chǎn)的酒精達(dá)2.9%，轉(zhuǎn)化率高達(dá)98%以上。以生產(chǎn)酒精為例，這個(gè)結(jié)果顯示，基于本發(fā)明技術(shù)來(lái)基因改質(zhì)的菌株(即菌株BL-A4)，具有同時(shí)且快速代謝葡萄糖與木糖的能力。圖21重組菌株BL-A4/pND-pet的混合糖消耗曲線。符號(hào):(.)葡萄糖消耗；(〇)木糖消耗。圖22.重組菌株BL-A4/pND-pet發(fā)酵混合糖生產(chǎn)酒精曲線。實(shí)施例三:同時(shí)發(fā)酵葡萄糖和木糖生產(chǎn)乳酸為了驗(yàn)證本發(fā)明技術(shù)所建構(gòu)的菌株的于葡萄糖和木糖同時(shí)發(fā)酵的效能，在此另以生產(chǎn)乳酸為例，但本發(fā)明技術(shù)的運(yùn)用范圍不局限于此例。(一)建構(gòu)質(zhì)體 pTrc-H/D-Ldh根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物科技信息中心(NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫(kù)大腸桿菌IdhA基因的核苷酸序列來(lái)合成引子:順向引子39:(5， -AGCTCCATGGAACTCGCCGTTTATAGCAC)反向引子40:(5， -AGCGAAGCTTAAACCAGTTCGTTCGGGCAG)
上述順向引子被設(shè)計(jì)含有限制酶NcoI的切割位置(如底線所標(biāo)示者)，而反向引子設(shè)計(jì)含有HindIII的切割位置(如底線所標(biāo)示者)。以大腸桿菌BL21的染色體做為模板，并以上述兩個(gè)引子進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅出一含有IdhA基因的片段(Ikb)，以Gel/PCR DNAFragments Extraction Kit將增幅的基因片段進(jìn)行純化后,用限制酵素NcoI以及HindIII切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過(guò)的DNA片段回收；另一方面，利用 High-Speed Plasmid Mini kit 純化質(zhì)體 pTrc99A (National Instituteof Genetics, Japan),以限制酵素 NcoI 以及 HindIII 切割，使用 Gel/PCR DNA FragmentsExtraction Kit將酵素切割過(guò)的DNA片段回收。接著利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述二個(gè)DNA片段黏合后，依照前述“一般實(shí)驗(yàn)方法”，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌株DH5 α中，而得到質(zhì)體pTrc-H/D-Ldh，質(zhì)體圖譜如圖23所示。接著依照前述的“化學(xué)轉(zhuǎn)形法”，將質(zhì)體pTrc-H/D-Ldh轉(zhuǎn)形入實(shí)施例一中步驟5.4建構(gòu)的菌株BL-A4中，而得到菌株BL-A4/pTrc-H/D-Ldh。圖23.質(zhì)體pTrc-H/D-ldh圖譜。符號(hào)簡(jiǎn)寫說(shuō)明:bla，安培西林抗性基因；ρΜΒ1ori,大腸桿菌pMBl復(fù)制源點(diǎn)；lacIQ,抑制子IacI ；trc promoter, trc啟動(dòng)子。( 二 )葡萄糖和木糖發(fā)酵生產(chǎn)乳酸從固態(tài) 培養(yǎng)基中分別選取重組菌株BL-A4/pTrc-H/D_Ldh單一菌落,培養(yǎng)于含有安培西林抗生素的LB培養(yǎng)液(5mL)的搖瓶中，以37°C、200rpm培養(yǎng)隔夜后，接種至含有安培西林抗生素的新鮮LB外加1%葡萄糖與1%木糖培養(yǎng)液(25mL)中，使得搖瓶中的初始細(xì)胞密度達(dá)到0D550 = 0.1，接著于37°C、150rpm下進(jìn)行繼代培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到0D550 =
0.3時(shí)，加入300“1\1 Isopropyl β -D-l-thiogalactopyranoside (IPTG)誘導(dǎo)質(zhì)體 pTrc-H/D-Ldh的IdhA基因生產(chǎn)，隨著發(fā)酵時(shí)間取樣分析，其中葡萄糖、木糖、乳酸和有機(jī)酸濃度則依據(jù)“一般實(shí)驗(yàn)方法”來(lái)測(cè)量。發(fā)酵結(jié)果如圖24所示，菌株BL-A4/pTrc-H/D-Ldh可同時(shí)代謝葡萄糖和木糖，而生產(chǎn)的乳酸亦隨發(fā)酵時(shí)間逐漸累積增加，當(dāng)發(fā)酵48小時(shí)后，可生產(chǎn)約160mM乳酸，幾乎無(wú)其他有機(jī)酸的生成。以生產(chǎn)乳酸為例，這個(gè)結(jié)果顯示，基于本發(fā)明技術(shù)來(lái)基因改質(zhì)的菌株(即菌株BL-A4)，具有同時(shí)且快速代謝葡萄糖與木糖的能力。圖24.BL-A4/pTrc-H/D-Ldh的混合糖發(fā)酵生產(chǎn)乳酸曲線。符號(hào):(.)葡萄糖消
耗；(▽)木糖消耗；(■)乳酸。
權(quán)利要求
1.一種使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，包含下列步驟: A.剔除一目標(biāo)微生物中的一葡萄糖輸送酶基因序列； B.引入一葡萄糖促進(jìn)基因序列至該目標(biāo)微生物中； C.在該目標(biāo)微生物的至少一五碳糖代謝基因序列上游引入至少一啟動(dòng)子；以及 D.剔除該目標(biāo)微生物中的至少一有機(jī)酸代謝基因序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，步驟A所述的該目標(biāo)微生物可以是一大腸桿菌(Escherichia coli)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，步驟A所述的該葡萄糖輸送酶基因序列可以是一 ptsG基因序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，步驟B所述的該葡萄糖促進(jìn)基因序列可以是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)的gif (glucosefacilitator gene)基因序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，步驟C所述的該至少一五碳糖代謝基因可以是一 rpiA、一 tktA、一 rpe、一 talB、或其組合的基因序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，步驟D所述的該至少一有機(jī)酸代謝基因可以是一 ldhA、一 pta、一 poxB、一 frdA、或其組合的基因序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，步驟B可以是將該葡萄糖促 進(jìn)基因序列鑲嵌入該目標(biāo)微生物的染色體上。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，是該葡萄糖促進(jìn)基因序列植入(incorporate) —個(gè)質(zhì)體中，形成一第一重組型質(zhì)體,再將該第一重組型質(zhì)體轉(zhuǎn)形(transform)至該目標(biāo)微生物中表現(xiàn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，是將該大腸桿菌的該rpiA基因序列植入(incorporate) —個(gè)質(zhì)體中，形成一第二重組型質(zhì)體，再將該第二重組型質(zhì)體轉(zhuǎn)形(transform)至該目標(biāo)微生物中表現(xiàn)。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，是將該大腸桿菌的該tktA基因序列植入(incorporate) —個(gè)質(zhì)體中，形成一第三重組型質(zhì)體，再將該第三重組型質(zhì)體轉(zhuǎn)形(transform)至該目標(biāo)微生物中表現(xiàn)。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，是將該大腸桿菌的該rpe基因序列植入(incorporate) —個(gè)質(zhì)體中，形成一第四重組型質(zhì)體，再將該第四重組型質(zhì)體轉(zhuǎn)形(transform)至該目標(biāo)微生物中表現(xiàn)。
12.根據(jù)權(quán)利要求5所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，是將該大腸桿菌的該talB基因序列植入(incorporate) —個(gè)質(zhì)體中，形成一第五重組型質(zhì)體，再將該第五重組型質(zhì)體轉(zhuǎn)形(transform)至該目標(biāo)微生物中表現(xiàn)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，進(jìn)一步包含以下步驟: E.引入可產(chǎn)生一目標(biāo)產(chǎn)物的基因序列至該目標(biāo)微生物中，使該目標(biāo)微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖以產(chǎn)生該目標(biāo)產(chǎn)物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，該目標(biāo)產(chǎn)物可以是醇類、有機(jī)酸、雙糖、氫氣、酮類、烷類、或其組合。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，步驟C所述的該至少一啟動(dòng)子可以是一 λ PkP1j啟動(dòng)子。
16.一種使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，包含下列步驟: Α.副除一目標(biāo)微生物中的一 ptsG基因序列； B.引入一gif基因序列至該目標(biāo)微生物中； C.在該目標(biāo)微生物的一rpe與一 tktA基因序列上游引入一第一啟動(dòng)子； D.在該目標(biāo)微生物的一rpiA與一 talB基因序列上游引入一第二啟動(dòng)子； E.副除該目標(biāo)微生物中的一IdhA基因序列； F.剔除該目標(biāo)微生物中的一Pta基因序列； G.剔除該目標(biāo)微生物中的一poxB基因序列；以及 H.剔除該目標(biāo)微生物中的一frdA基因序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，該目標(biāo)微生物可以是一大腸桿菌(Escherichia coli)。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，所述的五碳糖可以是木糖，所述的六碳糖可以是葡萄糖。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，步驟C與步驟D所述的該第一啟動(dòng)子與該第二啟動(dòng)子可以為一 λ PePl啟動(dòng)子。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，步驟B中該gif基因序列可以是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)的gif基因序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，可以是將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)的該gif基因序列鑲嵌入該目標(biāo)微生物的染色體上。
22.根據(jù)權(quán)利要求16或21所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，是將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)的該gif基因序列植入(incorporate)一個(gè)質(zhì)體中，形成一第一重組型質(zhì)體，再將該第一重組型質(zhì)體轉(zhuǎn)形(transform)至該目標(biāo)微生物中表現(xiàn)。
23.根據(jù)權(quán)利要求16所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，步驟D是將該大腸桿菌的該rpiA基因序列植入(incorporate) —個(gè)質(zhì)體中，形成一第二重組型質(zhì)體，再將該第二重組型質(zhì)體轉(zhuǎn)形(transform)至該目標(biāo)微生物中表現(xiàn)。
24.根據(jù)權(quán)利要求16所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，步驟C是將該大腸桿菌的該tktA基因序列植入(incorporate) —個(gè)質(zhì)體中，形成一第三重組型質(zhì)體，再將該第三重組型質(zhì)體轉(zhuǎn)形(transform)至該目標(biāo)微生物中表現(xiàn)。
25.根據(jù)權(quán)利要求16所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，步驟C是將該大腸桿菌的該rpe基因序列植入(incorporate) —個(gè)質(zhì)體中，形成一第四重組型質(zhì)體，再將該第四重組型質(zhì)體轉(zhuǎn)形(transform)至該目標(biāo)微生物中表現(xiàn)。
26.根據(jù)權(quán)利要求16所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，步驟D是將該大腸桿菌的該talB基因序列植入(incorporate) —個(gè)質(zhì)體中，形成一第五重組型質(zhì)體，再將該第五重組型質(zhì)體轉(zhuǎn)形(transform)至該目標(biāo)微生物中表現(xiàn)。
27.根據(jù)權(quán)利要求16所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，進(jìn)一步包含以下步驟: 1.引入可產(chǎn)生一目標(biāo)產(chǎn)物的基因序列至該目標(biāo)微生物中，使該目標(biāo)微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖以產(chǎn)生該目標(biāo)產(chǎn)物。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的使微生物可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，步驟I的該目標(biāo)產(chǎn)物可 以是醇類、有機(jī)酸、雙糖、氫氣、酮類、烷類、或其組合。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于一種利用微生物發(fā)酵糖類的方法。本發(fā)明藉由基因工程的方式，針對(duì)目標(biāo)細(xì)菌的糖類代謝相關(guān)路徑進(jìn)行改良，使得目標(biāo)細(xì)菌具備可以同時(shí)快速代謝五碳糖與六碳糖的能力，并且達(dá)到利用單一菌株即可同時(shí)發(fā)酵五碳糖與六碳糖的功能，不僅簡(jiǎn)化發(fā)酵的流程，更可以降低發(fā)酵成本、提升糖類發(fā)酵的效能。
文檔編號(hào)C12P7/40GK103160544SQ201110448728
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者趙云鵬, 姜中人, 李泓旻, 王祉雯, 陳柏庭 申請(qǐng)人:逢甲大學(xué)