專利名稱：一種微藻胞內(nèi)油脂含量的快速測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種油脂含量測定方法，尤其是涉及一種利用RGB三原色原理的微藻胞內(nèi)油脂含量的快速測定方法。
背景技術(shù)：
生物柴油(脂肪酸甲酯)是一種已經(jīng)得到證明的燃料，以其為可再生性的環(huán)保燃料能源而得到世界的廣泛關(guān)注。生物柴油的主要成分是脂肪酸甲酯(FAME)，是以可再生資源(如油菜籽油、大豆油、玉米油、棉籽油、花生油、葵花子油、棕櫚油、椰子油、回收烹飪油、 動物油以及微生物油脂等)為原料而制成，具備與石油柴油相近的性能。生產(chǎn)和使用生物柴油的技術(shù)已經(jīng)存在了 50余年。與石油柴油相比，生物柴油的性能更加優(yōu)良。
面對植物原料生產(chǎn)生物柴油的諸多問題，利用微藻產(chǎn)油具有不與農(nóng)業(yè)爭地的明顯優(yōu)勢，而且可用海水作為天然培養(yǎng)基進行大量繁殖。跟植物一樣，微藻也是利用光照產(chǎn)油， 但卻比植物作物的效率高很多。大多數(shù)微藻的產(chǎn)油量遠遠超過了最好的油料作物。不像其他油料作物，微藻生長極為迅速，而且含有極其豐富的油脂。藻類光合作用轉(zhuǎn)化效率可達 10%以上，含油量達30%。微藻的生物柴油產(chǎn)量是最好的油料作物的8 M倍。
小球藻是屬于綠藻門綠藻目卵囊藻科小球藻屬普生性單細胞綠藻，它是一種球形單細胞淡水藻類，直徑3 8μ m，是地球上最早的生命之一，出現(xiàn)在20多億年前，基因始終沒有變化，是一種高效的光合植物，以光合自養(yǎng)生長繁殖，分布極廣。小球藻的光合作用色素是葉綠素，幾種葉黃素，類胡蘿卜素有胡蘿卜素，可能不含同屬綠藻門的團藻目-紅球藻科-紅球藻屬中的蝦青素。其貯藏的食物主要是淀粉。它是單細胞藻類，常單生，也常有多數(shù)細胞聚于一起；細胞多為球形、橢圓形；每個細胞內(nèi)有1個周生、杯狀或片狀的葉綠體，具有1個蛋白核或缺如，1個細胞核；細胞壁通常很?。幻總€細胞可以產(chǎn)生2、4、8或16 個似親孢子，進行無性繁殖。
1978年，美國能源部可再生能源國家實驗室開始養(yǎng)殖微藻生產(chǎn)生物燃料項目 (AquaticSpices Program,簡稱ASP項目)的研究，研究內(nèi)容從微藻篩選、微藻生化機理分析、工程微藻制備到中試。該項目持續(xù)到1996年，在實驗室研究的基礎(chǔ)上，研究人員在美國加利福尼亞州、夏威夷州、新墨西哥州等地進行了中試放大。中試裝置運行了一年，可獲得高達0.05kg/(m2 · d)的工程微藻，微藻含油量達到40% 60%。1978-1996年累計投入科研經(jīng)費2505萬美元。該研究室是迄今對微藻研究最全面和權(quán)威的機構(gòu)。由于油價上漲，2007年底美國能源部又將這個中斷了 11年之久的項目重新啟動。美國SappHire公司 2008年9月宣布投資1億美元開展養(yǎng)殖海藻生產(chǎn)生物燃料的研究，SappHire公司有兩個引人注目的投資商比爾蓋茨私人名下的一家投資公司(Cascade in-vestments)和為洛克菲勒家族服務(wù)的投資合作商(VenrockPartner)。SappHire公司宣稱通過一種用太陽光、 二氧化碳和光合海藻的工藝研制出了辛烷值達91的“綠色”汽油，而且生產(chǎn)的“綠色”燃料與現(xiàn)有的從煉油廠到加油站的銷售網(wǎng)絡(luò)設(shè)施完全兼容，顯示了微藻汽油與第一代生物乙醇相比的優(yōu)勢所在。美國生物技術(shù)公司Solazyme于2008年7月9日生產(chǎn)出第一批海藻基可再生生物柴油，并已通過美國材料試驗協(xié)會(ASTM)D-975規(guī)格的認證。美國國際能源公司(International Energy)于2007年11月初宣布啟動“海藻變油”研發(fā)計劃，將從基于海藻的光合成來生產(chǎn)可再生柴油和噴氣燃料。美國GreenFuel技術(shù)公司開發(fā)的海藻技術(shù)于 2005年在Arizona的APS電廠完成了中試。選用高生長率的海藻，置于裝有水的大型試管內(nèi)，并曝置于直接的陽光照射下。這項技術(shù)計劃2008年開始商業(yè)化生產(chǎn)。美國Algenol公司2008年7月宣布在美國Maryland投運了世界上最大的海藻庫場，目標是在美國沿海地區(qū)建設(shè)海藻制乙醇工廠。該公司估算可從lacre (約為4046. 9m2) 土地生產(chǎn)6000gal (1 gal =3. 785L)乙醇。按照估計，如果美國所需乙醇全部從海藻制取，則僅需使用谷物制取乙醇需用土地的3%。美國可再生能源集團(REG)于2008年8月21日宣布，該公司已擁有規(guī)?；纳虡I(yè)化技術(shù)，可煉制和生產(chǎn)大量高質(zhì)量的海藻生物柴油，柴油質(zhì)量超過ASTM D6751和 EN 14214M標準。REG公司計劃采用專有預(yù)處理技術(shù)對粗海藻油進行凈化和精制。然后采用與目前商業(yè)規(guī)模生物柴油生產(chǎn)過程相似的系統(tǒng)，使之轉(zhuǎn)化為生物柴油。美國Valencent 產(chǎn)品公司和全球綠色解決方案公司合作開發(fā)的Vertigro工藝正處于工業(yè)應(yīng)用準備階段， 包括海藻生長、海藻收集和萃取海藻油用于生物柴油3個步驟。工藝的核心是連續(xù)閉環(huán)生物反應(yīng)器。在25-30d之后就可收集海藻，海藻的含油量約為50%。Vertigro工藝的生物柴油產(chǎn)量要比用常規(guī)農(nóng)作物生產(chǎn)的生物柴油增加20倍，用水量只有5%。
石油公司也加入了養(yǎng)殖海藻生產(chǎn)生物柴油的研究開發(fā)。Shell公司與美國從事海藻生物燃料業(yè)務(wù)的HR生物石油公司(HR Biopetroleum)于2007年12月組建合資企業(yè) Cellena公司，在夏威夷用面積2. 5hm2的實驗基地作為海藻養(yǎng)殖場，建設(shè)利用海藻生產(chǎn)植物油再轉(zhuǎn)化為生物燃料的中試裝置，進行為期2年的生物柴油生產(chǎn)實驗。Chevron公司也與美國可再生能源國家實驗室、Solazyme公司簽署了協(xié)議，共同開展研究工作。
任何顏色都可以用紅、綠、藍這3種顏色按不同的比例混合而成，這就是三原色原理。三原色的原理可解釋如下(1)自然界的任何顏色都可以由3種顏色按不同的比例混合而成；而每種顏色都可以分解成3種基本顏色；(2)三原色之間是相互獨立的，任何一種顏色都不能由其余的兩種顏色來組成；C3)混合色的飽和度由3種顏色的比例來決定。混合色的亮度為3種顏色的亮度之和。用以上的相加混色三基色所表示的顏色模式稱為RGB 模式，而用相減混色三基色原理所表示的顏色模式稱為CMYK模式，它們廣泛運用于繪畫和印刷領(lǐng)域。RGB是一種依賴于設(shè)備的顏色空間不同設(shè)備對特定RGB值的檢測和重現(xiàn)都不一樣，因為顏色物質(zhì)(熒光劑或者染料)和它們對紅、綠和藍的單獨響應(yīng)水平隨著制造商的不同而不同，甚至是同樣的設(shè)備不同的時間也不同。RGB顏色模型的主要目的是在電子系統(tǒng)中檢測，表示和顯示圖像，比如電視和電腦，但是在傳統(tǒng)攝影中也有應(yīng)用。在電子時代之前， 基于人類對顏色的感知，RGB顏色模型已經(jīng)有了堅實的理論支撐。
近年來，雖然有很多關(guān)于微藻胞內(nèi)油脂含量的測定方法報道，繆曉玲(太陽能學(xué)報，2007，Vol.28, No. 2)報道了先將藻粉于缽體中研磨，然后用正己烷抽提，最后稱重測量油脂含量；胡小文(中國油脂，2011，Vol.36，No. 2)報道了利用尼羅紅染色法熒光光譜檢測微藻中油脂的方法?？偟脕碚f，目前研究中檢測油脂的方法主要分兩種，一種是利用各種手段把油脂分離提取出來稱重；另一種是利用油脂熒光染色的特性，用熒光檢測手段定量檢測油脂含量。但是這兩種手段要么操作起來很麻煩，需要的樣品量很大，要么實驗誤差大， 重復(fù)性不高。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用RGB三原色原理的微藻胞內(nèi)油脂含量的快速測定方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是以小球藻Chlorella vulgaris為出發(fā)藻種，以SE培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻，生長期內(nèi)用自制光箱拍照，并用MATLAB編程分析照片中R、G、B的值，從而建立實測油脂含量與R、G、B平均值的關(guān)系模型，最后可以直接通過拍照讀取R、G、B的值來計算胞內(nèi)油脂的含量。
本發(fā)明采用的藻種為小球藻Chlorella vulgaris，所述小球藻Chlorella vulgaris購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物種保藏委員會淡水藻種庫，藻種編號FACHB_32。
本發(fā)明包括以下步驟
1)制作拍照用光箱；
2)將不同培養(yǎng)時期的藻液，倒在培養(yǎng)皿中，再放置在不透光板中央，然后放入光箱內(nèi)，打開光源，用數(shù)碼相機從箱體的頂面通孔拍照；
3)從小球藻照片上中央位置截取圖像；
4)用MATLAB編寫程序，分析圖像上的R、G、B三種顏色的平均像素值，并繪制像素分布5)建立實測油脂含量與R、G、B三種顏色平均像素值關(guān)系的模型成=aR+bG+cB, 求模型參數(shù)a、b、c;
6)建立模型后，通過拍照截圖，用MATLAB編程讀取RGB值，帶入模型得到小球藻細胞中油脂的含量，單位為mg/g。
在步驟1)中，所述光箱設(shè)有箱體，箱體的底面為敞口，頂面中央設(shè)有通孔，在箱體內(nèi)設(shè)有燈管，所述箱體的棱長可為50cm，所述通孔的直徑可為5cm，箱體內(nèi)壁可為黑色；所述燈管可設(shè)4根白色LED燈管，4根白色LED燈管設(shè)在燈箱內(nèi)的四角。
在步驟2、中，所述培養(yǎng)皿可采用一次性培養(yǎng)皿；所述不透光板可采用白色不透光亞克力板。
在步驟3)中，所述圖像可為IOOX 100像素大小的圖像。
在步驟4)中，所述分析圖像上的R、G、B三種顏色的平均像素值，可分析圖像上 10000個點的R、G、B三種顏色的平均像素值。
本發(fā)明建立的小球藻胞內(nèi)油脂測定方法操作簡單，測定結(jié)果精確，模型計算油脂含量與實際油脂含量線性相關(guān)系數(shù)R2達到0. 9978，而且重復(fù)性好，需要樣品量少?？傊?，與傳統(tǒng)的分析油脂含量的方法相比，具有更簡捷，精確的優(yōu)勢。


圖1為本發(fā)明實施例的光箱結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為本發(fā)明實施例的小球藻圖片R、G、B值分布圖。在圖2中，橫坐標為象素值， 縱坐標為出現(xiàn)次數(shù)；圖中a為藍色，b為紅色，c為綠色。
圖3為RGB模型預(yù)測油脂含量與實際油脂含量線性關(guān)系圖。在圖3中，橫坐標為預(yù)測油脂含量(mg/g)，縱坐標為實際油脂含量(mg/g)；線性相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9978。
具體實施方式
以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。
1)制作拍照用光箱，參見圖1，所述光箱設(shè)有箱體1，箱體1可采用鋁合金制作，呈棱長50cm的正方體框架，箱體1的底面11為敞口，頂面12中央設(shè)有通孔13，在箱體1內(nèi)設(shè)有4根白色LED燈管2，4根白色LED燈管2設(shè)在箱體1內(nèi)的四角，所述通孔13的直徑可為 5cm，箱體1內(nèi)壁可為黑色；箱體1上可設(shè)開關(guān)3。
2)判斷光箱內(nèi)光源分布是否均勻光箱內(nèi)光源分布均與否對建立模型的準確性和重復(fù)性影響極大，判斷光箱內(nèi)光源分布是否均勻可以采用分析光箱所拍照片的RGB均勻度來判斷。從小球藻照片上截取100X 100的像素圖后，用MATLAB編輯的統(tǒng)計RGB值的程序來分析像素圖，然后繪制R、G、B的分布圖，看分布圖中R、G、B的分布是否為單峰狀。如果是單峰狀的，說明所拍小球藻的照片光線分布很均勻，重復(fù)性很好，從而也說明了自制光箱內(nèi)光源分布很均勻，適合用來拍照。如圖2所示即為R、G、B分布很均勻的圖，都是單峰狀的。
3)建模過程對正常生長的小球藻，每次取樣60 70ml，然后搖勻，倒入一次性平板中沒過底部，放在亞克力板的中央位置，蓋上光箱用數(shù)碼相機拍照。
用截圖工具，例如pho to shop、QQ截圖等從所拍小球藻照片上中央位置截取 100X100大小的像素圖。把這個像素圖移動到用MATLAB所編統(tǒng)計像素值的程序所在文件夾，運行程序，輸入截圖名稱，即可得到截圖的10000個點的R、G、B的平均值以及R、G、B值的分布圖。
然后再取50ml樣品，測0D684，然后對照DCW-0D684的標準線性關(guān)系式，計算樣品中小球藻的生物量。然后離心、洗滌、烘干樣品，用索氏萃取法以正己烷為溶劑萃取小球藻中的油脂，通過稱量接受瓶萃取前后的重量差來測定油脂的重量，這樣就可以得到實測油脂占細胞干重的含量mg/g。
間隔時間取8個樣，得到8組數(shù)據(jù)，包括樣品R、G、B的平均值以及實測油脂含量如表1所示。
表1 R、G、B的平均值以及實測油脂含量與模型預(yù)估含量
ρ際油脂含量(mg/g) 預(yù)估油脂含量(mg/g)1190.284202.052202.066313312.62181.039193.991195.308310310.33159.163182.841134.031222222.24158.07187.12126.773320320.55126.568176.38555.366281280.46170.832185.87146.394290289.97151.883184.153106.018297296.78155.69189.081109.826292292.3
然后對8組數(shù)據(jù)用MATLAB進行線性擬合，模型為Y^ = aR+bG+cB，其中R、G、B為表中紅色、綠色、藍色的值，\為表中實測油脂含量。擬合完得到模型參數(shù)值為a = -1. 5379， b = 1.8504，c = 1.6343。所以建立的胞內(nèi)油脂含量與R、G、B平均值的模型為^ =-1. 5379R+1. 8504G+1. 6343B (YL :mg/g DCff)。
模型建立后，就可以簡單快速的只通過取少量藻液，拍照后用MATLAB編的程序讀取R、G、B值，帶入模型方程計算得出小球藻胞內(nèi)油脂含量\。表1中預(yù)估油脂含量為用模型方程計算出來的預(yù)估油脂含量，可見與實際油脂含量差距不大，模型的重復(fù)性很高。
4)驗證模型方程的精確性在小球藻培養(yǎng)的不同時期，取樣用RGB模型分析預(yù)估油脂含量，同時用傳統(tǒng)的稱重法測量實際油脂含量，建立模型預(yù)估含量與實際含量的線性關(guān)系，分析線性度。
如圖3所示為小球藻胞內(nèi)油脂預(yù)測含量與實際含量的線性關(guān)系圖。由圖3中可見， 線性相關(guān)系數(shù)R2值有0. 9978，相關(guān)度非常高，模型方程的重復(fù)性很高，經(jīng)驗證可以用來作為快速測定小球藻胞內(nèi)油脂含量的簡易方法。
權(quán)利要求
1.一種微藻胞內(nèi)油脂含量的快速測定方法，其特征在于包括以下步驟1)制作拍照用光箱；2)將不同培養(yǎng)時期的藻液，倒在培養(yǎng)皿中，再放置在不透光板中央，然后放入光箱內(nèi)， 打開光源，用數(shù)碼相機從箱體的頂面通孔拍照；3)從小球藻照片上中央位置截取圖像；4)用MATLAB編寫程序，分析圖像上的R、G、B三種顏色的平均像素值，并繪制像素分布圖；5)建立實測油脂含量與R、G、B三種顏色平均像素值關(guān)系的模型=aR+bG+cB,求模型參數(shù)a、b、c ；6)建立模型后，通過拍照截圖，用MATLAB編程讀取RGB值，帶入模型得到小球藻細胞中油脂的含量，單位為mg/g。
2.如權(quán)利要求1所述的一種微藻胞內(nèi)油脂含量的快速測定方法，其特征在于在步驟1) 中，所述光箱設(shè)有箱體，箱體的底面為敞口，頂面中央設(shè)有通孔，在箱體內(nèi)設(shè)有燈管，所述箱體的棱長為50cm，所述通孔的直徑為5cm，箱體內(nèi)壁為黑色。
3.如權(quán)利要求2所述的一種微藻胞內(nèi)油脂含量的快速測定方法，其特征在于所述燈管設(shè)4根白色LED燈管，4根白色LED燈管設(shè)在燈箱內(nèi)的四角。
4.如權(quán)利要求1所述的一種微藻胞內(nèi)油脂含量的快速測定方法，其特征在于在步驟2) 中，所述培養(yǎng)皿采用一次性培養(yǎng)皿。
5.如權(quán)利要求1所述的一種微藻胞內(nèi)油脂含量的快速測定方法，其特征在于在步驟2) 中，所述不透光板采用白色不透光亞克力板。
6.如權(quán)利要求1所述的一種微藻胞內(nèi)油脂含量的快速測定方法，其特征在于在步驟3) 中，所述圖像為100X 100像素大小的圖像。
7.如權(quán)利要求1所述的一種微藻胞內(nèi)油脂含量的快速測定方法，其特征在于在步驟4) 中，所述分析圖像上的R、G、B三種顏色的平均像素值，是分析圖像上10000個點的R、G、B 三種顏色的平均像素值。
全文摘要
一種微藻胞內(nèi)油脂含量的快速測定方法，涉及一種油脂含量測定方法。以小球藻Chlorellavulgaris為出發(fā)藻種，以SE培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻，生長期內(nèi)用自制光箱拍照，并用MATLAB編程分析照片中R、G、B的值，從而建立實測油脂含量與R、G、B平均值的關(guān)系模型，最后可以直接通過拍照讀取R、G、B的值來計算胞內(nèi)油脂的含量。操作簡單，測定結(jié)果精確，模型計算油脂含量與實際油脂含量線性相關(guān)系數(shù)R2達到0.9978，而且重復(fù)性好，需要樣品量少?？傊?，與傳統(tǒng)的分析油脂含量的方法相比，具有更簡捷，精確的優(yōu)勢。
文檔編號C12Q1/02GK102517372SQ20111040951
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者凌雪萍, 盧英華, 吳意珣, 敬科舉, 文昌 申請人:廈門大學(xué)