專利名稱：豬假attp位點(diǎn)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及豬假attp位點(diǎn)及其用途。更具體地，本發(fā)明涉及一種分離的可被OC31整合酶識(shí)別的寡核苷酸，一種適于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的載體，一組適于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的載體，一種轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞或其培養(yǎng)物，一種制備轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞的方法，以及一種確定豬基因組中假attp位點(diǎn)序列。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)大部分基于隨機(jī)整合，一方面整合效率低，且為隨機(jī)整合， 位點(diǎn)不可預(yù)測(cè)；另一方面遺傳不穩(wěn)定，容易導(dǎo)致傳代丟失，不利于培育穩(wěn)定的品系；最后， 轉(zhuǎn)基因在宿主基因組中的隨機(jī)插入可能導(dǎo)致內(nèi)源基因的破壞或失活，也可能激活某些正常狀態(tài)下關(guān)閉的基因，容易引起動(dòng)物異常。這些都極大影響轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用。目前的動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)仍有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種能夠有效地在豬細(xì)胞中引入外源基因的手段。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的可被Φ031整合酶識(shí)別的寡核苷酸，其特征在于，其包含如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。由此，本發(fā)明提出了一種豬假attp位點(diǎn)，其能夠有效地在C5C31整合酶的介導(dǎo)下，在豬細(xì)胞中引入外源基因。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種適于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的載體，其特征在于， 包括第一核酸序列，所述第一核酸序列適于在OC31整合酶的介導(dǎo)下與SEQ ID NO 2或 SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列發(fā)生重組；以及目的基因。由此，利用該載體，能夠在Φ〇31 整合酶的介導(dǎo)下通過(guò)與豬假attp位點(diǎn)的重組，將目的基因有效地引入到豬細(xì)胞中。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一組適于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的載體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該一組適于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的載體包括第一載體，所述第一載體包括第一核酸序列，所述第一核酸序列適于在OC31整合酶的介導(dǎo)下與SEQ ID NO 2 或SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列發(fā)生重組；以及目的基因，第二載體，所述第二載體包括編碼Φ031整合酶或其功能等同體的核酸序列。利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的一組適于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的載體，能夠有效地實(shí)現(xiàn)將目的基因引入到豬細(xì)胞中。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明一種轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞或其培養(yǎng)物，其特征在于，在所述轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞的1號(hào)染色體上包含表達(dá)外源基因的核酸序列，所述核酸序列插入所述1 號(hào)染色體的假attp位點(diǎn)中。由此，可以有效地利用豬細(xì)胞或其培養(yǎng)物，表達(dá)外源基因，并且不會(huì)影響豬細(xì)胞的正常生理活動(dòng)。
根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種制備前述轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞的方法，其特征在于，包括下列使用前面所述的一組適于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的載體轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞，以便獲得轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞；以及分離轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞。利用該方法，能夠有效地獲得在1號(hào)染色體上包含外源基因的轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了一種確定豬基因組中假attp位點(diǎn)序列的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括下列步驟根據(jù)前面所述的方法制備轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞；分離所述轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞的基因組DNA ；使用限制性內(nèi)切酶對(duì)所述基因組DNA進(jìn)行酶切消化，以便獲得具有粘性末端的DNA片段；將所述DNA片段與相應(yīng)的接頭相連，以便獲得連接產(chǎn)物；使用第一 PCR引物組，對(duì)所述連接產(chǎn)物進(jìn)行第一 PCR擴(kuò)增，以便獲得第一擴(kuò)增產(chǎn)物； 使用第二 PCR引物組，對(duì)所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二 PCR擴(kuò)增，以便獲得第二擴(kuò)增產(chǎn)物；對(duì)所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以便獲得測(cè)序結(jié)果，其中，所述測(cè)序結(jié)果中包含所述假attp 位點(diǎn)的部分序列；基于所述測(cè)序結(jié)果，確定所述假attp位點(diǎn)的序列。利用該方法，能夠有效地確定豬基因組中假attp位點(diǎn)的序列。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。


本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，確定豬基因組中假attp位點(diǎn)序列的方法的流程示意圖；圖2是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，Splinkerette PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳照片，其中圖2A是Splinkerette PCR第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，圖2B是Splinkerette PCR第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。
具體實(shí)施例方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。如果沒(méi)有特別說(shuō)明，在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)均是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的含義。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)“第一”、“第二”僅僅是為了方便區(qū)分不同的成分，而不能以任何方式理解為重要性或其他方面的區(qū)別。1、豬假attp位點(diǎn)根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，提出了一種分離的寡核苷酸，其包含核苷酸序列CAACCCCACAGGTGCTGGTGCTCTTCCAGAGGGGGAAGA(SEQ ID NO :3)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該分離的寡核苷酸能夠被鏈霉菌噬菌體Φ031(在本文中也稱為“噬菌體Φ031”)整合酶識(shí)別，從而可以作為假attp位點(diǎn)的核心區(qū)，介導(dǎo)將外源DNA有效地整合到豬基因組中，有效地實(shí)現(xiàn)在豬細(xì)胞中持續(xù)、高效地表達(dá)外源基因。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在上述作為attp核心區(qū)的寡核苷酸序列的兩側(cè)，還可以進(jìn)一步包括側(cè)翼區(qū)，即根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的可以作為假attp位點(diǎn)的分離的寡核苷酸可以具有下列核苷酸序列CCAAAATGATCAGTGTGGTCCTTTGTGTTCAAAAGGTGAGGGACTCCTCACAAGAACTTATTCCCGATC CAAATACAGAGAGGTTGGAGGAGGGGCGGTGTAGAACTCAGGGCTTTTGACTCCTCCGCAAAAGCCTCTCACCAAAA AAAGAGGGTGTTAATTTGTCCTTCCATTCAACAAACAGTGACTGAGTGCTTATTAGAGGTCCAATGAGTAGAAAATG GGAGACACAGGGACTCACAGCTGAGCAGGAAGACAGCCACATCGCTCAACAGAAAGTGACTCAGGTGAGCAACCCCA CAGGTGCTGGTGCTCTTCCAGAGGGGGAAGAGGGTTTGGGGGGGAACCTCATAAACCTTACAGTTCTTGCTTTTATG GACTATTTATTTAATGCCTATGTGTTATACTTACAAAATGTGCTTACTTTATGTTTATTTGTGTCTTTCAACTTAGG GTATTAAATTTCTCTACAATCAGCCCTTTCACTACTTTCAAACCTCTTACACCACAGCATCATTTCCCCTAGCTTGA CGGTACTCAAGAAATATTTCTTTGATAATAATGACAGGTGGTTTGTACTTTTTCCACTTAGATGACAATCTCATCAT AAATCCCTATTGGATTTCATTTCG(SEQ ID NO 2)其中，下劃線部分中所標(biāo)出的序列是attp核心區(qū)的核苷酸序列，即SEQ ID NO :3。 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，借助該寡核苷酸序列，能夠更有效地介導(dǎo)將外源DNA有效地整合到豬基因組中，有效地實(shí)現(xiàn)在豬細(xì)胞中持續(xù)、高效地表達(dá)外源基因。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)借助該寡核苷酸和噬菌體φ031整合酶，能夠?qū)⑼庠碊NA整合到豬基因組第1號(hào)染色體的特定位點(diǎn)中，并且驚奇地發(fā)現(xiàn)，在將外源DNA引入到該特定位點(diǎn)后，對(duì)于豬基因組中的其他基因表達(dá)并不會(huì)造成不利的影響，從而不會(huì)影響豬細(xì)胞的正常生理活動(dòng)，便于對(duì)豬進(jìn)行遺傳改造，進(jìn)行相關(guān)的研究。2、適于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的載體在分離豬基因組的attp位點(diǎn)之后，發(fā)明人提出了一種適于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的載體。利用該載體，能夠借助豬基因組的attp位點(diǎn)以及噬菌體Φ031整合酶，有效地將外源DNA即目的基因，引入到豬細(xì)胞中，并且有效地實(shí)現(xiàn)將外源DNA與豬基因組的整合。需要說(shuō)明的是，在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”與“轉(zhuǎn)染”是可以互換使用的，均是指將外源核酸序列引入宿主細(xì)胞中的操作。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，適于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的載體包括第一核酸序列和目的基因。該第一核酸序列適于在OC31整合酶的介導(dǎo)下與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列發(fā)生重組。由此，利用該載體，能夠在OC31整合酶的介導(dǎo)下通過(guò)與豬假attp位點(diǎn)發(fā)生重組，從而，可以有效地將目的基因引入到豬細(xì)胞中。在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“載體”應(yīng)作廣義理解，其可以是任何能夠?qū)⒑怂嵝蛄幸胴i細(xì)胞內(nèi)的媒介，包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、病毒、人工染色體，既可以是環(huán)形的載體，也可以是線狀的，既可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選的載體類型是質(zhì)粒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第一核酸序列的具體序列并不受特別限制，只要其能夠在 Φ〇31整合酶的介導(dǎo)下與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示的序列發(fā)生重組即可。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述第一核酸序列包括如SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，SEQ ID NO :4所示的序列，能夠有效地與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列發(fā)生重組。由此，可以有效地提高第一核酸序列與豬假attp位點(diǎn)發(fā)生重組的效率，從而提高將目的基因引入到豬細(xì)胞中的效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該載體還可以進(jìn)一步包括附加元件，從而可以獲得，以賦予其附加的功能和效果。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，該實(shí)施例可以進(jìn)一步包括編碼篩選標(biāo)記的核酸序列。 由此，可以有效地篩選轉(zhuǎn)入該載體的豬細(xì)胞，由此，可以提高制備轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的效率。根據(jù)本發(fā)明的示例，篩選標(biāo)記的類型并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些示例，篩選標(biāo)記可以為選自編碼發(fā)光蛋白的基因、藥物抗性基因的至少一種。由此，可以非常容易地篩選已經(jīng)引入載體的豬細(xì)胞，例如通過(guò)檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度和在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的藥物。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，發(fā)光蛋白可以為選自GFP和EGFP的至少一種。由此，可以通過(guò)檢測(cè)所發(fā)出的綠色熒光，來(lái)篩選和驗(yàn)證載體已經(jīng)成功地被引入到豬細(xì)胞中。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，所述藥物抗性基因?yàn)檫x自新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一種。由此，可以通過(guò)在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的抗生素，在培養(yǎng)后存活下來(lái)的細(xì)胞即為含有載體的豬細(xì)胞。由此，可以方便地進(jìn)行轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選，進(jìn)一步提高制備轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的效率。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，該載體可以進(jìn)一步包含啟動(dòng)子，啟動(dòng)子可以與目的基因可操作地連接。這里所使用的術(shù)語(yǔ)“連接”應(yīng)作廣義理解，可以為直接相連，也可以為通過(guò)媒介間接相連?！翱刹僮鞯倪B接”的意思是指，啟動(dòng)子能夠發(fā)揮其正常生物學(xué)功能，從而影響目的基因的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的啟動(dòng)子的類型不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些示例，所述啟動(dòng)子可以為真核細(xì)胞啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，更優(yōu)選所述真核細(xì)胞啟動(dòng)子為選自CAG啟動(dòng)子和PGK啟動(dòng)子的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體示例，最優(yōu)選所述真核細(xì)胞啟動(dòng)子為CAG啟動(dòng)子。由此，可以提高目的基因在豬細(xì)胞中的表達(dá)效率。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用CAG啟動(dòng)子時(shí)，能夠顯著地提高目的基因在豬細(xì)胞中的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施例，所述真核細(xì)胞啟動(dòng)子為組織特異性啟動(dòng)子。由此，可以根據(jù)豬細(xì)胞的類型，選擇適當(dāng)?shù)膯?dòng)子，從而獲得能夠?qū)崿F(xiàn)目的基因的組織特異性表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，該載體可以進(jìn)一步包含內(nèi)含子(Intron)序列，其中， 內(nèi)含子htron序列與目的基因可操作地連接。由此，可以進(jìn)一步提高目的基因在豬細(xì)胞中的表達(dá)效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，內(nèi)含子的類型不受特別限制。3、一組適于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的載體為了能夠提高轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞，表達(dá)目的基因的效率，本發(fā)明還提出了一組適于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的載體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該一組適于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的載體包括第一載體和第二載體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第一載體包括第一核酸序列，所述第一核酸序列適于在 Φ〇31整合酶的介導(dǎo)下與SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列發(fā)生重組；以及目的基因。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第二載體包括編碼OC31整合酶或其功能等同體的核酸序列。由此，在將第一載體和第二載體都引入到豬細(xì)胞后，第二載體能夠在細(xì)胞中表達(dá)OC31整合酶或其功能等同體，從而可以介導(dǎo)第一載體中所包含的第一核酸序列與豬基因組的假attp位點(diǎn)發(fā)生重組，從而將第一載體所攜帶的目的基因引入到豬細(xì)胞中，并且與豬基因組發(fā)生整合，實(shí)現(xiàn)在豬細(xì)胞基因組中的特定位點(diǎn)引入外源DNA即目的基因。在本文中所使用的“功能等同體” 指的是能夠與OC31整合酶發(fā)揮類似的功能，介導(dǎo)目的第一核酸序列與豬基因組假attp位點(diǎn)(在本文中，有時(shí)也將豬基因組假attp位點(diǎn)簡(jiǎn)稱為“豬假attp位點(diǎn)”)重組的蛋白質(zhì)。下面對(duì)第一載體和第二載體進(jìn)行詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第一核酸序列的具體序列并不受特別限制，只要其能夠在 Φ〇31整合酶的介導(dǎo)下與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示的序列發(fā)生重組即可。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述第一核酸序列包括如SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，SEQ ID NO :4所示的序列，能夠有效地與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列發(fā)生重組。由此，可以有效地提高第一核酸序列與豬假attp位點(diǎn)發(fā)生重組的效率，從而提高將目的基因引入到豬細(xì)胞中的效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，編碼Φ031整合酶或其功能等同體的核酸序列的具體序列并不受特別限制，只要其編碼產(chǎn)物能夠介導(dǎo)第一核酸序列與豬假attp位點(diǎn)發(fā)生重組即可。 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述第二載體包括如SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這可以顯著提高將目的基因引入豬基因組中的效率。為了便于利用這些載體轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞，第一載體和第二載體還可以分別具有其他的元件，以賦予其附加的功能和效果。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述第一載體進(jìn)一步包括編碼第一篩選標(biāo)記的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述篩選標(biāo)記為選自編碼發(fā)光蛋白的基因、藥物抗性基因的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，所述發(fā)光蛋白為選自GFP和EGFP的至少一種，所述藥物抗性基因?yàn)檫x自新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述第二載體進(jìn)一步包括編碼第二篩選標(biāo)記的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第二篩選標(biāo)記為選自編碼發(fā)光蛋白的基因、藥物抗性基因的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，所述發(fā)光蛋白為選自GFP和EGFP的至少一種，所述藥物抗性基因?yàn)檫x自新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一種。關(guān)于篩選標(biāo)記的效果，在前面已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì)描述，不再贅述。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第一篩選標(biāo)記可以與第二篩選標(biāo)記不同。由此，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)同時(shí)接受第一載體和第二載體的有效檢驗(yàn)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，第一載體可以進(jìn)一步包括第一啟動(dòng)子。該第一啟動(dòng)子與目的基因可操作地連接。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第一啟動(dòng)子可以為真核細(xì)胞啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的一些示例，真核細(xì)胞啟動(dòng)子可以為CAG啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，真核細(xì)胞啟動(dòng)子可以為組織特異性啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，第一載體可以進(jìn)一步包括第一增強(qiáng)子序列，所述第一增強(qiáng)子序列與所述目的基因可操作地連接。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，第二載體可以進(jìn)一步包括第二啟動(dòng)子。該第二啟動(dòng)子與編碼OC31整合酶或其功能等同體的核酸序列可操作地連接。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第二啟動(dòng)子可以為真核細(xì)胞啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的一些示例，真核細(xì)胞啟動(dòng)子為CAG啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，真核細(xì)胞啟動(dòng)子為組織特異性啟動(dòng)子。由此，可以有效地提高OC31整合酶或其功能等同體在豬細(xì)胞中的表達(dá)效率，從而進(jìn)一步提高將目的基因引入豬基因組中的效率。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，第二載體可以進(jìn)一步包括第二增強(qiáng)子序列。該第二增強(qiáng)子序列與所述目的基因可操作地連接。由此，可以進(jìn)一步提高OC31整合酶或其功能等同體在豬細(xì)胞中的表達(dá)效率，從而進(jìn)一步提高將目的基因引入豬基因組中的效率。關(guān)于啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，前面已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì)描述，不再贅述。4、轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞或其培養(yǎng)物及其制備方法根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明提出了一種轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞或其培養(yǎng)物，其特征在于， 在所述轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞的1號(hào)染色體上包含表達(dá)外源基因的核酸序列，所述核酸序列插入所述1號(hào)染色體的假attp位點(diǎn)中。由此，可以有效地利用豬細(xì)胞或其培養(yǎng)物，表達(dá)外源基因， 并且不會(huì)影響豬細(xì)胞的正常生理活動(dòng)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，豬1號(hào)染色體的假attp位點(diǎn)具有如SEQ ID NO :3所示的寡核苷酸序列作為核心區(qū)。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，該轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞是通過(guò)借助豬基因組假attp位點(diǎn)和噬菌體Φ031整合酶，將外源DNA整合到豬基因組第1號(hào)染色體的特定位點(diǎn)中即假attp位點(diǎn)而獲得的，并且驚奇地發(fā)現(xiàn)，在將外源DNA 引入到該特定位點(diǎn)后，對(duì)于豬基因組中的其他基因表達(dá)并不會(huì)造成不利的影響，從而不會(huì)影響豬細(xì)胞的正常生理活動(dòng)，便于對(duì)豬進(jìn)行遺傳改造，進(jìn)行相關(guān)的研究。在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)物”應(yīng)做廣義理解，其可以是指將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在適于存活的狀態(tài)下維持一定時(shí)間后所得到的產(chǎn)物，期間也可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，例如培養(yǎng)物可以是將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后所得到的產(chǎn)物，也可以是通過(guò)手工克隆方法得到的轉(zhuǎn)基因豬，也可以是從該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分化或者去分化得到的細(xì)胞、組織、器官或者個(gè)體。另外，根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種制備前述轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞的方法包括下列使用前面所述的一組適于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的載體轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞，以便獲得轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞；以及分離轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞。關(guān)于所述的一組適于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的載體，即前面所述的第一載體和第二載體，在前面已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì)描述，不再贅述。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用該方法，能夠有效地獲得在1號(hào)染色體上包含外源基因的轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞。并且驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)該方法，將外源DNA引入到豬基因組的1號(hào)染色體后，對(duì)于豬基因組中的其他基因表達(dá)并不會(huì)造成不利的影響，從而不會(huì)影響豬細(xì)胞的正常生理活動(dòng)，便于對(duì)豬進(jìn)行遺傳改造，進(jìn)行相關(guān)的研究。在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”與“轉(zhuǎn)染”是可以互換使用的，均是指將外源核酸序列引入宿主細(xì)胞中的操作。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第一載體和第二載體被引入到細(xì)胞中的順序不受特別限制，可以是同時(shí)被引入到細(xì)胞中，也可以是依次引入到細(xì)胞中，既可以先引入第一載體，也可以先引入第二載體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用第一載體和第二載體共轉(zhuǎn)化所述豬細(xì)胞。即同時(shí)將第一載體和第二載體引入到豬細(xì)胞中。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，實(shí)現(xiàn)利用第一載體和第二載體共轉(zhuǎn)化的方法并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，可以通過(guò)脂質(zhì)體法進(jìn)行所述共轉(zhuǎn)化。由此，可以提高轉(zhuǎn)化利用第一載體和第二載體轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的效率。另外，用于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的第一載體和第二載體的量的比例并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第一載體與第二載體的質(zhì)量比為1 1 5，優(yōu)選1 1。由此，可以實(shí)現(xiàn)較高的共轉(zhuǎn)化效率，并且能夠進(jìn)一步提高將目的基因整合到豬基因組第1號(hào)染色體上， 從而實(shí)現(xiàn)目的基因在豬細(xì)胞中的穩(wěn)定持續(xù)的表達(dá)。5、確定豬基因組中假attp位點(diǎn)序列的方法根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種確定豬基因組中假attp位點(diǎn)序列的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，參考圖1，該方法包括下列步驟SlOO 根據(jù)前面所述的方法制備轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞，即通過(guò)將包含能夠與attp位點(diǎn)重組的核酸序列的載體，以及包含編碼噬菌體6C31整合酶的核苷酸的載體共轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞， 得到轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞，關(guān)于如何利用兩種載體轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞，前面已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì)描述，不再贅述。S200 在得到轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞之后，從轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞中分離轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞的基因組 DNA0根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，從細(xì)胞中分離基因組DNA的方法，并不受特別限制，可以使用商業(yè)化的試劑盒進(jìn)行基因組DNA的提取。S300:在分離轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞的基因組DNA后，使用限制性內(nèi)切酶對(duì)所得到的基因組DNA進(jìn)行酶切消化，以便獲得具有粘性末端的DNA片段。通過(guò)利用限制性內(nèi)切酶對(duì)所得到的基因組DNA進(jìn)行酶切消化，可以將基因組DNA進(jìn)行片段化，從而可以得到包含發(fā)生重組的片段。并且在所得到的DNA片段的末端具有限制性內(nèi)切酶酶切處理所形成的粘性末端。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，用于進(jìn)行酶切處理的限制性內(nèi)切酶的類型和數(shù)量并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述限制性內(nèi)切酶為BamH I和Bgl II的組合。由此，可以有效地從豬基因組中分離出含有attp位點(diǎn)的片段，另外，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用BamH I和Bgl II的組合進(jìn)行酶切消化時(shí)，所得到的DNA片段的長(zhǎng)度適于后續(xù)的操作，不會(huì)過(guò)長(zhǎng)或者過(guò)短而無(wú)法進(jìn)行分析。S400 在獲得DNA片段后，可以將所得到的DNA片段與相應(yīng)的接頭相連，以便獲得連接產(chǎn)物。由于在使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切消化之后，所得到的DNA片段，其具有粘性末端，因而可以通過(guò)使用具有與粘性末端相應(yīng)的接頭與該DNA片段進(jìn)行連接。這里所使用的術(shù)語(yǔ)“相應(yīng)的接頭”指的是該接頭具有與DNA片段的粘性末端相匹配的突出端，從而，可以利用常規(guī)的手段，將該接頭與所得到的DNA片段進(jìn)行連接，以便于后續(xù)的操作。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，接頭的序列并不受特別限制，可以根據(jù)限制性內(nèi)切酶消化處理所形成的粘性末端來(lái)選擇相應(yīng)的接頭。例如，當(dāng)采用BamH I和Bgl II的組合進(jìn)行酶切消化時(shí)，可以采用這樣的一種接頭。該接頭由第一寡核苷酸鏈和第二寡核苷酸鏈構(gòu)成，其中，第一寡核苷酸鏈具有如SEQ ID NO :6所示的寡核苷酸序列，第二寡核苷酸鏈具有如SEQ ID NO :7所示的寡核苷酸序列。由此，可以進(jìn)一步提高接頭與DNA片段的連接效率，從而進(jìn)一步提高確定假attp 位點(diǎn)序列的效率。該接頭，可以通過(guò)分別合成第一寡核苷酸鏈和第二寡核苷酸鏈之后，進(jìn)行退火處理，而形成。S500:在獲得連接產(chǎn)物后，通過(guò)使用第一 PCR引物組，對(duì)所述連接產(chǎn)物進(jìn)行第一 PCR擴(kuò)增，以便獲得第一擴(kuò)增產(chǎn)物。其中，第一PCR引物組包括第一引物和第二引物，所述第一引物特異性識(shí)別接頭，所述第二引物特異性識(shí)別第一核酸序列。由此，可以有效地獲得含有部分假attp序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，當(dāng)采用由SEQ ID NO :6和7所示的寡核苷酸序列構(gòu)成的接頭，并且采用包括如SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列的第一核酸序列時(shí)，所述第一引物具有如SEQ ID NO :8所示的核苷酸序列；以及所述第二引物具有如 SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用該組PCR引物，可以更有效地對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。S600 在進(jìn)行第一PCR擴(kuò)增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物之后，使用第二PCR引物組，對(duì)所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二 PCR擴(kuò)增，以便獲得第二擴(kuò)增產(chǎn)物，其中，第二 PCR引物組包括第三引物和第四引物，所述第三引物特異性識(shí)別接頭，所述第四引物特異性識(shí)別所述第一核酸序列。由此，可以進(jìn)一步提高PCR擴(kuò)增的特異性。當(dāng)，所述第一引物具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列；以及所述第二引物具有如SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列時(shí)，優(yōu)選所述第三引物具有如SEQ ID NO :10所示的核苷酸序列；所述第四引物具有如SEQ ID N0:11所示的核苷酸序列。S700 在得到第二擴(kuò)增產(chǎn)物之后，對(duì)第二擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以便獲得測(cè)序結(jié)果。 由于第二擴(kuò)增產(chǎn)物中包含豬基因組假attp位點(diǎn)的部分序列，因而測(cè)序結(jié)果中包含所述假 attp位點(diǎn)的部分序列。對(duì)于擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序的方法，并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以通過(guò)將擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒連接，并通過(guò)質(zhì)粒的測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。由此，可以方便快捷地獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的序列信息。
S800:由于測(cè)序結(jié)果中包含所述假attp位點(diǎn)的部分序列。因而，最后可以基于該測(cè)序結(jié)果，確定假attp位點(diǎn)的序列。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在獲得測(cè)序結(jié)果后，確定假 attp位點(diǎn)的序列可以進(jìn)一步包括首先基于所述測(cè)序結(jié)果，確定假attp位點(diǎn)在豬基因組中的位置。例如可以將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST檢索，定位假attp位點(diǎn)在豬基因組的第幾號(hào)染色體的大致區(qū)域。接下來(lái)，基于噬菌體attp位點(diǎn)序列(SEQ ID NO 12 :ACTGACGGACACACCG AAGCCCCGGCGGCAACCCTCAGCGGATGCCCCGGGGCTTCACGTTTTCCCAGGTCAGAAGCGGTTTTCGGGAGTAGT G CCCCAACTGGGGTAACCTTT GAGTTCTCTCAGTTGGGGG CGTAGGGTCGCCGACATG ACACAAGGGGTTGTGACCGGGGTGGACACGTACGCGGGTGCTTACGACCGTCAGTCGCGCGAGCGCGA (黑線部分為核心序列))以及所述假attp位點(diǎn)在豬基因組中的位置，確定所述假attp位點(diǎn)的序列。 例如可以將噬菌體attp位點(diǎn)序列與之前所確定的假attp位點(diǎn)的大致區(qū)域的序列進(jìn)行比對(duì)，從而可以進(jìn)一步提高確定假attp位點(diǎn)序列的效率。確定所述假attp位點(diǎn)的序列。由此，可以進(jìn)一步提高確定假attp位點(diǎn)序列的效率。下面參考具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，需要說(shuō)明的是，這些實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。若未特別指明，實(shí)施例中所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版或者相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行，所采用的試劑和產(chǎn)品也均為可商業(yè)獲得的。實(shí)施例1、含鏈霉菌噬菌體Φ031整合酶基因的pCMV-Int載體的構(gòu)建(1)合成鏈霉菌噬菌體Φ031整合酶基因(Int基因)將SEQ ID NO 5所示的序列，提交上海捷瑞生物科技有限公司進(jìn)行Int基因合成，將所合成的Int基因構(gòu)建在pGH載體上，獲取pGH-Int質(zhì)粒。(2)酶切pGH-Int質(zhì)粒取pGH_Int質(zhì)粒20微升G00_500ng/ul)進(jìn)行酶切，酶切體系為
權(quán)利要求
1.一種分離的可被OC31整合酶識(shí)別的寡核苷酸，其特征在于，其包含如SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，其包含如SEQID NO :2所示的核苷酸序列。
3.—種適于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的載體，其特征在于，包括第一核酸序列，所述第一核酸序列適于在OC31整合酶的介導(dǎo)下與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列發(fā)生重組；以及目的基因，任選地，所述第一核酸序列包括如SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列， 任選地，進(jìn)一步包括編碼篩選標(biāo)記的核酸序列，所述篩選標(biāo)記優(yōu)選為選自編碼發(fā)光蛋白的基因、藥物抗性基因的至少一種，所述發(fā)光蛋白優(yōu)選為選自GFP和EGFP的至少一種，所述藥物抗性基因優(yōu)選為選自新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一種，任選地，進(jìn)一步包括啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子與所述目的基因可操作地連接，所述啟動(dòng)子優(yōu)選為真核細(xì)胞啟動(dòng)子，所述真核細(xì)胞啟動(dòng)子優(yōu)選為CAG啟動(dòng)子，可選地所述真核細(xì)胞啟動(dòng)子為組織特異性啟動(dòng)子，任選地，進(jìn)一步包括增強(qiáng)子序列，所述增強(qiáng)子序列與所述目的基因可操作地連接。
4.一組適于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的載體，其特征在于，包括 第一載體，所述第一載體包括第一核酸序列，所述第一核酸序列適于在OC31整合酶的介導(dǎo)下與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列發(fā)生重組；以及目的基因，第二載體，所述第二載體包括編碼OC31整合酶或其功能等同體的核酸序列， 任選地，所述第一核酸序列包括如SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列， 任選地，所述第一載體進(jìn)一步包括編碼第一篩選標(biāo)記的核酸序列，所述篩選標(biāo)記優(yōu)選為選自編碼發(fā)光蛋白的基因、藥物抗性基因的至少一種，所述發(fā)光蛋白優(yōu)選為選自GFP和 EGFP的至少一種，所述藥物抗性基因優(yōu)選為選自新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一種；任選地，所述第二載體進(jìn)一步包括編碼第二篩選標(biāo)記的核酸序列，所述第二篩選標(biāo)記優(yōu)選為選自編碼發(fā)光蛋白的基因、藥物抗性基因的至少一種，所述發(fā)光蛋白優(yōu)選為選自GFP 和EGFP的至少一種，所述藥物抗性基因優(yōu)選為選自新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一種，任選地，所述第一篩選標(biāo)記與所述第二篩選標(biāo)記不同，任選地，所述第一載體進(jìn)一步包括第一啟動(dòng)子，所述第一啟動(dòng)子與所述目的基因可操作地連接，所述第一啟動(dòng)子優(yōu)選為真核細(xì)胞啟動(dòng)子，所述真核細(xì)胞啟動(dòng)子優(yōu)選為CAG啟動(dòng)子，可選地所述真核細(xì)胞啟動(dòng)子為組織特異性啟動(dòng)子，任選地，所述第一載體進(jìn)一步包括第一增強(qiáng)子序列，所述第一增強(qiáng)子序列與所述目的基因可操作地連接，任選地，所述第二載體包括如SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列， 任選地，所述第二載體進(jìn)一步包括第二啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子與所述編碼OC31整合酶或其功能等同體的核酸序列可操作地連接，所述第二啟動(dòng)子優(yōu)選為真核細(xì)胞啟動(dòng)子， 所述真核細(xì)胞啟動(dòng)子優(yōu)選為CAG啟動(dòng)子，可選地所述真核細(xì)胞啟動(dòng)子為組織特異性啟動(dòng)子，任選地，所述第二載體進(jìn)一步包括第二增強(qiáng)子序列，所述第二增強(qiáng)子序列與所述目的基因可操作地連接。
5.一種轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞或其培養(yǎng)物，其特征在于，在所述轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞的1號(hào)染色體上包含表達(dá)外源基因的核酸序列，所述核酸序列插入所述1號(hào)染色體的假attp位點(diǎn)中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞或其培養(yǎng)物，其特征在于，所述假attp位點(diǎn)的核心區(qū)具有如SEQ ID NO :3所示的寡核苷酸序列。
7.一種制備權(quán)利要求5或6所述的轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞的方法，其特征在于，包括下列 使用權(quán)利要求3所述的一組適于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的載體轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞，以便獲得轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞，優(yōu)選利用所述第一載體和所述第二載體共轉(zhuǎn)化所述豬細(xì)胞，任選地通過(guò)脂質(zhì)體法進(jìn)行所述共轉(zhuǎn)化；以及分離轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一載體與所述第二載體的質(zhì)量比為1 1 5，優(yōu)選1 1。
9.一種確定豬基因組中假attp位點(diǎn)序列的方法，其特征在于，包括下列步驟 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法制備轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞；分離所述轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞的基因組DNA ；使用限制性內(nèi)切酶對(duì)所述基因組DNA進(jìn)行酶切消化，以便獲得具有粘性末端的DNA片段；將所述DNA片段與相應(yīng)的接頭相連，以便獲得連接產(chǎn)物；使用第一 PCR引物組，對(duì)所述連接產(chǎn)物進(jìn)行第一 PCR擴(kuò)增，以便獲得第一擴(kuò)增產(chǎn)物，其中，第一 PCR引物組包括第一引物和第二引物，所述第一引物特異性識(shí)別接頭，所述第二引物特異性識(shí)別所述第一核酸序列；使用第二 PCR引物組，對(duì)所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二 PCR擴(kuò)增，以便獲得第二擴(kuò)增產(chǎn)物，其中，第二 PCR引物組包括第三引物和第四引物，所述第三引物特異性識(shí)別接頭，所述第四引物特異性識(shí)別所述第一核酸序列；對(duì)所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以便獲得測(cè)序結(jié)果，其中，所述測(cè)序結(jié)果中包含所述假 attp位點(diǎn)的部分序列；基于所述測(cè)序結(jié)果，確定所述假attp位點(diǎn)的序列， 任選地，所述限制性內(nèi)切酶為BamH I和Bgl II的組合，任選地，所述接頭由第一寡核苷酸鏈和第二寡核苷酸鏈構(gòu)成，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有如SEQ ID NO :6所示的寡核苷酸序列，所述第二寡核苷酸鏈具有如SEQ ID NO :7所示的寡核苷酸序列，任選地，所述第一引物具有如SEQ ID NO :8所示的核苷酸序列；以及所述第二引物具有如SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列， 任選地，所述第三引物具有如SEQ ID NO :10所示的核苷酸序列；以及所述第四引物具有如SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列。CN 102533741 A_
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，基于所述測(cè)序結(jié)果，確定所述假attp位點(diǎn)的序列進(jìn)一步包括基于所述測(cè)序結(jié)果，確定所述假attp位點(diǎn)在豬基因組中的位置；以及基于噬菌體attp位點(diǎn)序列以及所述假attp位點(diǎn)在豬基因組中的位置，確定所述假 attp位點(diǎn)的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及豬假attp位點(diǎn)及其用途。更具體地，本發(fā)明涉及一種分離的可被ΦC31整合酶識(shí)別的寡核苷酸，一種適于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的載體，一組適于轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞的載體，一種轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞或其培養(yǎng)物，一種制備轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞的方法，以及一種確定豬基因組中假attp位點(diǎn)序列。其中，分離的可被ΦC31整合酶識(shí)別的寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。其能夠有效地在ΦC31整合酶的介導(dǎo)下，在豬細(xì)胞中引入外源基因。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102533741SQ20111040945
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者劉歡, 張楚新, 張歡歡, 李勇, 杜玉濤, 楊煥明, 汪建, 王俊 申請(qǐng)人:深圳華大基因研究院, 深圳華大基因科技有限公司