專利名稱：熒光pcr毛細(xì)管電泳檢測(cè)flt3-itd基因突變的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)FLT3 (Fms-like tyrosine kinase 3)基因近膜區(qū)的序列內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(internal tandem duplications, ITD)突變的試劑盒,特別是涉及以突光PCR毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測(cè)臨床樣品中FLT3-1TD的試劑盒。由于本試劑盒對(duì)全血或骨髓樣品中的FLT3-1TD的檢測(cè)和分析具有很高的靈敏度和特異性，可廣泛應(yīng)用于白血病判斷預(yù)后，指導(dǎo)治療和預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)等多個(gè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
FLT3 (Fms-like tyrosine kinase 3)是III型受體酪氨酸激酶家族中的一員，其突變與白血病的發(fā)生密切相關(guān)。FLT3與其配體(FL)在造血干/祖細(xì)胞的增殖和分化中起重要的調(diào)節(jié)作用。FL與FLT3的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合介導(dǎo)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和活化。當(dāng)FLT3發(fā)生基因突變時(shí)，可導(dǎo)致FLT3非配體依賴性磷酸化，破壞正常血細(xì)胞的增殖、分化與凋亡。FLT3突變有兩種形式:一種為發(fā)生在FLT3基因近膜區(qū)的序列內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(internal tandem duplications, ITD),稱為 FLT3-1TD 突變,ITD 的大小和位置都存在多態(tài)性，典型的ITD位于第14外顯子，也可累及第14內(nèi)含子和第15外顯子；一種為發(fā)生在酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)區(qū)域的點(diǎn)突變，稱為FLT3-TKD突變。目前有關(guān)于FLT3-1TD突變的研究表明FLT3-1TD突變最常出現(xiàn)在急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者中，突變發(fā)生率為15% 35%，其次為骨髓增生異常綜合征(myelodysplasticsyndromes，MDS)，突變發(fā)生率約為2% 5%。FLT3-1TD在急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者中發(fā)生率極低(低于1% )，而在慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、多發(fā)性骨髓瘤、成人體細(xì)胞白血病中尚未發(fā)現(xiàn)FLT3-1TD突變。AML是一組起源 于造血干細(xì)胞的惡性血液病，具有高度異質(zhì)性。在影響AML預(yù)后危險(xiǎn)度的眾多因素中，細(xì)胞遺傳學(xué)已被認(rèn)為是最重要的獨(dú)立預(yù)后因素，一些特異性染色體核型異常，不僅成為AML診斷中的重要標(biāo)志物，并常被認(rèn)為是判斷預(yù)后的標(biāo)志。但是大約40 % 50 %的AML患者未檢測(cè)到染色體核型異常，這些患者預(yù)后變異較大，5年生存率24% 42%。所以尋找核型正常AML患者的預(yù)后分子標(biāo)志成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。隨著分子遺傳學(xué)檢測(cè)方法的應(yīng)用，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)正常核型的AML患者在分子學(xué)水平上是存在異質(zhì)性的，包括基因突變或某些特定基因的表達(dá)異常，為AML患者的進(jìn)一步預(yù)后分級(jí)及分子靶向治療提供了依據(jù)FLT3基因突變是已發(fā)現(xiàn)的影響AML患者預(yù)后的分子標(biāo)志之一，可作為AML患者預(yù)后不良的獨(dú)立指標(biāo)。FLT3-1TD突變是AML患者中最常見的一種突變類型，約15% 35% AML病例存在FLT3-1TD突變，另外還有約7%的AML病例存在FLT3-TKD突變。但是目前大部分研究認(rèn)為FLT3-TKD突變與AML預(yù)后無(wú)關(guān)，而FLT3-1TD突變與AML發(fā)病和發(fā)展密切相關(guān)，是一個(gè)重要的獨(dú)立預(yù)后因素。FLT3-1TD陽(yáng)性患者具有較獨(dú)特的臨床特征，目前針對(duì)于此突變的靶向治療也已經(jīng)進(jìn)入不同的臨床試驗(yàn)階段。而且，不同ITD患者的預(yù)后也存在差別，這與ITD-AR(internal tandem allelic ratio,內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)等位基因比例)值有關(guān)，即ITD:WT (FLT3野生型基因)比值，ITD-AR值增加可能導(dǎo)致預(yù)后不良，因此ITD-AR值也是AML患者的很強(qiáng)的獨(dú)立預(yù)后因素。MDS患者FLT3-1TD突變相比于沒有突變的患者，F(xiàn)LT3-1TD陽(yáng)性患者轉(zhuǎn)為AML的概率有增高趨勢(shì)，進(jìn)展為AML的時(shí)間有縮短趨勢(shì)，且總體生存期縮短，MDS轉(zhuǎn)為AML后，F(xiàn)LT3-1TD陽(yáng)性率增高，因此FLT3-1TD是MDS轉(zhuǎn)化為AML的高危因素，為預(yù)后不良因素。綜上，F(xiàn)LT3-1TD可作為AML和MDS患者預(yù)后不良的獨(dú)立指標(biāo)，對(duì)FLT3-1TD基因突變進(jìn)行檢測(cè)可以幫助判斷預(yù)后，用于指導(dǎo)治療、判斷療效和疾病復(fù)發(fā)，對(duì)增加患者的長(zhǎng)期生存率和生存質(zhì)量有著非常重要的意義。FLT3-1TD基因突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR毛細(xì)管電泳法)提供一種快速檢測(cè)FLT3-1TD基因突變的方法。本方法根據(jù)PCR引物設(shè)計(jì)原理，分別在FLT3-1TD發(fā)生的14外顯子和15外顯子的兩端設(shè)計(jì)上下游引物，對(duì)于發(fā)生FLT3-1TD基因突變的DNA標(biāo)本，將會(huì)出現(xiàn)大于正常片段的擴(kuò)增產(chǎn)物。本方法通過(guò)毛細(xì)管電泳方法檢測(cè)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度來(lái)確定是否存在FLT3-1TD基因突變，并可以通過(guò)軟件分析計(jì)算ITD-AR值，以期為AML和MDS的臨床診斷、預(yù)后判斷及分子靶向治療提供理論依據(jù)。相比普通的瓊脂糖凝膠電泳，該方法更加靈敏，且能準(zhǔn)確判斷突變條帶的片段大小及基因劑量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種使用熒光PCR毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測(cè)白血病臨床樣品中FLT3-1TD基因突變的試劑盒。該試劑盒通過(guò)提取患者血液或骨髓的DNA，使用PCR方法擴(kuò)增FLT3的ITD區(qū)域，然后使用熒光PCR毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)ITD片段大小及劑量進(jìn)行檢測(cè)。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，我們采用了以下技術(shù)方案:(I)使用適當(dāng)?shù)暮怂岱治鲕浖?duì)已知的FLT3基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比較并找出同源區(qū)段的基礎(chǔ)上 ，進(jìn)一步使用適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件(例如Primer 3)選擇并設(shè)計(jì)寡核苷酸引物。由于所設(shè)計(jì)的引物在FLT3-1TD發(fā)生的14外顯子和15外顯子的兩端，而且與其他基因表達(dá)mRNA的核苷酸序列沒有同源性，也不包括任何常見的核酸內(nèi)切酶，所以避免了 FLT3-1TD檢測(cè)的假陰性和假陽(yáng)性，提高了檢測(cè)的可靠性和準(zhǔn)確度；(2)使用DNA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物，用分子篩和快速蛋白質(zhì)液相層析法(FPLC)純化后進(jìn)行氨解處理。同樣合成所需的引物序列，氨解處理后分別在其5’端標(biāo)記作為熒光發(fā)生基團(tuán)(報(bào)告基團(tuán))的6-FAM amidite0以FPLC層析法純化熒光標(biāo)記的引物。然后，可使用變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠(20% )電泳法和分光光度法物理鑒定所合成的引物和探針；(3)從得自受試者的外周血或者骨髓中提取DNA，然后使用PCR反應(yīng)體系將其擴(kuò)增；(4)提供包括(a)待檢樣品，(b)耐熱DNA聚合酶和(C) 2_脫氧核苷三磷酸(dNTPs)的擴(kuò)增反應(yīng)體系，以及包括(d)能夠與待檢雙鏈靶多核苷酸的第一條互補(bǔ)鏈結(jié)合的正向引物，(e)能夠與待檢雙鏈靶多核苷酸的第二條互補(bǔ)鏈結(jié)合的反向引物。通過(guò)一次或多次聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增所說(shuō)的靶多核苷酸；通過(guò)熒光PCR毛細(xì)管電泳技術(shù)以檢測(cè)靶多核苷酸的片段長(zhǎng)度。本發(fā)明所提供的熒光PCR毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測(cè)臨床樣品中FLT3-1TD的試劑盒包括=(I)PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或管，和⑵分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，(3)以電泳法確定擴(kuò)增片段的大小和基因劑量。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中PCR擴(kuò)增反應(yīng)液包括5’端結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)的正向引物、反向引物、dNTPs、耐熱DNA聚合酶、PCR緩沖液和水，特征在于所使用的引物序列分別為:5’ -FAM-TCTCCTCTTCATTGTCGTTTTA -3，(SEQ ID NO:1)、5' -ATGGTGAGTACGTGCATTTTA-3' (SEQ ID NO:2)，其中 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 匹配在一起可以檢測(cè)FLT3-1TD。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中還可以使用的引物序列分別為:5’ -FAM-TTCATTATTCTTTCCTCTATCTGC-3’(SEQ ID NO:3)、5' -TGTTGCGTTCATCACTTTTC-3' (SEQ ID NO:4)，其中 SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4 匹配在一起可以檢測(cè)FLT3-1TD。本發(fā)明的另一 個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中還可以使用的引物序列分別為:5’-FAM-AACTGCCTATTCCTAACTGACTC-3’ (SEQ ID NO:5)，5’-TCCATAAGCTGTTGCGTTC-3’ (SEQID NO:6)，其中 SEQ ID NO::5，SEQ ID NO:6 匹配在一起可以檢測(cè) FLT3-1TD。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中還可以使用的引物序列分別為:5’-FAM-GCCAGCTACAGATGGTACAGG-3’ (SEQ ID NO:7)，5’-AGCATTTTGACGGCAACC-3’ (SEQ IDNO:8)，其中 SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 匹配在一起可以檢測(cè) FLT3-1TD。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，特征在于每25微升的PCR緩沖液中加入 2 單位 Taq 酶，緩沖液包含 IOmM Tris-HCl (ρΗ8.0)、150mM KCl、3mM MgCl20本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系由PCR緩沖液、耐熱DNA聚合酶、dNTPs，引物所組成，其特征在于引物的序列組合為SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2，或SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4，或 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或 SEQ ID NO:7 和 SEQ IDNO:8。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中陰性質(zhì)控品為去離子水，陽(yáng)性質(zhì)控品為攜帶有FLT3-1TD序列的重組質(zhì)粒，質(zhì)粒由上下游引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過(guò)市售的載體克隆構(gòu)建而成，所使用的上下游引物的序列組合可以是SEQ ID NO:1和SEQ ID N0::2，或SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO::4，或 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或 SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，根據(jù)復(fù)合擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小來(lái)分析樣本中FLT3正?；蚝虵LT3-1TD和劑量變化，任何可以分離核酸片段大小的方法例如過(guò)濾，高效液相色譜，電泳，親和收集等方法均可用于本發(fā)明，其中通過(guò)凝膠電泳的方法進(jìn)行分離并定量，優(yōu)選使用毛細(xì)管電泳法分離FLT3正?；蚝虵LT3-1TD。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，可以根據(jù)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的累計(jì)熒光值定量FLT3正常基因和FLT3-1TD的相對(duì)量，并通過(guò)計(jì)算FLT3正?；蚝虵LT3-1TD相對(duì)劑量來(lái)分析ITD-AR 值。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選 實(shí)施方案，其中試劑盒的待檢樣品可選自但不局限于白血病患者的臨床樣品。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中試劑盒的靶多核苷酸來(lái)自FLT3基因。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中試劑盒的核酸擴(kuò)增系統(tǒng)是采用聚合酶鏈反應(yīng)，并且所說(shuō)的擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)是重復(fù)30-50次的聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)。特別值得說(shuō)明的是，為了確保本發(fā)明的FLT3-1TD檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，我們還使用攜帶有FLT3-1TD序列的重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性質(zhì)控品。借助這些陽(yáng)性質(zhì)控品，使用本發(fā)明的試劑盒在相同條件下進(jìn)行平行檢測(cè)，以進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)精密度和準(zhǔn)確性，并作為生產(chǎn)本發(fā)明試劑盒附加的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。本技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)相比，優(yōu)點(diǎn)為:①反應(yīng)靈敏高，DNA濃度為IOng/μ I時(shí)即可檢出②結(jié)合毛細(xì)管電泳能對(duì)基因進(jìn)行精確定量③能對(duì)突變型基因與野生型基因比例進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)④在大量野生型基因存在下，亦能檢測(cè)出低頻突變型基因。


圖1顯示一個(gè)正常男性樣本多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。圖中片段大小約為330bp的藍(lán)色條帶為一個(gè)正常男性樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2顯示一個(gè)正常女性樣本多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。圖中片段大小約為330bp的藍(lán)色條帶為一個(gè)正常女性樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物。圖3顯示一個(gè)男性AML患者的FLT3-1TD樣本擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。圖中片段大小約為330bp和360bp的兩條藍(lán)色條帶，顯示一個(gè)男性AML患者的FLT3-1TD樣本擴(kuò)增產(chǎn)物。圖4顯示一個(gè)女性AML患者的FLT3-1TD樣本擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。圖中片段大小約為330bp和360bp的兩條藍(lán)色條帶，顯示一個(gè)女性AML患者的FLT3-1TD樣本擴(kuò)增產(chǎn)物。圖5顯示一個(gè)MDS患者樣本的FLT3-1TD的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。圖中片段大小約為330bp和360bp的兩條藍(lán)色條帶，顯示一個(gè)MDS患者樣本的FLT3-1TD的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在舉例說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。

實(shí)施例1:檢測(cè)試劑盒及其使用1、制備包括下列組成成分的試劑盒:ITD PCR反應(yīng)液A(內(nèi)含SEQ ID NO:1和SEQID NO::2) (500 μ I/ 管)、ITD PCR 反應(yīng)液 B (75 μ I/ 管)、ITD 陽(yáng)性質(zhì)控品(50 μ I/ 管)、陰性質(zhì)控品(δΟμΙ/管)。2、標(biāo)本米集、運(yùn)送和保存:(I)標(biāo)本采集:標(biāo)本為外周血或骨髓。抽取受檢者靜脈血或骨髓3_5ml，注入含EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)或枸櫞酸鈉抗凝劑的玻璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合5 10次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻。(2)保存:可立即檢測(cè)，4°C保存一周，_20°C保存期可達(dá)一年。(3)運(yùn)輸:標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用0°C冰壺。3、檢測(cè)步驟和結(jié)果分析:DNA提取建議使用Qiagen DNA提取試劑盒。(I)取200 μ I外周血或骨髓至1.5ml離心管。(2)加入20 μ I的蛋白酶。(3)加入 200 μ I 的 Buffer AL，振蕩 15 秒。(4)56°C溫育 10 分鐘。(5)加入200 μ I乙醇,振蕩15秒。
(6)將混合液吸入 QIAamp Mini spin column,6000g 離心 I 分鐘。(7)將內(nèi)柱放入一個(gè)新的套管中，加入500 μ I的Buffer AWl，6000g離心I分鐘。(8)將內(nèi)柱放入一個(gè)新的套管中，加入500 μ I的Buffer AW2，6000g離心I分鐘。(9)將內(nèi)柱放入一個(gè)新的1.5ml離心管中，最大離心速度離心I分鐘。(10)加入200 μ I的Buffer AE，室溫靜置I分鐘，6000g離心I分鐘。(11)得到 200 μ I DNA 溶液QF-PCR 操作步驟:1、對(duì)于每一個(gè)PCR反應(yīng)體系，混合以下成分到總體積為25ul。設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)樣品中FLT3-1TD的試劑盒，試劑盒包括:(I) PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中PCR擴(kuò)增反應(yīng)液包括5 ’端結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)的正向引物、反向引物、dNTPs、耐熱DNA聚合酶、PCR緩沖液和水，(3)以電泳法確定擴(kuò)增片段的大小和基因劑量，其特征在于所使用的正反向引物的序列可以為:5，-FAM-TCTCCTCTTCATTGTCGTTTTA-3\5/ -ATGGTGAGTACGTGCATTTTA-3'；5，-FAM-TTCATTATTCTTTCCTCTATCTGC-3\5/ -TGTTGCGTTCATCACTTTTC-3'；5’ -FAM-AACTGCCTATTCCTAACTGACTC-3’、5’ -TCCATAAGCTGTTGCGTTC-3’ ；5’ -FAM-GCCAGCTACAGATGGTACAGG-3'5’ -AGCATTTTGACGGCAACC-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于PCR緩沖液包含IOmMTris-HCl (pH8.0)、150mM KCl、3mM MgCl2，每25微升的PCR緩沖液中加入2單位Taq酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系由PCR緩沖液、耐熱DNA聚合酶、dNTPs，引物所組成，其特征在于引物的序列組合為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4，或 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或 SEQ ID NO:7 和 SEQID NO:8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于陽(yáng)性質(zhì)控品為攜帶有FLT3-1TD序列的重組質(zhì)粒，質(zhì)粒由上下游引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過(guò)市售的載體克隆構(gòu)建而成，所使用的上下游引物的序列組合可以是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4，或SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或 SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于試劑盒的核酸擴(kuò)增系統(tǒng)是采用聚合酶鏈反應(yīng)，并且所說(shuō)的擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)是重復(fù)30-50次的聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于所檢測(cè)樣品為全血或骨髓等白血病臨床樣品O
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)FLT3(Fms-like tyrosine kinase 3)基因近膜區(qū)的序列內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(internal tandem duplications，ITD)突變的試劑盒，特別是涉及以熒光PCR毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測(cè)臨床樣品中FLT3-ITD的試劑盒。本試劑盒主要包括PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或管，以及分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒、以電泳法確定擴(kuò)增片段的大小和基因劑量。本試劑盒對(duì)全血或骨髓樣品中的FLT3-ITD的檢測(cè)和分析具有很高的靈敏度和特異性，可廣泛應(yīng)用于白血病判斷預(yù)后，指導(dǎo)治療和預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)等多個(gè)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103103251SQ20111036170
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2011年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月15日
發(fā)明者李明, 陳嘉昌, 陳華云, 高云, 程鋼, 何蘊(yùn)韶 申請(qǐng)人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司