專利名稱：豬連環(huán)蛋白α樣1基因CTNNAL1作為豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的遺傳標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬遺傳標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬連環(huán)蛋白a樣1CTNNAL1基因作為豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的遺標(biāo)記及應(yīng)用，它包括豬連環(huán)蛋白a樣I (catenin(cadherin-associated protein), alpha-like I, CTNNALI)基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬的產(chǎn)仔數(shù)性狀是屬于低遺傳力的限性性狀，性狀遺傳力只有0.10，采用常規(guī)選擇遺傳進(jìn)展有限。近年來(lái)分子標(biāo)記輔助選擇為產(chǎn)仔數(shù)性狀的遺傳改良提供了新的機(jī)遇。分子標(biāo)記篩選主要有候選基因法和基因組掃描法。最早用候選基因法分離的豬產(chǎn)仔數(shù)性狀基因或標(biāo)記是雌激素受體基因(Estrogen receptor, ESR)。Rothschild研究組(1994.A major gene for litter size in pigs.Proc 5th World Congr Genet Appl LivestProd, Guelph，Canada，1994，21:225-228)研究發(fā)現(xiàn)ESR位點(diǎn)B等位基因可以顯著提高梅山豬合成系的產(chǎn)仔數(shù)1.15頭/窩，但通過(guò)基因組掃描法卻沒有發(fā)現(xiàn)在其附近存在產(chǎn)仔數(shù)性狀上的QTL。另外一種是基因組掃描法，但由于獲得具有產(chǎn)仔數(shù)記錄的資源家系建系難，時(shí)間長(zhǎng)、成本高，因此對(duì)產(chǎn)仔數(shù)性狀QTL定位的報(bào)道相對(duì)少。Rathje等(1997.Evidencefor quantitative trait loci affecting ovulation rate in pigs.Journal of AnimalScience.75:1486-1494)和Milan等(1998.Current status of QTL detection in LargeWhiteXMeishan crosses in France.Proc 6th World Congr Genet Appl Livest Prod，Armidale, Australia，26:414-417)報(bào)道了 8號(hào)染色體上一個(gè)影響排卵率和單胎產(chǎn)仔數(shù)的大效應(yīng)QTL。Zhang 等(1998.1dentification and chromosomal localization of CTNNALI,a novel protein homologous to alpha-catenin.Genomics, 54 (I):149-154.)通過(guò)基因文庫(kù)的掃描，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)和人類的a連環(huán)蛋白同源的基因。這個(gè)基因的cDNA長(zhǎng)約2450bp，編碼長(zhǎng)約734個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。這個(gè)基因被定名為CTNNAL1 (鈣粘蛋白類似物)。Park 等(2002.Association of Lbc Rho guanine nucleotide exchange factor withalpha-eatenin-related protein， alpha-catulin/CTNNAL1, supports serum responsefactor activation.J Biol Chem，277(47):45361-45370)通過(guò)比對(duì)，發(fā)現(xiàn) CTNNAL1 編碼的a-Catulin和CTNNAl編碼的a E-catenin的同源性超過(guò)40 %以上，和CTNNA2編碼的a N-catenin的同源性在50%以上。a -catenin是組成I丐粘蛋白_連環(huán)蛋白復(fù)合體的關(guān)鍵部分，對(duì)于鈣粘蛋白的粘附活性是必須的，介導(dǎo)大多數(shù)脊椎動(dòng)物的細(xì)胞間的黏附作用(Aberle et al.Cadherin-catenin complex:protein interactions and theirimplications for cadherin function.J Cell Biochem，1996，61:514-523)，跨膜I丐粘蛋白的黏附作用是由胞漿中的鈣粘蛋白和胞內(nèi)的連環(huán)蛋白(a，￠)組成的復(fù)合體來(lái)實(shí)現(xiàn)的。此外，a-catenin 還和生 長(zhǎng)發(fā)育通路有關(guān)(Barth et al.Cadherins, catenins and APCprotein:interplay between cytoskeletal complexes and signaling pathways.CurrOpin Cell Biol, 1997,9:683-690)。a-catenin在wnt誘導(dǎo)的細(xì)胞分化中起下調(diào)的作用，抑制P-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活。Buimer 等(2008.Seven Placental Transcripts CharacterizeHELLP-syndrome.Placenta,2008,29(5):444-453)發(fā)現(xiàn)在 HELLP(hemolysis, elevatedliver enzymes, and low platelets syndrome)綜合癥中 CTNNALI 是下調(diào)表達(dá)的，HELLP綜合癥主要表現(xiàn)為溶血，肝酶升高以及血小板減少的癥狀這種癥狀是與孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒的死亡率有很大的關(guān)聯(lián)性。此外，在我們前期研究中CTNNAL1基因在大白豬和中國(guó)二花臉豬排卵前卵泡中差異表達(dá)(Sun et al.Microarray profiling for differential geneexpression in PMSG—hCG stimulated preovulatory ovarian follicles of ChineseTaihu and Large White sows.BMC Genomics,2011,12(I):111)因此我們將CTNNAL1基因作為豬產(chǎn)仔數(shù)性狀候選基因，研究該基因多態(tài)性，并與產(chǎn)仔數(shù)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為產(chǎn)仔數(shù)性狀改良提供新的標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于獲得一種豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的遺傳標(biāo)記，克隆豬CTNNAL1基因序列，尋找突變位點(diǎn)以及基因多態(tài)性的檢測(cè)方法，為豬的標(biāo)記輔助提供一種選擇方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:本發(fā)明獲得了一種豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的遺傳標(biāo)記，它是大白豬、太湖豬CTNNAL1基因的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID N0:3所示；通過(guò)上述序列進(jìn)行ClustalW比對(duì)提供了位于 該擴(kuò)增片段646堿基處存在I個(gè)C/G突變(如圖1所示)，導(dǎo)致PCR-Alu1-RFLP多態(tài)性。申請(qǐng)人:設(shè)計(jì)了一種擴(kuò)增豬CTNNAL1基因cDNA序列的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQID NO:4 和 SEQID NO:5 所示。申請(qǐng)人:提供了一種篩選豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的遺傳標(biāo)記的方法，按照以下步驟:從豬血液中提取基因組DNA。登錄NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載人的相應(yīng)基因序列，以人CTNNALI mRNA序列作為種子序列，利用NCBI網(wǎng)站EST-others搜尋豬的同源EST。選擇同源性大于80%的豬的ESTs，利用電子克隆，將獲得的ESTs進(jìn)行拼接，并以此作為靶序列，設(shè)計(jì)特異引物(該引物的序列如序列表SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5所示)。以大白豬和太湖豬的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物回收和克隆測(cè)序，得到如序列表SEQ ID NO: 1-3所示的基因片段；進(jìn)而進(jìn)行序列Clustalw比對(duì)，篩查SNP (如圖1所示)，在該序列的646堿基處(即，該基因第14外顯子43bp處)發(fā)現(xiàn)C/G等位基因突變，此突變引起了氨基酸發(fā)生改變，使得由CAG編碼的Gln (谷氨酰胺)變成了 CAC編碼的His (組氨酸)，該突變表現(xiàn)了大白豬和太湖豬種間差異，并引起了 AluI酶切位點(diǎn)(AG丨CT)多態(tài)性。然后以Ensembl上豬CTNNAL1基因序列及豬CTNNAL1基因673bp的cDNA片段SEQID NO =1-SEQ ID NO:3序列為靶序列，設(shè)計(jì)引物，該引物的序列如序列表SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。擴(kuò)增區(qū)域包括豬CTNNAL1基因第14外顯子的416bp的基因組核苷酸序列(如圖2所示),然后進(jìn)行AluI酶切，SNP位點(diǎn)檢測(cè)如圖3所示。本發(fā)明提供了鑒定上述序列C/G變異的AluI_RFLP(限制性內(nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性)基因型分型方法。其引物序列分別如序列表SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示，在豬基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增片段AluI酶切分型及檢測(cè)。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了利用AIu1-RFLP方法確定豬不同基因型個(gè)體與產(chǎn)仔數(shù)性狀間的關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用。更詳細(xì)的發(fā)明方案見《具體實(shí)施方式
》所述。


序列表SEQ ID NO:1:是擴(kuò)增的國(guó)外血緣豬種“大白豬個(gè)體I”的核苷酸序列；序列表SEQ ID NO:2:是擴(kuò)增的中國(guó)血緣豬種“太湖豬個(gè)體I ”的核苷酸序列；序列表SEQ ID NO:3:是擴(kuò)增的中國(guó)血緣豬種“太湖豬個(gè)體2”的核苷酸序列；序列表SEQ ID NO:4:是制備SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3特異基因片段所用的正向引物。序列表SEQ ID NO:5:是制備SEQ ID NO =1-SEQ ID NO:3特異基因片段所用的反向引物。序列表SEQ ID NO:6:是實(shí)施豬CTNNAL1基因第14外顯子C/G變異AIu1-RFLP (限制性內(nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性)基因型分型方法的正向引物。序列表SEQ ID NO:7:是實(shí)施豬CTNNAL1基因第14外顯子C/G變異AIu1-RFLP (限制性內(nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性)基因型分型方法的反向引物。圖1:是大白豬和太湖豬CTNNAL1基因序列片段比對(duì)結(jié)果和SNP位點(diǎn)。圖2:是包括豬CTNNAL1基因序列片段瓊脂糖凝膠電泳圖譜。瓊脂糖凝膠濃度為
1.5%;圖中:M 泳道為 DNA Marker DL2, 000 ;泳道 1-7 為序列表 SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:7所示引物在不同豬種中的擴(kuò)增片段，片段大小為416bp。圖3:是豬CTNNAL1基因片段AIu1-RFLP檢測(cè)結(jié)果。瓊脂糖膠濃度為2.0%;圖中:泳道M為DL 2000Markers ;1、3、4泳道為CG基因型，片段大小分別為416bp，238bp，178bp ；
2、6泳道為GG基因型，片段大小為238bp，178bp；5泳道為CC基因型，片段大小為416bp。圖4:是大白豬個(gè)體I的核苷酸序列。在該序列的的646bp處存在I個(gè)等位基因突變(C/G)。圖5:是太湖豬個(gè)體I的核苷酸序列。在該序列的的646bp處存在I個(gè)等位基因突變(C/G)。圖6:是太湖豬個(gè)體2的核苷酸序列。在該序列的的646bp處存在I個(gè)等位基因突變(C/G)。根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于開發(fā)成診斷方法或試劑盒，從而在育種計(jì)劃中利用這些方法來(lái)選擇攜帶有利等位基因的豬，從而可以達(dá)到較好的選擇效果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:豬CTNNALI基因片段的獲得及多態(tài)性檢測(cè)方法的建立登錄NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載人 的相應(yīng)基因序列，以人CTNNAL1 mRNA序列作為種子序列，利用NCBI網(wǎng)站EST-others搜尋豬的同源EST。選擇同源性大于80%的豬的ESTs，利用電子克隆，將獲得的ESTs進(jìn)行拼接，并以此作為靶序列，利用Primerf軟件在線設(shè)計(jì)引物。引物序列如序列表SEQ ID NO:4和SEQID NO:5所示，如下:正向引物CTNNAL1-F:CCATGCTGATCATGTGGTTC, CTNNAL1-R:CAAACCCTCCTCAGCAAAAA。PCR 擴(kuò)增包含 CTNNAL1 基因第14外顯子片段。PCR反應(yīng)體系為25iU，其中模板DNA為50ng，dNTPs濃度為200iimol/L,每條引物濃度為 0.4 u mol/L, 3U 的 Taq DNA 聚合酶(Biostar International, Canada),加去離子水至總體積25iU ；PCR反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性4min ;然后94°C變性50s、64°C退火50s、72°C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化(UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司)，克隆后，進(jìn)行序列測(cè)定，序列測(cè)定由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成。不同豬種的PCR產(chǎn)物序列經(jīng)ClustalW軟件進(jìn)行序列比對(duì)，序列間比對(duì)結(jié)果見圖1。上述擴(kuò)增片段大小為673bp，位于該片段646堿基處(即，位于該基因第14外顯子的第43個(gè)堿基)C/G突變(見圖4-6)。該處突變引起了氨基酸發(fā)生改變，使得由CAG編碼的Gln (谷氨酰胺)變成了 CAC編碼的His (組氨酸)，該變異表現(xiàn)了大白豬和太湖豬種間差異，并引起了 A/uI酶切位點(diǎn)(AG丨CT)多態(tài)性。然后以Ensembl上豬CTNNAL1基因序列及豬CTNNAL1基因673bp的cDNA片段SEQ ID NO =1-SEQ ID NO:3序列為靶序列，設(shè)計(jì)引物，該引物的序列如序列表SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:7 所示，序列如下:正向引物 CTNNALl-SNP-F:CGGGTGTGACCCTAAAAAGA,CTNNAL1-SNP-R:AAGCGCCACAAAATGCTACT。擴(kuò)增區(qū)域包括豬 CTNNALI 基因第 14 外顯子的416bp的基因組核苷酸序列，如圖2所示。PCR擴(kuò)增，取8.5 ill PCR產(chǎn)物加入0.5 ill (10U/U I)限制性內(nèi)切酶和Iyl 10 X buffer (含10 X BSA)，37 °C AluI酶切4h，取5 ill酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在紫外燈下觀察并記錄酶切結(jié)果，如圖3所示:此擴(kuò)增片段大小為416bp，在238bp處有AluI酶切位點(diǎn)，若該處堿基為C，則不存在AluI酶切位點(diǎn)，用AluI酶切檢測(cè)結(jié)果有416bp —條片段(C等位基因)，當(dāng)該位點(diǎn)為G時(shí)，結(jié)果導(dǎo)致一個(gè)AluI酶切位點(diǎn)的產(chǎn)生，酶切得到兩個(gè)片段，長(zhǎng)度分別為238bp和178bp(G等位基因)。實(shí)施例2:本發(fā)明制備的遺傳標(biāo)記在不同豬群中的多態(tài)性分布豬基因組DNA的提取(樣本見表I所示)方法參照熊遠(yuǎn)著《豬生化及分子遺傳實(shí)驗(yàn)導(dǎo)論》中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999介紹的方法進(jìn)行。

在11個(gè)群體豬，其中7個(gè)國(guó)外血緣豬群和3個(gè)中國(guó)地方血緣豬群、I個(gè)合成系(中國(guó)瘦肉豬新品系DIV系(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)和湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所共同培育，在中國(guó)大規(guī)模推廣應(yīng)用的瘦肉型新品種豬)中檢測(cè)豬CTNNAL1基因PCR-Alu1-RFLP多態(tài)性，檢測(cè)結(jié)果如表I所示。結(jié)果表明:只有在大白豬、湖北白豬DIV以及淮南豬中存在3種基因型；但是在通城豬等7個(gè)群體中沒有檢測(cè)CC型，可能C等位基因純合個(gè)體會(huì)在胚胎發(fā)育早期死亡。在所有檢測(cè)的11個(gè)群體中，G等位基因頻率為0.54-1.00，G等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因(見表I)。表I豬CTNNAL1基因PCR-Alu1-RFLP在不同豬種中的分布結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的遺傳標(biāo)記，它是豬連環(huán)蛋白a樣I基因CTNNAL1第14外顯子的特異基因片段，它們的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO=USEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示,在序列表SEQ ID NO:USEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3序列646位堿基處有一個(gè)堿基突變C/G，導(dǎo)致AIu1-RFLP多態(tài)性。
2.擴(kuò)增如權(quán)利要求1所述的遺傳標(biāo)記的特異引物，其核苷酸序列如序列表SEQID NO:6 和 SEQ ID NO:7 所示。
3.一種篩選豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的遺傳標(biāo)記的方法，按照以下步驟: 從豬血液中提取基因組DNA，根據(jù)豬CTNNAL1基因序列和序列表SEQ ID NO:1至SEQID NO:3所示的序列設(shè)計(jì)引物，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6和SEQID NO:7所示，用該引物在豬基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增片段AluI酶切分型及檢測(cè)。
4.權(quán)利要求1所述遺傳標(biāo)記在在豬產(chǎn)仔數(shù)性狀標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2所述的引物在`豬產(chǎn)仔數(shù)性狀標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于豬遺傳標(biāo)記制備與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及豬連環(huán)蛋白α樣1CTNNAL1編碼基因第14外顯子的單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。其步驟包括從豬血液中提取基因組DNA，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序，序列比較分析，單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，標(biāo)記與產(chǎn)仔數(shù)性狀間相關(guān)性分析。本發(fā)明公開了豬CTNNAL1基因第14外顯子的DNA序列和SNP分型的檢測(cè)技術(shù)。本發(fā)明的遺傳標(biāo)記的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示，在序列表SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3序列646位堿基處有一個(gè)堿基突變C/G，并導(dǎo)致AluI-RFLP多態(tài)性。本發(fā)明公開了該遺傳標(biāo)記的制備方法及其在豬產(chǎn)仔數(shù)標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103114093SQ20111036180
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者李鳳娥, 孫曉杰, 梅書棋, 陶虎, 彭先文, 蘇麗娜, 蔣思文, 鄧昌彥, 熊遠(yuǎn)著 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)