專利名稱：呈味活性肽及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及呈味肽的制備方法和用途，具體涉及具有較強(qiáng)鮮味和增強(qiáng)鮮味的兩種呈味活性肽的制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鮮味是繼四大基本滋味(酸、甜、苦和咸)之后的第五種基本滋味，是由日本物理化學(xué)家Kikimae Ikeda 1908年在谷氨酸鈉中發(fā)現(xiàn)并鑒定的滋味，并將其命名為Umami(鮮味)， 隨后該科學(xué)家建廠大量生產(chǎn)谷氨酸鈉(又稱味精)，將味精推廣到全世界。味精作為鮮味劑風(fēng)靡全球?qū)⒔粋€(gè)世紀(jì)，但有報(bào)道味精會(huì)使人口干舌躁，且經(jīng)過(guò)高溫烹飪可能產(chǎn)生有毒物質(zhì)。在隨后幾十年里，人們把目光轉(zhuǎn)向來(lái)自于動(dòng)植物的天然的、安全的鮮味劑，如從食品中提取鮮味物質(zhì)5'-肌氨酸和5'-鳥(niǎo)氨酸，但由于鮮味劑濃度較低，且提純成本高，使得近年來(lái)人們更鐘情于使用生物技術(shù)制備鮮味物質(zhì)。已有專利報(bào)道利用生物技術(shù)，包括植物組織培養(yǎng)法、微生物發(fā)酵法等，生產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)是人們獲得天然風(fēng)味物質(zhì)的有效途徑。發(fā)明申請(qǐng)專利(申請(qǐng)?zhí)?00810198584.2)公開(kāi)了利用酶解技術(shù)制備富肽型呈味基料的方法，使用該法制備的產(chǎn)品風(fēng)味綿長(zhǎng)、后味厚重、使用方便。發(fā)明申請(qǐng)專利(申請(qǐng)?zhí)?200810025525. 5)公開(kāi)了一種采用微波干燥技術(shù)和復(fù)合酶解技術(shù)制備雞肉呈味粉的方法， 得到的雞肉呈味粉不僅口感好、環(huán)境污染小，且質(zhì)量穩(wěn)定，安全性好。發(fā)明申請(qǐng)專利(申請(qǐng)?zhí)?201110030012. 5)公開(kāi)了一種以植物蛋白為原料，多酶復(fù)合水解植被富含呈味肽的水解液， 該水解液具有濃郁的鮮味，口味延伸感強(qiáng)，添加在方便面、休閑膨化食品和復(fù)合調(diào)味品及肉制品中，能明顯提升其風(fēng)味，增強(qiáng)口味的厚重感。發(fā)明申請(qǐng)專利(申請(qǐng)?zhí)?00810219500.0) 公開(kāi)了一種結(jié)合脈沖電場(chǎng)、發(fā)酵技術(shù)和酶解技術(shù)制備呈味基料的方法。該法制備得到的呈味基料鮮味突出，色澤穩(wěn)定，蛋白質(zhì)利用率高達(dá)85%以上，氨基酸化率可到55%以上。上述專利報(bào)道的方法可制備具有較好呈味效果的產(chǎn)品，但產(chǎn)品中雜質(zhì)較多，目標(biāo)產(chǎn)物不明確，純度低，應(yīng)用領(lǐng)域狹隘?；ㄉ墒腔ㄉ凸I(yè)中的副產(chǎn)物，產(chǎn)量大，富含呈味氨基酸。但由于在榨油過(guò)程中經(jīng)歷了高溫壓榨和溶劑浸提的過(guò)程，導(dǎo)致花生蛋白嚴(yán)重變性，色澤和氣味惡化，目前主要用作飼料或肥料。如何高效利用花生粕，提高其附加值是近年來(lái)急需解決的難題。呈味肽是蛋白質(zhì)經(jīng)生物酶水解后得到的一系列小分子活性物質(zhì)，呈味效果明顯， 且具有好的穩(wěn)定性。自70年代發(fā)現(xiàn)風(fēng)味八肽以來(lái)，科學(xué)家們從未停止過(guò)研究呈味肽的腳
止
少ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供呈味活性肽及其制備方法與應(yīng)用，具體技術(shù)方案如下。本發(fā)明的呈味活性肽是優(yōu)良的調(diào)味品添加劑。呈味活性肽的制備方法，包括以下步驟
(1)粗酶的制備:10 30g麩皮，5 20g花生粕和0. 01 0. Ig氯化鈣與15 50g去離子水混合均勻；在殺菌鍋100 121°C中殺菌15 30min，冷卻至20_38°C，接種米曲霉， 在培養(yǎng)箱觀 321培養(yǎng)48 72h ；加入200mL-400mL水，在30-40°C水浴鍋中攪拌0. 5-2h ； 在4-10°C下5000 10，000 X g離心20 30min，取上清液冷凍干燥得粗酶；
(2)酶解按花生粕與水質(zhì)量比1:4 1 :8加水，加入占花生粕質(zhì)量0. 4 1%的所述粗酶，在45 55°C酶解8 15h ；85 95°C加熱15 30min滅酶終止酶解反應(yīng)，離心分離，得到花生粕酶解液；
(3)將酶解液過(guò)分子量為3000Da的超濾膜，取透過(guò)液，冷凍干燥，得粉末A；
(4)將粉末A溶于去離子水中使其濃度達(dá)到5 30 mg/mL,以去離子水為洗脫液， 采用kphadex G-25凝膠柱進(jìn)行洗脫，收集目標(biāo)峰，濃縮，冷凍干燥，得粉末B ；
(5)將粉末B溶于去離子水中使其濃度達(dá)到5 30 mg/mL,以質(zhì)量濃度0. 1-0. 2%三氟乙酸水溶液為洗脫液，采用反相C18柱進(jìn)行洗脫，收集兩個(gè)目標(biāo)峰，真空濃縮，冷凍干燥，得粉末C和D，C為呈味活性肽I，D為呈味活性肽II。上述的制備方法中，步驟(5)中反相C18柱洗脫液的檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。上述的制備方法中，呈味活性肽I為具有kr-kr-Arg-Asn-Glu-Gln-Ser-Arg所示的氨基酸序列的活性肽。上述的制備方法中，呈味活性肽II為具有Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Pro-Asp-Gly-Se r-Ser-Arg所示的氨基酸序列的活性肽。上述制備方法制得的呈味活性肽I或呈味活性肽II或它們的鈉鹽應(yīng)用于食品中， 增加食品的鮮味。其中呈味活性肽I本身具有較強(qiáng)的鮮味。呈味活性肽II是一種鮮味增強(qiáng)劑。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)結(jié)合生物發(fā)酵、生物酶解和色譜分離技術(shù)，制備出兩種新的呈味活性肽，目標(biāo)活性肽活性效果明顯，純度高。本發(fā)明的兩種新的呈味肽易于化學(xué)合成大生產(chǎn)，且合成的產(chǎn)品純度高，穩(wěn)定性好，無(wú)色，可拓寬該肽的應(yīng)用領(lǐng)域，如添加到飲料中等。


圖1為呈味活性肽I的一級(jí)結(jié)構(gòu)圖(MALDI-TOF/TOF MS)。圖2為呈味活性肽I的氨基酸序列結(jié)構(gòu)圖(MALDI-TOF/TOF MS)。圖3為呈味活性肽II的一級(jí)結(jié)構(gòu)圖(MALDI-TOF/TOF MS)。圖4為呈味活性肽II的氨基酸序列結(jié)構(gòu)圖(MALDI-TOF/TOF MS)。圖5為呈味活性肽I和呈味活性肽II存在花生粕酶解液的凝膠色譜分離樣中的反相C18高效液相色譜圖。
具體實(shí)施方案下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施作進(jìn)一步說(shuō)明。 實(shí)施例1
(1)粗酶的制備10g麩皮，5g花生粕和O.Olg氯化鈣與15g去離子水混合均勻；在殺菌鍋100°C中殺菌30min，冷卻至20°C，接種米曲霉，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h ；加入200mL水， 在30°C水浴鍋中攪拌0. 5h ；在4°C下10，000 X g離心20min，取上清液冷凍干燥得粗酶。
(2)酶解按花生粕水質(zhì)量比1 :4加水，加入花生粕質(zhì)量0. 4%的粗酶，在45°C酶解 8h ； 95°C加熱15min滅酶終止酶解反應(yīng)，離心分離，得到花生粕酶解液。(3)將酶解液過(guò)分子量為3000Da的超濾膜，取透過(guò)液，冷凍干燥，得粉末A ；
(4)將樣品A溶于去離子水中使其濃度達(dá)到5 mg/mL,以去離子水為洗脫液，采用 Sephadex G-25凝膠柱進(jìn)行洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，收集目標(biāo)峰，濃縮，冷凍干燥，得粉末 B0(5)將樣品B溶于去離子水中使其濃度達(dá)到15 mg/mL,以0. 1%三氟乙酸水溶液為洗脫液，采用反相C18柱進(jìn)行洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，收集兩個(gè)目標(biāo)峰，80°C真空濃縮，冷凍干燥，得粉末C和D。C為呈味活性肽I，D為呈味活性肽II。呈味活性肽C和呈味活性肽D的出峰次序見(jiàn)圖5。呈味活性肽I的一級(jí)結(jié)構(gòu)圖和氨基酸序列結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖1和圖2。呈味活性肽II的一級(jí)結(jié)構(gòu)圖和氨基酸序列結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖3 和圖4。
實(shí)施例2
(1)粗酶的制備30g麩皮，20g花生粕和0. Ig氯化鈣與36g去離子水混合均勻；在殺菌鍋121°C中殺菌15min，冷卻至38°C，接種米曲霉，在培養(yǎng)箱32°C培養(yǎng)48h ；加入400mL水， 在40°C水浴鍋中攪拌池；在10°C下10，000 X g離心20min，取上清液冷凍干燥得粗酶。(2)酶解按花生粕水質(zhì)量比1 :6加水，加入花生粕質(zhì)量0. 8%的粗酶，在55°C酶解 IOh ； 95°C加熱15min滅酶終止酶解反應(yīng)，離心分離，得到花生粕酶解液。(3)將酶解液過(guò)分子量為3000Da的超濾膜，取透過(guò)液，冷凍干燥，得粉末A ；
(4)將樣品A溶于去離子水中使其濃度達(dá)到30 mg/mL,以去離子水為洗脫液，采用 Sephadex G-25凝膠柱進(jìn)行洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，收集目標(biāo)峰，濃縮，冷凍干燥，得粉末 B0(5)將樣品B溶于去離子水中使其濃度達(dá)到30 mg/mL,以0. 2%三氟乙酸水溶液為洗脫液，采用反相C18柱進(jìn)行洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，收集兩個(gè)目標(biāo)峰，80°C真空濃縮，冷凍干燥，得粉末C和D。C為呈味活性肽I，D為呈味活性肽II。 實(shí)施例3
(1)粗酶的制備28g麩皮，16g花生粕和0. Ig氯化鈣與Mg去離子水混合均勻；在殺菌鍋121°C中殺菌15min，冷卻至30°C，接種米曲霉，在培養(yǎng)箱30°C培養(yǎng)Mh ；加入200mL 0.2 M磷酸鹽緩沖液(pH 7. 0)在40°C水浴鍋中攪拌Ih ；在4°C下10，000 X g離心20min，取
上清液冷凍干燥得粗酶。(2)酶解按花生粕水質(zhì)量比1 :8加水，加入花生粕質(zhì)量0. 6%的粗酶，在55°C酶解 8h ； 85°C加熱30min滅酶終止酶解反應(yīng)，離心分離，得到花生粕酶解液。(3)將酶解液過(guò)分子量為3000Da的超濾膜，取透過(guò)液，冷凍干燥，得粉末A ；
(4)將樣品A溶于去離子水中使其濃度達(dá)到20 mg/mL,以去離子水為洗脫液，采用 Sephadex G-25凝膠柱進(jìn)行洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，收集目標(biāo)峰，濃縮，冷凍干燥，得粉末 B0(5)將樣品B溶于去離子水中使其濃度達(dá)到20 mg/mL,以0. 1%三氟乙酸水溶液為洗脫液，采用反相C18柱進(jìn)行洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，收集兩個(gè)目標(biāo)峰，80°C真空濃縮，冷凍干燥，得粉末C和D。C為呈味活性肽I，D為呈味活性肽II。實(shí)施例4
在香精香料公司挑選經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的10名感官評(píng)價(jià)員(5名男性，5名女性)，感官評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)在23 士 2 °C的感官評(píng)價(jià)室進(jìn)行。鮮味的閾值評(píng)價(jià)稀釋法(dilution method)，以逐漸降低的濃度制備樣品，然后順序地檢驗(yàn)。即對(duì)感官測(cè)待測(cè)樣品進(jìn)行逐步稀釋，然后要求評(píng)價(jià)員對(duì)每個(gè)稀釋度的樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)員只需要說(shuō)明在哪個(gè)稀釋度下仍然能品嘗到鮮味，而在最大稀釋度下品嘗到鮮味的濃度就是鮮味的閾值。鮮味增強(qiáng)評(píng)價(jià)(以下均為重量百分比)選用含有0. 5%味精和0. 5%食鹽的牛肉湯的鮮味作為鮮味標(biāo)準(zhǔn)，打分為1 ；選用含有1%味精和0. 5%食鹽的牛肉湯的鮮味作為鮮味標(biāo)準(zhǔn)，打分為2 ；選用含有洲味精和0. 5%食鹽的牛肉湯的鮮味作為鮮味標(biāo)準(zhǔn)，打分為4 ；0. 5% 的待測(cè)樣品添加到含有0. 5%食鹽的牛肉湯溶液中，與標(biāo)準(zhǔn)品的鮮味比較進(jìn)行打分。結(jié)果見(jiàn)表1.
權(quán)利要求
1.呈味活性肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)粗酶的制備10 30g麩皮，5 20g花生粕和0.01 0. Ig氯化鈣與15 50g去離子水混合均勻；在殺菌鍋100 121°C中殺菌15 30min，冷卻至20_38°C，接種米曲霉， 在培養(yǎng)箱觀 321培養(yǎng)48 72h ；加入200mL-400mL水，在30-40°C水浴鍋中攪拌0. 5-2h ； 在4-10°C下5000 10，000 X g離心20 30min，取上清液冷凍干燥得粗酶；(2)酶解按花生粕與水質(zhì)量比1:4 1 :8加水，加入占花生粕質(zhì)量0. 4 1%的所述粗酶，在45 55°C酶解8 15h ；85 95°C加熱15 30min滅酶終止酶解反應(yīng)，離心分離，得到花生粕酶解液；(3)將酶解液過(guò)分子量為3000Da的超濾膜，取透過(guò)液，冷凍干燥，得粉末A；(4)將粉末A溶于去離子水中使其濃度達(dá)到5 30 mg/mL,以去離子水為洗脫液， 采用kphadex G-25凝膠柱進(jìn)行洗脫，收集目標(biāo)峰，濃縮，冷凍干燥，得粉末B ；(5)將粉末B溶于去離子水中使其濃度達(dá)到5 30 mg/mL,以質(zhì)量濃度0. 1-0. 2%三氟乙酸水溶液為洗脫液，采用反相C18柱進(jìn)行洗脫，收集兩個(gè)目標(biāo)峰，真空濃縮，冷凍干燥，得粉末C和D，C為呈味活性肽I，D為呈味活性肽II。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(5)中反相C18柱洗脫液的檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。
3.由權(quán)利要求1所述制備方法制得的一種呈味活性肽，其特征在于，呈味活性肽I為具有kr-kr-Arg-Asn-Glu-Gln-Ser-Arg所示的氨基酸序列的活性肽。
4.由權(quán)利要求1所述制備方法制得的一種呈味活性肽，其特征在于，呈味活性肽II為具有 Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Pro-Asp-Gly-Ser-Ser-Arg 所示的氨基酸序列的活性肽。
5.權(quán)利要求1制得的呈味活性肽I或呈味活性肽II或它們的鈉鹽應(yīng)用于食品中，增加食品的鮮味。
全文摘要
本發(fā)明提供呈味活性肽及其制備方法與應(yīng)用，制備方法包括粗酶的制備；通過(guò)酶解得到花生粕酶解液；將酶解液過(guò)分子量為3000Da的超濾膜，取透過(guò)液，冷凍干燥，得粉末A；將粉末A溶于去離子水中，以去離子水為洗脫液，采用SephadexG-25凝膠柱進(jìn)行洗脫，收集目標(biāo)峰，濃縮，冷凍干燥，得粉末B；將粉末B溶于去離子水中，以質(zhì)量濃度0.1-0.2%三氟乙酸水溶液為洗脫液，采用反相C18柱進(jìn)行洗脫，收集兩個(gè)目標(biāo)峰，真空濃縮，冷凍干燥，得粉末C和D，C為呈味活性肽Ⅰ，D為呈味活性肽Ⅱ。兩條呈味活性肽應(yīng)用于調(diào)味產(chǎn)品中，可明顯增強(qiáng)調(diào)味品的呈味效果。通過(guò)化學(xué)合成，可以拓寬呈味肽的應(yīng)用領(lǐng)域。
文檔編號(hào)A23L1/226GK102396688SQ20111034021
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月2日
發(fā)明者任嬌艷, 崔春, 蘇國(guó)萬(wàn), 趙謀明 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)