專利名稱：一種快速高效提取飲用水中總dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種從飲用水提取總DNA的系列方法集成，更具體的說是從飲用水提取總DNA中快速高效提取總DNA的方法。
背景技術(shù)：
飲用水安全與人類健康息息相關(guān)，研究報(bào)導(dǎo)飲用水中微生物的群落結(jié)構(gòu)、行為歸趨與眾多疾病的發(fā)生有著密不可分的關(guān)系，其健康風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。而從總DNA水平上對飲用水中微生物的研究是眾多重要分析手段之一。消毒后的飲用水生物量極低，傳統(tǒng)的過濾濃縮方式難以提取到有效濃度的總DNA。 在以往的研究中，研究者常常用其他間接方式獲取飲用水中總DNA，如采集飲用水儲存池， 管道、水龍頭、水表中的生物膜(Hong, P. Y.，Hwang, C. C.，Ling, F. Q.，Andersen, G. L. , LeChevallier, Μ. W. , and Liu, W. Τ. 2010. Pyrosequencing analysis of bacterial biofilm communities in water meters of a drinking water distribution system. App 1. Environ. Microbiol. 76，5631-5635.)，或者利用自制的生物膜收集裝置來獲得生物膜 Schwartz, Τ.，Kohnen, W.，Jansen, B.，Obst, U.，2003. Detection of antibiotic-resistant bacteria and their resistance genes in wastewater, surface water, and drinking water biofilms. Ferns. Microbiol. Ecol. 43, 325-335.)。這些方法確實(shí)能獲取環(huán)境樣品中的總DNA，但同時(shí)也存在一系列問題。生物膜形成過程中其微生物群落結(jié)構(gòu)，功能形態(tài)不可避免的將發(fā)生改變 (Stoodley, P. , Sauer, K. , Davies, D. G. , Costerton, J. W. , 2002. Biofilms as complex differentiated communities. Annu. Rev. Microbiol. 56, 187-209·),其不足以確切地反映飲用水中微生物的真實(shí)情況。同時(shí)生物膜形成時(shí)間較長(Kalmbach，S., Manz, W. , Szewzyk, U. , 1997. Dynamics of biofilm formation in drinking water: Phylogenetic affiliation and metabolic potential of single cells assessed by formazan reduction and in situ hybridization. Ferns. Microbiol. Ecol. 22, 265-279.)，難以在短時(shí)間內(nèi)快速獲得總DNA樣品。

發(fā)明內(nèi)容
1.發(fā)明要解決的技術(shù)問題
針對現(xiàn)在無法直接從飲用水中提取到總DNA，或者提取方法存在速度慢，準(zhǔn)確性差的情況，本發(fā)明提供一種快速高效提取飲用水中總DNA的方法，采用一系列方法解決從樣品采集到總DNA提取的問題，可以提高總DNA提取的速度和效率，為后續(xù)在總DNA水體上進(jìn)行研
究奠定了基礎(chǔ)。2.本發(fā)明的技術(shù)方案
本發(fā)明的具體實(shí)行方案及簡單原理如下 一種快速高效提取飲用水中總DNA的方法，其步驟為第一步采樣及樣品前處理。首先選取合適的采樣點(diǎn)，要求出水水質(zhì)達(dá)標(biāo)，水中無明顯顆粒狀雜質(zhì)，水壓正常。 打開取樣口水龍頭，常速空放5分鐘，去除水管中滯留的死水，然后用酒精燈灼燒水龍頭， 殺滅水龍頭附近的細(xì)菌。在滅菌的水龍頭上安裝一種家庭型凈水器(型號=Torayvino MK2-EG)，安裝方法根據(jù)不同類型水龍頭而不同，具體可參照該凈水器的說明書。安裝完成后，打開水龍頭，讓水從該凈水器的濾芯出水口出水，開始計(jì)時(shí)濾水，直至該濾芯被徹底堵住后方取下，根據(jù)水壓不同濾水時(shí)間一般為M-36小時(shí)，過濾水總量在1500-2000升。而直接用普通真空泵和 0. 45微米濾膜過濾最大水量在8-10升(視水質(zhì)情況而有所不同)，此種濾水方式極大提高了濾水的速度和體積。過濾完成后及時(shí)將凈水器關(guān)閉取下，卸下濾芯，用鋼鋸將濾芯前端查看窗部位打開，取出里面多層的中空絲膜，放置到滅菌的500毫升燒杯中，加入200毫升超純水，輕輕震蕩讓中空絲膜均勻散落在燒瓶中。然后將燒杯放置于超聲波清洗機(jī)中超聲振蕩20分鐘(型號KuDos HK3310HP ；頻率53Khz)，超聲后將每100毫升水在0. 98兆帕大氣壓下過0. 45微米醋酸纖維酯濾膜，濾膜放置4度冰箱留作下一步使用。第二步飲用水中總DNA提取。飲用水中總DNA的提取采用的是MP Biomedicals公司的FastDNA @ SPIN Kit for Soil。首先將濾膜盡量剪碎，將碎片裝入到2毫升的樣品裂解管，按照該試劑盒的操作指南做如下處理，本步驟采用的離心機(jī)型號均Eppendorf centrifuge 5424。(1)在樣品裂解管中加入978微升磷酸鹽緩沖液和122微升MT緩沖液。(2)用研磨珠均質(zhì)器(型號=BioSpec Beadbeater-I)在4800轉(zhuǎn)/分鐘條件下裂解90秒，徹底破碎微生物細(xì)胞。(3)將樣品裂解管在14000 g轉(zhuǎn)速下離心15分鐘。(4)將離心后管內(nèi)的上清液轉(zhuǎn)移到新的2. 0毫升離心管中，加入250微升蛋白沉淀溶液，充分振蕩2分鐘。(5) 14000g下再次離心5分鐘去除沉淀，將上清液全部轉(zhuǎn)移到干凈的15毫升離心管中。(6 )將一種能結(jié)合DNA溶液振蕩搖勻后，加1毫升該溶液到15毫升離心管中。(7)用渦旋振蕩器振蕩離心管2分鐘后將離心管放在支架上靜止3分鐘，讓溶液中的二氧化硅顆粒沉淀。(8)去除500微升上清液。(9)將離心管中剩下的混合物重新混勻，取600微升溶液到離心過濾柱上， 14000g離心1分鐘后，去除收集管中的液體。重復(fù)上述過程，繼續(xù)將剩下的混合物加入到過濾柱上離心。(10)加500微升的SEWS-M溶液到離心柱中，用移液槍輕輕吹打溶液，將里面混合物徹底混勻。(11) 14000g離心1分鐘，丟棄收集管中液體。(12)不加入任何試劑，14000g離心2分鐘，去除離心柱中殘留的乙醇，丟棄原收
集管，換上一個(gè)新的干凈的1. 5毫升離心管。
(13)將離心柱在室溫下空氣干燥5分鐘。(14)先加入50微升55度預(yù)熱的無菌水到離心柱中，用移液槍輕輕攪動，若溶解不完全，則在加入10微升無菌水?dāng)噭?，直至離心柱中二氧化硅全部成熔融狀態(tài)。(15)將離心柱放置55度烘箱中加熱5分鐘。(16) 14000g離心1分鐘后，離心管中收集到得液體即提取所得飲用水中總DNA， 零下20度保存。在完成上述兩步后，可以進(jìn)行總DNA濃度和純度鑒定。總DNA濃度和純度鑒定可采用分光光度法和瓊脂糖電泳法。具體方法和步驟如下
分光光度法
在沈0納米波長下的吸光度值可以定量總DNA的濃度，A^0/A280指示總DNA的純度。 本發(fā)明用分光光度法測定飲用水中總DNA濃度和純度所用儀器為Bio-tek公司的多功能酶標(biāo)儀(型號=Synergy H4)。操作步驟如下
(1)開啟電腦及多功能酶標(biāo)儀預(yù)熱10分鐘。(2)加2微升無菌水到Take3 超微量檢測板上，作為陰性對照。然后取2微升總 DNA樣品加到其他孔上面，待測定。(3)打開多功能酶標(biāo)儀軟件Gen5 (版本號1. 10. 8)，測定飲用水中總DNA濃度和純度。瓊脂糖電泳法
瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的，并可根據(jù)電泳條件情況對提取所得DNA樣品進(jìn)行定性及相對定量分析，具體操作步驟如下
(1)稱取適量的0. 4克瓊脂糖粉末，放到一個(gè)錐形瓶中，加入適量的IXTBE電泳緩沖液 40毫升。然后加熱至完全溶化，溶液透明。稍搖勻，得膠液。冷卻至60°C左右，在膠液內(nèi)加入適量的2微升溴化乙錠至濃度為0. 5微克/毫升。(2)水平放置膠槽，在一端插好梳子，在槽內(nèi)緩慢倒入已冷至60度左右的膠液，使之形成均勻水平的膠面。(3)待膠凝固后，小心拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內(nèi)。(4)在槽內(nèi)加入1 XTBE電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面。(5)用1微升Loading Buffer (0. 25%溴酚藍(lán)和無菌蔗糖)與5微升的總DNA樣品混勻制樣，用移液槍將總DNA樣品加入上樣孔中。同時(shí)設(shè)DNA marker和陰性對照泳道。(6)接通電泳儀和電泳槽，并接通電源，調(diào)節(jié)穩(wěn)壓輸出為120伏，電泳時(shí)間20分鐘。(7)將凝膠放在在凝膠成像儀的樣品臺上，趕去氣泡平鋪。關(guān)上樣品室外門，打開紫外燈(波長2M納米)，通過電腦攝像進(jìn)行觀察。根據(jù)以上兩種方法即可判定提取的飲用水中的總DNA的濃度、純度以及完整性等情況。3.有益效果
本發(fā)明提供了一種提取飲用水中總DNA的方法，快速高效是本發(fā)明方法最顯著的優(yōu)點(diǎn)，從樣品采集到提取鑒定完畢，總共時(shí)間為2-3天。而如背景技術(shù)文獻(xiàn)中所述，傳統(tǒng)的飲用水中生物膜形成最少需要30天。相比以前的提取方法，本發(fā)明方法提取出的總DNA濃度高，純度好，具有良好的可應(yīng)用性。


圖1為Torayvino MK2-EG凈水器過濾實(shí)驗(yàn)室飲用水示意圖2為Torayvino MK2-EG凈水器過濾北河口水廠消毒5分鐘后飲用水示意圖； 圖3為循環(huán)水式真空泵抽濾裝置圖； 圖4為實(shí)施例1和實(shí)施例2得到的飲用水總DNA電泳圖。圖5為PCR擴(kuò)增飲用水中總DNA的16S rDNA片段電泳圖。
具體實(shí)施例方式為了更好的闡述本發(fā)明方法提取飲用水中總DNA的步驟和效果，結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，具體如下
實(shí)施例1
第一步采樣及樣品前處理
(1)本實(shí)例選擇了實(shí)驗(yàn)室自來水作為取樣點(diǎn)，要求出水水質(zhì)達(dá)標(biāo)，水中無明顯顆粒狀雜質(zhì)，水壓正常。打開取樣口水龍頭，常速空放5分鐘，去除水管中滯留的死水，然后用酒精燈灼燒水龍頭，殺滅水龍頭附近的細(xì)菌；在滅菌的泡沫套型水龍頭上安裝一種家庭型凈水器 Torayvino MK2-EG，根據(jù)該凈水器安裝指南所示，選擇B型外螺旋泡沫套。首先從主機(jī)上取下安裝用螺母和固定環(huán)，取下水龍頭的泡沫套，再將安裝用螺母穿過水龍頭，用扳手將泡沫套垂直擰進(jìn)水龍頭，最后擰緊安裝用螺母，固定主機(jī)后即安裝完成。然后打開水龍頭，讓水從該凈水器的濾芯出水口出水，開始計(jì)時(shí)濾水，直至該濾芯被徹底堵住后方取下，如圖1所示
(2)過濾36小時(shí)后，取下凈水器中的中空絲膜，放置到滅菌的500毫升燒杯中，加入 200毫升超純水，輕輕震蕩讓中空絲膜均勻散落在燒瓶中。然后將燒杯放置于超聲波清洗機(jī)中超聲振蕩20分鐘(型號KuDos HK3310HP ；頻率53Khz)，超聲后將每100毫升水在0. 98 兆帕大氣壓下過0. 45微米醋酸纖維酯濾膜，濾膜放置4度冰箱留作下一步使用。如圖2所示
第二步飲用水中總DNA提取。飲用水中總DNA的提取采用的是MP Biomedicals公司的FastDNA @ SPIN Kit for Soil。首先將濾膜盡量剪碎，將碎片裝入到2毫升的樣品裂解管，按照該試劑盒的操作指南做如下處理，本步驟采用的離心機(jī)型號均Eppendorf centrifuge 5424。(1)在樣品裂解管中加入978微升磷酸鹽緩沖液和122微升MT緩沖液。(2)用研磨珠均質(zhì)器(型號=BioSpec Beadbeater-I)在4800轉(zhuǎn)/分鐘條件下裂解 90秒，徹底破碎微生物細(xì)胞。(3)將樣品裂解管在14000 g轉(zhuǎn)速下離心15分鐘
(4)將離心后管內(nèi)的上清液轉(zhuǎn)移到新的2. O毫升離心管中，加入250微升蛋白沉淀溶液，充分振蕩2分鐘。
(5) 14000g下再次離心5分鐘去除沉淀，將上清液全部轉(zhuǎn)移到干凈的15毫升離心管中。(6)將一種能結(jié)合DNA溶液振蕩搖勻后，加1毫升該溶液到15毫升離心管中。(7)用渦旋振蕩器振蕩離心管2分鐘后將離心管放在支架上靜止3分鐘，讓溶液中的二氧化硅顆粒沉淀。(8)去除500微升上清液。(9)將離心管中剩下的混合物重新混勻，取600微升溶液到離心過濾柱上，14000g 離心1分鐘后，去除收集管中的液體。重復(fù)上述過程，繼續(xù)將剩下的混合物加入到過濾柱上離心。(10)加500微升的SEWS-M溶液到離心柱中，用移液槍輕輕吹打溶液，將里面混合物徹底混勻。(11) 14000g離心1分鐘，丟棄收集管中液體。(12)不加入任何試劑，14000g離心2分鐘，去除離心柱中殘留的乙醇，丟棄原收集管，換上一個(gè)新的干凈的1. 5毫升離心管。(13)將離心柱在室溫下空氣干燥5分鐘。(14)先加入50微升55度預(yù)熱的無菌水到離心柱中，用移液槍輕輕攪動，若溶解不完全，則在加入10微升無菌水?dāng)噭?，直至離心柱中二氧化硅全部成熔融狀態(tài)。(15)將離心柱放置55度烘箱中加熱5分鐘。(16) 14000g離心1分鐘后，離心管中收集到得液體即提取所得飲用水中總DNA， 零下20度保存。第三步總DNA濃度和純度鑒定。采用瓊脂糖電泳法。具體方法和步驟如下
(1)稱取適量的0. 4克瓊脂糖粉末，放到一個(gè)錐形瓶中，加入適量的IXTBE電泳緩沖液 40毫升。然后加熱至完全溶化，溶液透明。稍搖勻，得膠液。冷卻至60°C左右，在膠液內(nèi)加入適量的2微升溴化乙錠至濃度為0. 5微克/毫升。(2)水平放置膠槽，在一端插好梳子，在槽內(nèi)緩慢倒入已冷至60度左右的膠液，使之形成均勻水平的膠面。(3)待膠凝固后，小心拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內(nèi)。(4)在槽內(nèi)加入1 XTBE電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面。(5)用1微升Loading Buffer (0. 25%溴酚藍(lán)和無菌蔗糖)與5微升的總DNA樣品混勻制樣，用移液槍將總DNA樣品加入上樣孔中。同時(shí)設(shè)DNA marker和陰性對照泳道。(6)接通電泳儀和電泳槽，并接通電源，調(diào)節(jié)穩(wěn)壓輸出為120伏，電泳時(shí)間20分鐘。(7)將凝膠放在在凝膠成像儀的樣品臺上，趕去氣泡平鋪。關(guān)上樣品室外門，打開紫外燈(波長2M納米)，通過電腦攝像進(jìn)行觀察。用瓊脂糖電泳法定性檢測提取效果，電泳圖如圖3所示，其中標(biāo)準(zhǔn)品DL2000和 λ -Hind III均是TaKaRa公司產(chǎn)品，Dffl和DW2為實(shí)驗(yàn)室水龍頭出水提取總DNA所得。經(jīng)Bio-tek公司Synergy H4酶標(biāo)儀測定總DNA濃度和純度，具體測定數(shù)據(jù)如下表 1所示
表1 飲用水中總DNA濃度及純度
權(quán)利要求
1.一種快速高效提取飲用水中總DNA的方法，其步驟為第一步采樣及樣品前處理在滅菌的水龍頭上安裝凈水器，打開水龍頭，讓水質(zhì)達(dá)標(biāo)的飲用水從凈水器的濾芯出水口出水，開始計(jì)時(shí)濾水，直至該濾芯被徹底堵住后方取下；過濾完成后及時(shí)將凈水器關(guān)閉取下，卸下濾芯，取出里面多層的中空絲膜，放置到滅菌的燒杯中，加入超純水，輕輕震蕩讓中空絲膜均勻散落在燒瓶中；然后將燒杯放置于超聲波清洗機(jī)中超聲振蕩，超聲后將水在0. 98兆帕大氣壓下過 0. 45微米醋酸纖維酯濾膜；第二步飲用水中總DNA提取將濾膜盡量剪碎，將碎片裝入到樣品裂解管，進(jìn)行如下處理(1)在樣品裂解管中加入978微升磷酸鹽緩沖液和122微升MT緩沖液；(2)用研磨珠均質(zhì)器在4800轉(zhuǎn)/分鐘條件下裂解90秒，徹底破碎微生物細(xì)胞；(3)將樣品裂解管在14000g轉(zhuǎn)速下離心15分鐘；(4)將離心后管內(nèi)的上清液轉(zhuǎn)移到新的2.0毫升離心管中，加入250微升蛋白沉淀溶液，充分振蕩2分鐘；(5)14000g下再次離心5分鐘去除沉淀，將上清液全部轉(zhuǎn)移到干凈的15毫升離心管中；(6)將一種能結(jié)合DNA溶液振蕩搖勻后，加1毫升該溶液到15毫升離心管中；(7)用渦旋振蕩器振蕩離心管2分鐘后將離心管放在支架上靜止3分鐘，讓溶液中的二氧化硅顆粒沉淀；(8)去除500微升上清液；(9)將離心管中剩下的混合物重新混勻，取600微升溶液到離心過濾柱上，14000g離心1分鐘后，去除收集管中的液體；重復(fù)上述過程，繼續(xù)將剩下的混合物加入到過濾柱上離心；(10)加500微升的SEWS-M溶液到離心柱中，用移液槍輕輕吹打溶液，將里面混合物徹底混勻；(11)14000g離心1分鐘，丟棄收集管中液體；(12)不加入任何試劑，14000g離心2分鐘，去除離心柱中殘留的乙醇，丟棄原收集管， 換上一個(gè)新的干凈的1. 5毫升離心管；(13)將離心柱在室溫下空氣干燥5分鐘；(14)先加入50微升55度預(yù)熱的無菌水到離心柱中，用移液槍輕輕攪動，若溶解不完全，則在加入10微升無菌水?dāng)噭?，直至離心柱中二氧化硅全部成熔融狀態(tài)；(15)將離心柱放置55度烘箱中加熱5分鐘；(16)14000g離心1分鐘后，離心管中收集到得液體即提取所得飲用水中總DNA，零下 20度保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高效提取飲用水中總DNA的方法，其特征在于第一步采樣及樣品前處理中首先選取合適的采樣點(diǎn)，要求出水水質(zhì)達(dá)標(biāo)，水中無明顯顆粒狀雜質(zhì)，水壓正常；打開取樣口水龍頭，常速空放5分鐘，去除水管中滯留的死水，然后用酒精燈灼燒水龍頭，殺滅水龍頭附近的細(xì)菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高效提取飲用水中總DNA的方法，其特征在于第一步采樣及樣品前處理中在滅菌的水龍頭上安裝一種家庭型凈水器Torayvino MK2-EG，安裝完成后，打開水龍頭，讓水從該凈水器的濾芯出水口出水，開始計(jì)時(shí)濾水，直至該濾芯被徹底堵住后方取下，根據(jù)水壓不同濾水時(shí)間一般為M-36小時(shí)，過濾水總量在1500-2000升。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速高效提取飲用水中總DNA的方法，屬于飲用水中總DNA抽提與純化技術(shù)領(lǐng)域。針對飲用水中微生物量極低、傳統(tǒng)的過濾濃縮方式難以提取到有效濃度的總DNA、復(fù)雜環(huán)境介質(zhì)影響抽提的DNA純度等問題。其步驟為通過凈水裝置過濾飲用水中微生物；采用超聲將微生物從濾料上洗脫；用濾膜過濾洗脫液；直接用物理研磨和化學(xué)裂解相結(jié)合的方法抽提濾膜上微生物的總DNA。最后用無水乙醇洗滌，晾干后溶于超純水或緩沖液中。本方法經(jīng)濟(jì)、方便、穩(wěn)定，抽提獲得的DNA濃度和純度較高，為環(huán)境分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用提供了新方法。
文檔編號C12N15/10GK102382818SQ20111033983
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月1日
發(fā)明者吳兵, 張徐祥, 施鵬, 李愛民, 程樹培, 賈舒宇, 馬黎萍 申請人:南京大學(xué)