專利名稱：嵌合外源無關(guān)序列的核酸質(zhì)控的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)方法進(jìn)行微生物(病毒、細(xì)菌、支原體和真菌等)的檢測(cè)領(lǐng)域，具體是一整套制備和合成嵌合外源無關(guān)序列DNA或RNA質(zhì)控的技術(shù)方法。
背景技術(shù)：
基于基于核酸的分子生物學(xué)檢測(cè)方法或檢測(cè)試劑盒都需要通過添加標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)控樣品，用以檢驗(yàn)檢測(cè)過程的有效性，但是，全部來源于檢測(cè)對(duì)象的標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品的添加往往會(huì)對(duì)檢測(cè)反應(yīng)帶來潛在的污染和判讀的干擾。目前用于分子診斷試劑盒中的主要質(zhì)控樣品主要是具有感染活性的病毒血清，如王露楠等制備的丙型肝炎病毒標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控用HCV RNA陰性血漿將陽性血漿稀釋至含量約300 000拷貝數(shù)/mL，然后進(jìn)行真空冷凍干燥.檢測(cè)方法采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)方法和羅氏公司的PCR內(nèi)標(biāo)定量方法。該法制備的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品具有感染活性，容易導(dǎo)致病毒的擴(kuò)散和傳播。Satoshi Inoue等制備的用于炭疽桿菌分子診斷中的質(zhì)控樣品，在質(zhì)控DNA中引入EcoRV和BamH I兩個(gè)酶切位點(diǎn)用于鑒別是否由于質(zhì)控的污染而導(dǎo)致的假陽性擴(kuò)增(Satoshi Inoue, 2004)。更為精湛的質(zhì)控核酸的制備方法來自Laetitia Ninove在2011年發(fā)表的論文使用人工合成的含有T7啟動(dòng)子引物、NotI酶切位點(diǎn)、檢測(cè)引物(探針)序列和病毒基因序列的質(zhì)控DNA (RNA)序列用于各類分子檢測(cè)方法的外源性質(zhì)控(Laetitia Ninove, 2011)。后兩者的共同之處是，制備的質(zhì)控樣品均無感染性，但是均主要嵌合的是檢測(cè)對(duì)象本身(或類似)的核酸序列和廣2個(gè)常見的酶切位點(diǎn)來鑒別檢測(cè)結(jié)果中的假陽性和真陽性，鑒別精度低、鑒別反應(yīng)復(fù)雜。本發(fā)明通過在無關(guān)序列(質(zhì)粒載體序列或人工隨機(jī)序列)的兩側(cè)，通過基因克隆法或化學(xué)合成法添加待測(cè)微生物特異性引物序列，然后利用PCR克隆的辦法獲得嵌合無關(guān)序列的DNA質(zhì)控，進(jìn)一步利用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)即可獲得可以作為檢測(cè)試劑盒的RNA質(zhì)控。本發(fā)明制備的核酸質(zhì)控均含有一段和檢測(cè)對(duì)象完全無關(guān)的基因序列，在后續(xù)的陽性排查中，使用一個(gè)針對(duì)無關(guān)序列的PCR反應(yīng)即可鑒別檢測(cè)結(jié)果中的假陽性和真陽性。在陰性對(duì)照正常的條件下，核酸質(zhì)控樣品的陽性擴(kuò)增，指征檢測(cè)反應(yīng)的有效和正確。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于PCR檢測(cè)的DNA質(zhì)控和一種用于RT-PCR檢測(cè)的RNA 質(zhì)控。為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案(1)無關(guān)序列來源及選擇包括方法I或方法II，當(dāng)檢測(cè)反應(yīng)為基于產(chǎn)物長度時(shí)選用方法I，當(dāng)方法I不能滿足實(shí)際需要，特別是檢測(cè)反應(yīng)為taqman實(shí)時(shí)定量PCR或類似中間含探針的檢測(cè)反應(yīng)時(shí)選用方法II。所述方法I 從現(xiàn)有的質(zhì)粒載體上選取一段DNA序列，用生物學(xué)軟件分析該DNA序列的GC含量和二級(jí)構(gòu)象，滿足如下條件的DNA序列選用為無關(guān)序列I :a)無關(guān)序列I與待檢測(cè)微生物的同源性低于5%，b) GC含量在45% 55%之間，c) 二級(jí)結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，d)平均 TM值在60°C 85°C之間。
所述方法II 采用化學(xué)法合成一段無關(guān)序列II，滿足無關(guān)序列II和待檢測(cè)微生物無同源性。(2)引物的設(shè)計(jì)
利用引物設(shè)計(jì)的一般原理針對(duì)步驟(1)方法I中所述無關(guān)序列I和待檢測(cè)微生物分別設(shè)計(jì)一對(duì)無關(guān)序列I引物和一對(duì)待檢測(cè)微生物特異性引物I，在無關(guān)序列I引物的上游和無關(guān)序列I引物的下游的5'端分別加入待檢測(cè)微生物特異性引物I上游和待檢測(cè)微生物特異性引物I下游，得到一對(duì)嵌合引物。用引物設(shè)計(jì)的一般原則針對(duì)待檢測(cè)微生物設(shè)計(jì)一對(duì)待檢測(cè)微生物特異性引物II 和待檢測(cè)微生物探針，還需要針對(duì)無關(guān)序列II設(shè)計(jì)一對(duì)無關(guān)序列II引物；合成一段從5' 端到3'端依次是待檢測(cè)微生物上游引物II、無關(guān)序列II、待檢測(cè)微生物探針、無關(guān)序列II、 待檢測(cè)微生物下游引物II的DNA片段。(3) PCR 擴(kuò)增
用步驟(2 )中所述嵌合引物，PCR擴(kuò)增步驟(1)方法I所述現(xiàn)有的質(zhì)粒載體，獲得雙鏈 DNA序列產(chǎn)物I 產(chǎn)物I從5'端到3'端依次是待檢測(cè)微生物上游引物I、無關(guān)序列I上游引物、無關(guān)序列I、無關(guān)序列I下游引物和待檢測(cè)微生物下游引物I。用步驟(2)中所述待檢測(cè)微生物特異性引物II PCR擴(kuò)增步驟(2)所述DNA片段，獲得雙鏈DNA序列產(chǎn)物II 從5'端到3'端依次是待檢測(cè)微生物上游引物序列II、無關(guān)序列 II上游引物、無關(guān)序列II、待檢測(cè)微生物探針、無關(guān)序列II、無關(guān)序列II下游引物、待檢測(cè)微生物下游引物II。(4)克隆
瓊脂糖電泳PCR產(chǎn)物，使用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物I或產(chǎn)物II，在分光光度計(jì)法定量后，TA連接產(chǎn)物I或產(chǎn)物II到pGEM-T載體上，通過抗性篩選，PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，獲得陽性轉(zhuǎn)化子pGEM-T-產(chǎn)物I或pGEM-T-產(chǎn)物II，即所需的DNA質(zhì)控I或DNA質(zhì)控II ；將DNA質(zhì)控I 或DNA質(zhì)控II轉(zhuǎn)化并保存于大腸桿菌工程菌中。(5)體外轉(zhuǎn)錄和純化
將pGEM-T-產(chǎn)物I或pGEM-T-產(chǎn)物II經(jīng)過單酶切進(jìn)行線性化，酶切位點(diǎn)位于插入基因外，利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外RNA的合成，獲得RNA質(zhì)控I或RNA質(zhì)控II。純化步驟為a)補(bǔ)充無RNAse酶滅菌水至100 μ L，然后加入900 μ L TriPure Isolation Reagent，振蕩混勻，室溫靜置5 min，加入200 μ L氯仿，震蕩60 s，然后于4°C， 12000 r/min高速離心15 min ;2)取500 μ L上清液，并加入等體積異丙醇室溫靜置30 min, 12000 r/min高速離心15 min，棄去上清，用75%乙醇洗滌1次；3)然后加入1 mL 75%乙醇，保存于-80°C冰箱或液氮。上述方法適用于分子診斷或檢測(cè)試劑盒核酸質(zhì)控品的生產(chǎn)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明所制備的DNA質(zhì)控和RNA質(zhì)控和常規(guī)技術(shù)制備的質(zhì)控相比，具有反應(yīng)活性良好、并能和實(shí)驗(yàn)室污染進(jìn)行鑒別的能力，可以應(yīng)用于分子生物學(xué)檢測(cè) (診斷)試劑盒質(zhì)控(對(duì)照)品的制備。


圖1核酸質(zhì)控的合成方法示意圖；圖中1-待檢測(cè)微生物上游引物序列；2-待檢測(cè)微生物下游引物序列；3-待檢測(cè)微生物探針序列；4-無關(guān)DNA序列上游引物；5-無關(guān)DNA序列下游引物；6-來源于pUC18載體的無關(guān)DNA序列；7-人工合成的無關(guān)隨機(jī)DNA序列；8-來源于pGEM_T載體的無關(guān)DNA序列。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1，參見圖1嵌合外源無關(guān)序列的核酸質(zhì)控的制備示意圖，當(dāng)檢測(cè)反應(yīng)為基于產(chǎn)物長度的采用方法I ；當(dāng)方法I不能滿足實(shí)際需要，特別是檢測(cè)反應(yīng)為taqman實(shí)時(shí)定量PCR或類似中間含探針的檢測(cè)反應(yīng)時(shí)，采用方法II。( 1)無關(guān)序列來源的選擇
所述方法I 無關(guān)序列來自于現(xiàn)有的質(zhì)粒載體，如pUC18、pET30等。從現(xiàn)有的質(zhì)粒載體上選取一段DNA序列，用生物學(xué)軟件分析該DNA序列的GC含量和二級(jí)構(gòu)象，滿足如下條件的DNA序列選用為無關(guān)序列I :a)無關(guān)序列I與待檢測(cè)微生物的同源性低于5%，b)GC 含量在45% 55%之間，c) 二級(jí)結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單(70%區(qū)域不存在二級(jí)結(jié)構(gòu))，d)平均TM值在 60V 85°C之間；
所述方法II 采用化學(xué)法合成一段無關(guān)序列II，滿足無關(guān)序列II和待檢測(cè)微生物無同源性；
(2)引物的設(shè)計(jì)
利用引物設(shè)計(jì)的一般原理針對(duì)步驟(1)方法I中所述無關(guān)序列I和待檢測(cè)微生物分別設(shè)計(jì)一對(duì)無關(guān)序列I引物和一對(duì)待檢測(cè)微生物特異性引物I，在無關(guān)序列I引物的上游和無關(guān)序列I引物的下游的5'端分別加入待檢測(cè)微生物特異性引物I上游和待檢測(cè)微生物特異性引物I下游，得到一對(duì)嵌合引物。擴(kuò)增產(chǎn)物長度在80bp 1000bp，具體長度根據(jù)不同的檢測(cè)需要而設(shè)定。若使用相同的待檢測(cè)微生物特異性引物分別對(duì)核酸質(zhì)控和病原微生物進(jìn)行檢測(cè)，若兩者的產(chǎn)物在長度上有一定的差異(3(Tl00bp均可)，可以直接分辨是否是假陽性；若兩者的產(chǎn)物長度完全一致，則需要使用針對(duì)無關(guān)基因設(shè)計(jì)的上下游引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行一個(gè)檢測(cè)，以鑒別是否為假陽性擴(kuò)增。用引物設(shè)計(jì)的一般原則針對(duì)待檢測(cè)微生物設(shè)計(jì)一對(duì)待檢測(cè)微生物特異性引物II 和待檢測(cè)微生物探針，還需要針對(duì)無關(guān)序列II設(shè)計(jì)一對(duì)無關(guān)序列II引物，產(chǎn)物長度在80 bp 以上(可以在合適的電泳系統(tǒng)中分辨即可)。采用化學(xué)法合成一段從5'端到3'端依次是待檢測(cè)微生物上游引物II、無關(guān)序列II、待檢測(cè)微生物探針、無關(guān)序列II、待檢測(cè)微生物下游引物II的DNA片段。待檢測(cè)微生物探針5’端到待檢測(cè)微生物上游引物II 3’端的距離在 5^50bp之間。無關(guān)序列II的上游引物5’端可以和待檢測(cè)微生物上游引物II的3’端可以有 5、個(gè)堿基的重合。無關(guān)隨機(jī)序列和待檢測(cè)微生物基因序列無明顯相似性。(3) PCR 擴(kuò)增
用步驟(2 )中所述嵌合引物，PCR擴(kuò)增步驟(1)方法I所述現(xiàn)有的質(zhì)粒載體，獲得雙鏈 DNA序列產(chǎn)物I 產(chǎn)物I從5'端到3'端依次是待檢測(cè)微生物上游引物I、無關(guān)序列I上游引物、無關(guān)序列I、無關(guān)序列I下游引物和待檢測(cè)微生物下游引物I ；
用步驟(2)中所述待檢測(cè)微生物特異性引物II PCR擴(kuò)增步驟(2)所述DNA片段，獲得雙鏈DNA序列產(chǎn)物II -JA 5'端到3'端依次是待檢測(cè)微生物上游引物序列II、無關(guān)序列II上游引物、無關(guān)序列II、待檢測(cè)微生物探針、無關(guān)序列II、無關(guān)序列II下游引物、待檢測(cè)微生物下游引物II ；
(4)克隆
瓊脂糖電泳PCR產(chǎn)物，使用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物I或產(chǎn)物II，在分光光度計(jì)法定量后，TA連接產(chǎn)物I或產(chǎn)物II到pGEM-T載體上，通過抗性篩選，PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，獲得陽性轉(zhuǎn)化子pGEM-T-產(chǎn)物I或pGEM-T-產(chǎn)物II，即所需的DNA質(zhì)控I或DNA質(zhì)控II ；將DNA質(zhì)控I 或DNA質(zhì)控II轉(zhuǎn)化并保存于大腸桿菌工程菌中；
(5)體外轉(zhuǎn)錄和純化
為適用于RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)，(4)所述DNA質(zhì)控需要進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)的RNA 將 PGEM-T-產(chǎn)物I或pGEM-T-產(chǎn)物II經(jīng)過單酶切進(jìn)行線性化，酶切位點(diǎn)位于插入基因外，利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外RNA的合成，獲得RNA質(zhì)控I或RNA質(zhì)控II ；
純化步驟為a)補(bǔ)充無RNAse酶滅菌水至100 yL，然后加入900 μ L TriPure Isolation Reagent，振蕩混勻，室溫靜置5 min，加入200 μ L氯仿，震蕩60 s，然后于 4°C, 12000 r/min高速離心15 min ；2)取500 μ L上清液，并加入等體積異丙醇室溫靜置 30 min, 12000 r/min高速離心15 min，棄去上清，用75%乙醇洗滌1次；3)然后加入1 mL 75%乙醇，保存于-80°C冰箱或液氮。上述的嵌合外源無關(guān)序列的核酸質(zhì)控在制備適用于分子診斷或檢測(cè)試劑盒核酸質(zhì)控品的用途。實(shí)施例2，質(zhì)量的鑒定DNA質(zhì)控和RNA質(zhì)控均可以分別通過分光光度計(jì)測(cè)定 0D260, 0D260/0D280比值以及瓊脂糖電泳測(cè)定其濃度的大小。也需要分別使用PCR和 RT-PCR鑒定質(zhì)控核酸的有效性。質(zhì)量良好的質(zhì)控DNA和RNA應(yīng)電泳條帶清晰、0擬60/0擬80 在1. 8 2. 0之間，檢測(cè)反應(yīng)的擴(kuò)增曲線正常。實(shí)施例3，質(zhì)控的應(yīng)用
(1)質(zhì)控PCR/逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)反應(yīng)
DNA質(zhì)控和RNA質(zhì)控分別質(zhì)控PCR/逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)檢測(cè)反應(yīng)。具體為，對(duì)于任何一種分子診斷試劑盒，均可以用DNA質(zhì)控和RNA質(zhì)控分別當(dāng)作試劑盒檢測(cè)反應(yīng)的待測(cè)樣品， 按照該試劑盒的說明書進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)。質(zhì)控樣品出現(xiàn)陽性檢測(cè)結(jié)果，則表明試劑盒保存良好，檢測(cè)反應(yīng)成立；若質(zhì)控樣品出現(xiàn)陰性檢測(cè)結(jié)果，則表明試劑盒試劑失效或檢測(cè)人員操作不良，檢測(cè)反應(yīng)失敗。(2)鑒別真陽性擴(kuò)增和假陽性擴(kuò)增
若檢測(cè)人員對(duì)于陽性的檢測(cè)結(jié)果持有懷疑態(tài)度的時(shí)候，則需要對(duì)陽性的檢測(cè)產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的鑒別。對(duì)于按照方法I制備的核酸質(zhì)控，可以使用針對(duì)無關(guān)基因設(shè)計(jì)的上下游引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物(用無菌水稀釋10(Γ1000倍)進(jìn)行PCR檢測(cè)，以鑒別是否為假陽性擴(kuò)增，25yL擴(kuò)增體系包括IXPCR 反應(yīng)緩沖液，1.5 2.0 mol/L MgCl2, 200 ymol/L dNTP (含 A、G、C、 Τ), IU耐熱DNA聚合酶，無關(guān)序列上游/下游引物終濃度各0.2 0.4 μ mol/L, Γ5 yL 模板DNA (稀釋的擴(kuò)增產(chǎn)物)；反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C 5 min;35個(gè)循環(huán)94°C，30 s, 55 60°C，30 s，72°C，l min ；補(bǔ)充延伸72°C，10 min。若PCR檢測(cè)為陽性，則表明先前的檢測(cè)反應(yīng)為假陽性；若PCR檢測(cè)為陰性，則表明先前的檢測(cè)反應(yīng)為真陽性。
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對(duì)于按照方法II制備的核酸質(zhì)控，可以使用針對(duì)無關(guān)隨機(jī)序列設(shè)計(jì)的上下游引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物(用無菌水稀釋10(Γ1000倍)進(jìn)行PCR檢測(cè)，以鑒別是否為假陽性擴(kuò)增，25 μ L 擴(kuò)增體系包括IXPCR 反應(yīng)緩沖液，1.5 2.0 mol/1 MgCl2, 200 ymol/l dNTP(含 A、G、 C、T)，IU耐熱DNA聚合酶，無關(guān)序列上游/下游引物終濃度各0.2 0.4 μ mol/1, Γδ μ L模板DNA(稀釋的擴(kuò)增產(chǎn)物)；反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C 5 min ;35個(gè)循環(huán)94°C，30 s, 55 60°C，30 s，72°C，l min ；補(bǔ)充延伸72°C，10 min。若PCR檢測(cè)為陽性，則表明先前的檢測(cè)反應(yīng)為假陽性；若PCR檢測(cè)為陰性，則表明先前的檢測(cè)反應(yīng)為真陽性。若使用相同的待檢測(cè)微生物特異性引物分別對(duì)核酸質(zhì)控和病原微生物進(jìn)行檢測(cè)， 若兩者的產(chǎn)物在長度上有一定的差異(3(Tl00bp均可)。則將檢測(cè)反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，若二者產(chǎn)物長度不一，且都為陽性，則表明檢測(cè)反應(yīng)為真陽性；若二者產(chǎn)物長度一致，且都為陽性，則表明檢測(cè)反應(yīng)為假陽性，需要進(jìn)行序列測(cè)定進(jìn)行鑒別。實(shí)施例4，組裝分子診斷/檢測(cè)試劑盒
使用按照本轉(zhuǎn)錄制備的核酸質(zhì)控，添加合適的核酸保護(hù)劑，乃至添加一些陰性血清，可以制備試劑盒專用的質(zhì)控(對(duì)照)品。a)定性的分子診斷試劑盒
用適宜的陰性血清和保護(hù)劑將核酸質(zhì)控稀釋到不同的稀釋度，取每個(gè)稀釋度進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)情況，取強(qiáng)陽性、弱陽性以及陰性的稀釋度分別作為試劑盒的強(qiáng)陽性對(duì)照、弱陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。在不同的存儲(chǔ)條件下，驗(yàn)證質(zhì)控品的穩(wěn)定性和有效期。取長期穩(wěn)定有效的質(zhì)控品作為試劑盒的質(zhì)控。b)定量的分子診斷試劑盒
用適宜的陰性血清和保護(hù)劑將核酸質(zhì)控稀釋到不同的稀釋度，使其拷貝數(shù)呈梯度的變化，取每個(gè)稀釋度進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)情況，取;Γ6個(gè)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)Ct值呈連續(xù)的稀釋度作為試劑盒的拷貝數(shù)定量質(zhì)控。在不同的存儲(chǔ)條件下，驗(yàn)證質(zhì)控品的穩(wěn)定性和有效期。取長期穩(wěn)定有效的質(zhì)控品作為試劑盒的質(zhì)控。實(shí)施例5，下面以Hmi流感病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的RNA質(zhì)控的制備為例做進(jìn)一步說明
1、無關(guān)序列的選擇
利用FastPCR生產(chǎn)一段隨機(jī)DNA序列 Seq 1
GCTGGATCTGGTATTATCCTGTGCATTGTATTTAACCAAGATACACCAGTCCACGATTGCGATAAGTCTACA GGGTACGGATAGCAGCACTGATCACAACTGTCAGGGACGAACACTTAGAACGCAGGTAGTTCAGAATATACATCCGA TC
2、引物的設(shè)計(jì)
根據(jù)無關(guān)序列和待檢測(cè)微生物利用引物設(shè)計(jì)的一般原理設(shè)計(jì)無關(guān)DNA序列引物和待檢測(cè)微生物特異性引物，在無關(guān)序列引物的上游和無關(guān)序列引物的下游的5'端分別加入待檢測(cè)微生物特異性引物上游和待檢測(cè)微生物特異性引物下游，得到一對(duì)嵌合引物。根據(jù)Hmi 流感序列(CY039527) Seq 2
GGGAAAACAAAAGCAACAAAAATGAAGGCAATACTAGTAGTTCTGCTATATACATTTGCAACCGCAAATGCAGACACATTATGTATAGGTTATCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGT AACACACTCTGTTAACCTTCTAGAAGACAAGCATAACGGGAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAGCCCCATTGCATT TGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGTGAATCACTCTCCACAGCAAGCTCATGGTCC TACATTGTGGAAACATCTAGTTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCGATTATGAGGAGCTAAGAGA GCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGA ACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCATGCTGGAGCAAAAAGCTTCTACAAAAATTTAATATGGCTAGTTAAAAAA GGAAATTCATACCCAAAGCTCAGCAAATCCTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTATGGGGCATTCA CCATCCATCTACTAGTGCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGTCATCAAGAT ACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAATAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAGGGAGAATGAACTATTACTGG ACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAAT GGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAGACACCCA AGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAATATGTAAAA AGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATGTCCCGTCTATTCAATCTAGAGGCCTATTTGGGGCCATTGC CGGTTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAG GATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACAGAATGCCATTGACGAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGTTATTGAAAAG ATGAATACACAGTTCACAGCAGTAGGTAAAGAGTTCAACCACCTGGAAAAAAGAATAGAGAATTTAAATAAAAAAGT TGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCCGAACTGTTGGTTCTATTGGAAAATGAAAGAACTTTGGACT ACCACGATTCAAATGTGAAGAACTTATATGAAAAGGTAAGAAGCCAGCTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTGGAAAC GGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAAAATGGGACTTATGACTACCCAAA ATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAGAAATAGATGGGGTAAAGCTGGAATCAACAAGGATTTACCAGATTT TGGCGATCTATTCAACTGTCGCCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGCTCT AATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTAA.
按照引物探針設(shè)計(jì)的一般原理獲得針對(duì)Hmi流感病毒的引物和探針
HlNl 流感病毒上游引物5’ -GCTGGATCTGGTATTATC-3，
HlNl 流感病毒下游引物5，-GATCGGATGTATATTCTGAA-3，
HlNl流感病毒taqman探針
FAM-5’ -AGATACACCAGTCCACGATTGC-3 ‘ -TAMARA。按照引物探針設(shè)計(jì)的一般原理獲得無關(guān)隨機(jī)DNA序列的引物 無關(guān)隨機(jī)DNA序列上游引物5，-CTGTGCATTGTATTTAACCA-3，
無關(guān)隨機(jī)DNA序列下游引物5，-CACTTAGAACGCAGGTAG-3，。人工合成一段序列 GCTGGATCTGGTATTATCCTGTGCATTGTATTTAACCAAGATACACCAGTCCACGATTGCGATAAGTCTACA
GGGTACGGATAGCAGCACTGATCACAACTGTCAGGGACGAACACTTAGAACGCAGGTAGTTCAGAATATACATCCGA TC。按照質(zhì)譜級(jí)合成上述DNA片段。3、PCR 擴(kuò)增
以Hmi病毒特異性上下游引物對(duì)合成的上述DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR體系的配制和參
數(shù)遵循一般的原理。50 μ L PCR擴(kuò)增體系包含IXPCR反應(yīng)緩沖液，1. 5 mmol/1 MgCl2, 200 ymol/ldNTP(含A、G、C、T)，IU耐熱DNA聚合酶，上游引物/下游濃度各0. 2 μ mol/1, 3 yL模板DNA (人工合成DNA);反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C 5 min ;；35個(gè)循環(huán)94°C，30 s，55°C，30 s，72°C，l min;補(bǔ)充延伸72°C，10 min。將產(chǎn)物電泳回收并用商品化膠回收試劑盒進(jìn)行純化。4、克隆
分光光度計(jì)法定量后，參考PGEM-T載體說明書要求，TA連接純化的PCR產(chǎn)物到pGEM_T 載體上，通過抗性篩選(連接轉(zhuǎn)化后，在培養(yǎng)中添加50μ g/ml的氨芐青霉素抑制陰性轉(zhuǎn)化子)、PCR鑒定轉(zhuǎn)化子(方法同上)，獲得陽性轉(zhuǎn)化子pGEM-T-產(chǎn)物，即DNA質(zhì)控。5、體外轉(zhuǎn)錄和純化
由于流感病毒為RNA病毒，需將所述DNA質(zhì)控進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成RNA，步驟是將DNA質(zhì)控經(jīng)過Kpn I進(jìn)行線性化，按照體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的要求進(jìn)行體外RNA的合成，獲得 RNA 質(zhì)控。體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液含有:lx Transcription Optimized Buffer, 10 mmol/L DTT, 25U Rnasin Ribonuclease Inhibitor, 0. 5 mmol/L rNTP (含rATP, rGTP, rCTP, rUTP)， 1 ug線性化DNA ；于38°C水浴反應(yīng)2 h ；
按照上述步驟合成的RNA還含有大量的DNA，需要使用DNA酶進(jìn)行體外的消化，將所有產(chǎn)物加入IU DNA酶，37°C反應(yīng)15 min。然后，使用TriPure RNA抽提試劑盒進(jìn)行抽提和純化。純化步驟為a)補(bǔ)充無RNAse酶滅菌水至100 μ L，然后加入900 μ 1 TriPure Isolation Reagent，振蕩混勻，室溫靜置5 min，加入200 μ L氯仿，震蕩60 s，然后于 4°C, 12000 r/min高速離心15 min ；2)取500 μ L上清液，并加入等體積異丙醇室溫靜置 30 min, 12000 r/min高速離心15 min，棄去上清，用75%乙醇洗滌1次；3)然后加入1 mL 75%乙醇，保存于-80°C冰箱或液氮。使用時(shí)取出，恒溫至室溫后12000 r/min高速離心5 min，去除乙醇，RNA沉淀溶解于20 μ L無RNAse水，即可作為質(zhì)控使用。6、質(zhì)量的鑒定
通過分光光度計(jì)測(cè)定RNA質(zhì)控的0擬60、0D260/0D280比值。也需要分別使用PCR和 RT-PCR鑒定質(zhì)控核酸的有效性。質(zhì)控RNA電泳條帶清晰、0擬60/0D280在1. 8 2. 0之間。7、質(zhì)控的應(yīng)用
(1)質(zhì)控逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)反應(yīng)
以RNA質(zhì)控為檢測(cè)反應(yīng)的模板，進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)。檢測(cè)條件參照試劑盒說明書。RNA質(zhì)控樣品具有良好的擴(kuò)增曲線，Ct值在預(yù)定的范圍內(nèi)，示試劑盒狀態(tài)良好。(2)鑒別真陽性擴(kuò)增和假陽性擴(kuò)增
若對(duì)于陽性的檢測(cè)結(jié)果持有懷疑態(tài)度的時(shí)候，則需要對(duì)陽性的檢測(cè)產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的鑒別。用針對(duì)無關(guān)隨機(jī)序列設(shè)計(jì)的上下游引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物(用無菌水稀釋10(Γ1000倍) 進(jìn)行PCR檢測(cè)，以鑒別是否為假陽性擴(kuò)增，25 μ L擴(kuò)增體系包括IXPCR反應(yīng)緩沖液，1.5 mol/L MgC12, 200 μ mol/L dNTP (含 A、G、C、Τ)，IU 耐熱 DNA 聚合酶，無關(guān)序列上游 / 下游引物終濃度各0.2 μ mol/L, 1 μ L模板DNA (稀釋的擴(kuò)增產(chǎn)物)；反應(yīng)條件為預(yù)變性 95°C 5 min ； 35 個(gè)循環(huán)94°C，30 s，55°C，30 s，72°C，l min ；補(bǔ)充延伸72°C，10 min。 若PCR檢測(cè)為陽性，則表明先前的檢測(cè)反應(yīng)為假陽性；若PCR檢測(cè)為陰性，則表明先前的檢
10測(cè)反應(yīng)為真陽性。
( 3 )組裝分子診斷/檢測(cè)試劑盒
用適宜的陰性血清和保護(hù)劑將核酸質(zhì)控稀釋到不同的稀釋度，使其拷貝數(shù)呈梯度的變
化，取每個(gè)稀釋度進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)情況，取3個(gè)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)Ct值呈連續(xù)的稀釋度作為
試劑盒的拷貝數(shù)定量質(zhì)控。在不同的存儲(chǔ)條件下，驗(yàn)證質(zhì)控品的穩(wěn)定性和有效期。取長期穩(wěn)定有效的質(zhì)控品作為試劑盒的質(zhì)控。
權(quán)利要求
1.嵌合外源無關(guān)序列的核酸質(zhì)控的制備方法，包括如下步驟(1)無關(guān)序列來源及選擇包括方法I或方法II，當(dāng)檢測(cè)反應(yīng)為基于產(chǎn)物長度時(shí)選用方法I，當(dāng)檢測(cè)反應(yīng)為taqman實(shí)時(shí)定量PCR或類似中間含探針的檢測(cè)反應(yīng)時(shí)選用方法II ；所述方法I 從現(xiàn)有的質(zhì)粒載體上選取一段DNA序列，用生物學(xué)軟件分析該DNA序列的 GC含量和二級(jí)構(gòu)象，滿足如下條件的DNA序列選用為無關(guān)序列I :a)無關(guān)序列I與待檢測(cè)微生物的同源性低于5%，b) GC含量在45% 55%之間，c) 二級(jí)結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，d)平均TM 值在60°C 85°C之間；所述方法II 采用化學(xué)法合成一段無關(guān)序列II，滿足無關(guān)序列II和待檢測(cè)微生物無同源性；(2)引物的設(shè)計(jì)利用引物設(shè)計(jì)的一般原理針對(duì)步驟(1)方法I中所述無關(guān)序列I和待檢測(cè)微生物分別設(shè)計(jì)一對(duì)無關(guān)序列I引物和一對(duì)待檢測(cè)微生物特異性引物I，在無關(guān)序列I引物的上游和無關(guān)序列I引物的下游的5'端分別加入待檢測(cè)微生物特異性引物I上游和待檢測(cè)微生物特異性引物I下游，得到一對(duì)嵌合引物；用引物設(shè)計(jì)的一般原則針對(duì)待檢測(cè)微生物設(shè)計(jì)一對(duì)待檢測(cè)微生物特異性引物II和待檢測(cè)微生物探針，還需要針對(duì)無關(guān)序列II設(shè)計(jì)一對(duì)無關(guān)序列II引物；化學(xué)合成一段從5' 端到3'端依次是待檢測(cè)微生物上游引物II、無關(guān)序列II、待檢測(cè)微生物探針、無關(guān)序列II、 待檢測(cè)微生物下游引物II的DNA片段；(3)PCR擴(kuò)增用步驟(2)中所述嵌合引物，PCR擴(kuò)增步驟(1)方法I所述現(xiàn)有的質(zhì)粒載體，獲得雙鏈 DNA序列產(chǎn)物I 產(chǎn)物I從5'端到3'端依次是待檢測(cè)微生物上游引物I、無關(guān)序列I上游引物、無關(guān)序列I、無關(guān)序列I下游引物和待檢測(cè)微生物下游引物I ；用步驟(2)中所述待檢測(cè)微生物特異性引物II PCR擴(kuò)增步驟(2)所述DNA片段，獲得雙鏈DNA序列產(chǎn)物II 從5'端到3'端依次是待檢測(cè)微生物上游引物序列II、無關(guān)序列II上游引物、無關(guān)序列II、待檢測(cè)微生物探針、無關(guān)序列II、無關(guān)序列II下游引物、待檢測(cè)微生物下游引物II ；(4)克隆瓊脂糖電泳PCR產(chǎn)物，使用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物I或產(chǎn)物II，在分光光度計(jì)法定量后，TA連接產(chǎn)物I或產(chǎn)物II到pGEM-T載體上，通過抗性篩選，PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，獲得陽性轉(zhuǎn)化子pGEM-T-產(chǎn)物I或pGEM-T-產(chǎn)物II，即所需的DNA質(zhì)控I或DNA質(zhì)控II ；將DNA質(zhì)控I 或DNA質(zhì)控II轉(zhuǎn)化并保存于大腸桿菌工程菌中；(5)體外轉(zhuǎn)錄和純化將pGEM-T-產(chǎn)物I或pGEM-T-產(chǎn)物II經(jīng)過單酶切進(jìn)行線性化，酶切位點(diǎn)位于插入基因外，利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外RNA的合成，獲得RNA質(zhì)控I或RNA質(zhì)控II ；純化步驟為a)補(bǔ)充無RNAse酶滅菌水至100 μ L，然后加入900 μ L TriPure Isolation Reagent，振蕩混勻，室溫靜置5 min，加入200 μ L氯仿，震蕩60 s，然后于 4°C, 12000 r/min高速離心15 min ；2)取500 μ L上清液，并加入等體積異丙醇室溫靜置 30 min, 12000 r/min高速離心15 min，棄去上清，用75%乙醇洗滌1次；3)然后加入1 mL 75%乙醇，保存于-80°C冰箱或液氮。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述嵌合外源無關(guān)序列的核酸質(zhì)控的制備方法，其特征在于步驟 (2)中所述DNA片段長度在80bp IOOObp之間，無關(guān)隨機(jī)待檢測(cè)微生物探針5’端到待檢測(cè)微生物上游引物II 3’端的距離在5 50bp之間。
3.權(quán)利要求1所述的嵌合外源無關(guān)序列的核酸質(zhì)控在制備適用于分子診斷或檢測(cè)試劑盒核酸質(zhì)控品的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種嵌合外源無關(guān)序列的核酸質(zhì)控的制備方法，通過在無關(guān)序列的兩側(cè)，采用基因克隆法或化學(xué)合成法添加微生物特異性引物序列，然后利用PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，獲得DNA質(zhì)控，進(jìn)一步利用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)即可獲得可以作為分子檢測(cè)試劑盒的RNA質(zhì)控。本發(fā)明制備的核酸質(zhì)控均含有一段和檢測(cè)對(duì)象無關(guān)的基因序列，在后續(xù)的陽性排查中，可以鑒別是否是由于操作污染造成的虛假擴(kuò)增。在陰性對(duì)照正常的條件下，核酸質(zhì)控樣品的陽性擴(kuò)增，指征檢測(cè)反應(yīng)的有效和正確。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102443628SQ20111033977
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月1日
發(fā)明者李應(yīng)國, 李賢良, 楊俊 , 王昱, 聶福平, 肖進(jìn)文 申請(qǐng)人:重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心