專利名稱：一種用于檢測vkorc1和cyp2c9基因多態(tài)性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用基因測序技術(shù)檢測VKORCl和 CYP2C9基因多態(tài)性，進(jìn)而指導(dǎo)華法林選擇用藥劑量的試劑盒。
背景技術(shù)：
華法林是屬于香豆素類藥，通過抑制維生素K依賴性凝血因子的合成，延長凝血酶原活化時間，達(dá)到抗凝的目的。它在臨床上常用于治療血栓性疾病，具有抗凝和溶栓的雙重作用，是目前國際上最常用的長效抗凝劑，也是治療和預(yù)防靜脈血栓性疾病的主要藥物之一。但華法林的有效血藥濃度范圍狹窄，劑量偏小會降低治療血栓形成的效果，劑量偏大則會增大出血的風(fēng)險，甚至引發(fā)大出血等副作用。臨床上常以凝血酶原時間(PT)及國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)作為監(jiān)測指標(biāo)，以達(dá)到安全有效地使用它。因此臨床醫(yī)生常先給予一定標(biāo)準(zhǔn)劑量，然后根據(jù)每個患者INR值的情況， 增加或減少劑量直至INR達(dá)到靶標(biāo)，從而確定需要的維持劑量，長時間的進(jìn)行維持治療。使用華法林的另一個特點是其穩(wěn)定劑量在不同種族間及個體間存在著較大差異，不同個體間穩(wěn)定劑量的差異可達(dá)20倍以上。因此，將不同患者的華法林劑量調(diào)整到既安全又有效的范圍，是長期以來臨床用藥上一個非常棘手的問題。造成華法林用量個體差異的原因很多，可分為非遺傳因素和遺傳因素。非遺傳因素主要有年齡、身高、體重，藥物的相互作用，飲食習(xí)慣，疾病狀態(tài)等。然而，非遺傳因素的影響程度較為有限，并非華法林用量個體差異的主要原因。近年的研究表明，遺傳因素在華法林用量個體差異的表現(xiàn)中起到關(guān)鍵的作用。影響華法林用量個體差異的遺傳因素是指與華法林的藥動學(xué)和藥效學(xué)有關(guān)的蛋白或酶的基因發(fā)生變異，影響蛋白的表達(dá)或酶的活性，從而增強(qiáng)或降低華法林的療效，使不同個體間的用量產(chǎn)生差異。目前，已知與華法林的藥效學(xué)和藥動學(xué)相關(guān)的基因達(dá)30余種，其中維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位 1基因(VKORCl)和細(xì)胞色素2C9(CYP2C9)的多態(tài)性是影響華法林用量個體差異最主要的兩個遺傳因素。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的CYP2C9等位基因有30余種，其中以(野生型)、
(Argl44Cys)、*3 (Ile359Leu)最為常見，而VKORCl主要表現(xiàn)為G-1639A位點多態(tài)性。目前，研究人員更傾向于將遺傳因素與非遺傳因素相結(jié)合，建立新的華法林穩(wěn)定劑量預(yù)測算法，提高了劑量預(yù)測的效能。大多數(shù)這樣的算法可解釋華法林用量個體差異50%以上的原因。研究顯示VKORCl和CYP2C9的多態(tài)性對華法林用量個體差異的貢獻(xiàn)比例分別6-37%和 5-22%o因此，通過對患者的基因進(jìn)行檢測，來確定華法林需求的維持劑量，就可以實現(xiàn)個體化用藥，既可避免劑量不夠造成血栓，又可防止劑量過大引起出血并發(fā)癥。采用敏感性及特異性均較高的基因測序法檢測VKORCl和CYP2C9基因多態(tài)性，可為臨床提高華法林應(yīng)用的安全性和有效性提供一種全新的快速簡便的基因診斷技術(shù)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種特異的檢測VKORCl和CYP2C9基因多態(tài)性的試劑盒， 為臨床個體化使用華法林劑量提供依據(jù)。本發(fā)明的試劑盒利用基因測序技術(shù)，設(shè)計了 VKORCl和CYP2C9基因PCR擴(kuò)增引物， 為此，本發(fā)明首先提供一種用于VKORCl和CYP2C9基因多態(tài)性檢測的引物
1)VKORCl第3外顯子基因
上游引物序列為5' - CAGTGCCTGAAGCCCACA -3 ‘， 下游引物序列為5' - CTCACATGCCAAAGCAAAGC -3 ‘；
2)CYP2C9第3外顯子基因
上游引物序列為5' - GCTGTTAAGGGAATTTGTAGG -3，， 下游引物序列為5' - ATATTCACCCCAAGGCTGTCT -3，；
3)CYP2C9第7外顯子基因
上游引物序列為5' - GTGCCATTTTTCTCCTTTTCC -3，， 下游引物序列為5' - AATGTCACAGGTCACTGCATG -3，。進(jìn)一步本發(fā)明提供一種利用基因測序技術(shù)檢測VKORCl和CYP2C9基因多態(tài)性的試劑盒，其包括上述VKORCl和CYP2C9基因多態(tài)性擴(kuò)增引物。基于此，本發(fā)明可以采用現(xiàn)有常規(guī)方法提取人外周血基因組、進(jìn)行PCR擴(kuò)增、并測序。優(yōu)選本發(fā)明試劑盒進(jìn)一步包括以下試劑中的一種或多種人外周血基因組提取試劑、陰性對照和陽性對照、PCR反應(yīng)液和PCR測序試劑。其中人外周血基因組提取試劑包括去離子水，6M NaI，氯仿/異戊醇Q4 1)混合液，異丙醇和無水乙醇。其中的陰性對照和陽性對照以去離子水為陰性對照，以已知多態(tài)性人基因組 DNA為陽性對照。其中的PCR反應(yīng)液包括10XPCR緩沖液、2. 5 4.0 mM的MgCl2、2U的Taq酶、 0.2 0.4 mM的dNTPs、0. 3 0. 6 mM dUTP，上述引物溶于PCR反應(yīng)液中，濃度為0. 25 pmol/ μ 。在擴(kuò)增時，通常模板為廣2 μ 。其中PCR測序反應(yīng)液為4 μ 1測序Buffer，1 μ 1測序引物(上述擴(kuò)增引物作為測序引物)，添加1 μ IDNA測序模板。用本發(fā)明的試劑盒檢測人外周血基因組中VKORCl和CYP2C9基因多態(tài)性，檢測方法如下首先獲取臨床病人外周血標(biāo)本，使用外周血基因組DNA提取試劑得到患者外周血基因組DNA，利用合成的PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物直接采用凝膠回收試劑盒進(jìn)行快速膠回收，取回收DNA進(jìn)行測序反應(yīng)，結(jié)束后采用醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物，電泳前測序PCR產(chǎn)物在PCR儀上進(jìn)行熱變性(95°C aiiin)，冰中驟冷，然后可進(jìn)行上機(jī)測序。將測序結(jié)果與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，得出待檢者VKORCl和CYP2C9基因多態(tài)性，即可預(yù)測其華法林的用量。本發(fā)明試劑盒的優(yōu)點和效果如下
(1)敏感基因測序技術(shù)是綜合了PCR技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)碼顯像技術(shù)為一體的技術(shù)，因此它的檢測靈敏度很高；
(2)特異使用特異性探針對定量分子進(jìn)行識別，具有很高的準(zhǔn)確性，特異性好、假陽性低；(3)簡便安全操作簡單、安全、自動化程度高、防污染；
(4)快速速度快、高通量，可在12 14小時完成。


圖1 VKORCl第3外顯子基因測序比對結(jié)果A為基因測序結(jié)果，箭頭所示基因多態(tài)性位置，B為與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果，方框表示基因多態(tài)性位置；
圖2 CYP2C9第3外顯子基因測序比對結(jié)果A為基因測序結(jié)果，箭頭所示基因多態(tài)性位置，B為與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果，方框表示基因多態(tài)性位置；
圖3 CYP2C9第7外顯子基因測序比對結(jié)果A為基因測序結(jié)果，箭頭所示基因多態(tài)性位置，B為與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果，方框表示基因多態(tài)性位置。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例中的方法若未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。實施例1本發(fā)明試劑盒的制備本發(fā)明試劑盒組成如下
(1)人外周血基因組提取試劑為去離子水，6M Nal，氯仿/異戊醇04:1)混合液，異丙醇和無水乙醇。(2)引物:
1)VKORCl第3外顯子基因
上游引物序列為5' - CAGTGCCTGAAGCCCACA -3 ‘， 下游引物序列為5' - CTCACATGCCAAAGCAAAGC -3 ‘；
2)CYP2C9第3外顯子基因
上游引物序列為5' - GCTGTTAAGGGAATTTGTAGG -3，， 下游引物序列為5' - ATATTCACCCCAAGGCTGTCT -3，；
3)CYP2C9第7外顯子基因
上游引物序列為5' - GTGCCATTTTTCTCCTTTTCC -3，， 下游引物序列為5' - AATGTCACAGGTCACTGCATG -3，。上述引物序列由上海Life Technology生物技術(shù)公司合成。(3)陰性對照和陽性對照以去離子水為陰性對照，以已知多態(tài)性的人基因組DNA 為陽性對照。(4) PCR 反應(yīng)液10XPCR 緩沖液、2. 5mM 的 MgCl2,2U 的 Taq 酶、0. 2 mM 的 dNTPs、 0.3 mM dUTP，上述引物溶于PCR反應(yīng)液中，濃度為0.25 pmol/μ 1。擴(kuò)增時通常取2 μ 的模板。(5) PCR 測序反應(yīng)液為4 μ 1 測序 Buffer (BigDye Terminator v3. 1 Cycle Sequencing Kit, ABI), 1 μ 1測序引物(與以上擴(kuò)增引物相同)。試劑盒的使用方法如下
(1)外周血基因組DNA的抽提按外周血基因組DNA抽提純化的方法抽提丙型肝炎患者外周血中基因組DNA。
(2) PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20 μ 1 含10XPCR反應(yīng)混合液10. 0 μ L，引物濃度0.25 pmol/μ 1，超純水補(bǔ)齊。在ABI 9700儀器上通常是先95°C 5 min，然后95°C 30 s，57°C 45s, 72°C 1 min，循環(huán) 30 次，最后 72°C 10 min。(3 ) 2%的DNA凝膠電泳后切取PCR產(chǎn)物，利用Axy公司DNA凝膠回收試劑盒回收純化擴(kuò)增的DNA片段。(4)測序反應(yīng)液4 μ 1測序Buffer，1 μ 1 DNA模板(步驟3得到的DNA片段)，1 μ 測序引物，在ΑΒΙ9700儀器上先98°C變性2 min，然后進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為 960C 10 s,50°C 5 s,60°C 4 min，25個循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置4°C保溫。(5)采用醋酸鈉/乙醇法純化測序反應(yīng)產(chǎn)物，按照ABI3130測序儀操作說明進(jìn)行測序。實施例2用實施例1制備的試劑盒檢測VKORCl和CYP2C9的基因多態(tài)性以檢測20例需正在使用華法林藥物患者的外周血樣品中VKORCl和CYP2C9的基因
多態(tài)性結(jié)果為例。檢測流程首先根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫提供的VKORCl和CYP2C9基因序列設(shè)計特異性引物。獲取臨床正在使用華法林藥物患者的外周血樣品，采用全血DNA提取試劑提取外周血DNA，配制PCR反應(yīng)液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行測序反應(yīng)，結(jié)束后將測序反應(yīng)產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序，最后在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核酸序列比對，確定所測序列多態(tài)性。具體步驟如下
(1)外周血基因組DNA的抽提按外周血基因組DNA抽提純化的方法抽提丙型肝炎患者外周血中基因組DNA。(2) PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20 μ 1 含IOX PCR反應(yīng)混合液10. 0 μ 1，引物濃度0.25 pmol/μ 1，超純水補(bǔ)齊。在ΑΒΙ9700儀器上通常是先95°C 5 min，然后95°C 30 s， 57°C 45s, 72°C 1 min，循環(huán) 30 次，最后 72°C 10 min。(3 ) 2%的DNA凝膠電泳后切取PCR產(chǎn)物，利用Axy公司DNA凝膠回收試劑盒回收純化擴(kuò)增的DNA片段。(4)測序反應(yīng)液4 μ 1測序Buffer，1 μ IDNA模板，1 μ 1測序引物(與以上擴(kuò)增引物相同)，在ΑΒΙ9700儀器上先98°C變性2 min，然后進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96°C 10 s,50°C 5 s,60°C 4 min，25個循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置4°C保溫。(5)采用醋酸鈉/乙醇法純化測序反應(yīng)產(chǎn)物，按照ABI3130測序儀操作說明進(jìn)行測序。(6)數(shù)據(jù)收集處理和分析將所測得序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中VKORCl和CYP2C9 基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對分析，確定VKORCl (圖1)和CYP2C9基因多態(tài)性(圖2、圖3)
(7)結(jié)果如表1所示。表1通過本發(fā)明試劑盒確定的華法林用藥量
權(quán)利要求
1.一種用于檢測VKORCl和CYP2C9基因多態(tài)性的引物，其包括以下引物對1)VKORCl第3外顯子基因上游引物序列為5' - CAGTGCCTGAAGCCCACA -3 ‘，下游引物序列為5' - CTCACATGCCAAAGCAAAGC -3 ‘；2)CYP2C9第3外顯子基因上游引物序列為5' - GCTGTTAAGGGAATTTGTAGG -3，，下游引物序列為5' - ATATTCACCCCAAGGCTGTCT -3，；3)CYP2C9第7外顯子基因上游引物序列為5' - GTGCCATTTTTCTCCTTTTCC -3，，下游引物序列為5' - AATGTCACAGGTCACTGCATG -3，。
2.一種利用基因測序方法檢測VKORCl和CYP2C9基因多態(tài)性的試劑盒，其包括權(quán)利要求1所述的引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于還包括以下試劑中的一種或多種PCR反應(yīng)液、陰性對照、陽性對照、PCR測序反應(yīng)液、人外周血基因組提取試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液包括10XPCR緩沖液、 2. 5 4. 0 mM 的 MgCl2、2U 的 Taq 酶、0. 2 0. 4 mM 的 dNTPs、0. 3 0. 6 mM dUTP，所述引物溶于 PCR反應(yīng)液中，濃度為0. 25 pmol/ μ 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為去離子水。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對照為已知多態(tài)性人基因組 DNA樣品。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR測序反應(yīng)液包括4μ 測序 Buffer, 1 μ 1作為測序引物的權(quán)利要求1所述引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求3 7任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述人外周血基因組提取試劑包括去離子水，6Μ Nal，氯仿/異戊醇混合液，異丙醇和無水乙醇。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種快速檢測VKORC1和CYP2C9的基因多態(tài)的試劑盒，用于指導(dǎo)臨床華法林用藥劑量。該試劑盒包括SEQIDNo.1~6所示的三對引物，并且還可以進(jìn)一步包括以下試劑中的一種或多種PCR反應(yīng)液、陰性對照、陽性對照、PCR測序反應(yīng)液、人外周血基因組提取試劑。本發(fā)明提供的試劑盒采用敏感性及特異性均較高的基因測序法檢測VKORC1和CYP2C9基因多態(tài)性，其檢測結(jié)果的特異性和敏感度均顯著提高，該試劑盒為臨床提高華法林應(yīng)用的安全性和有效性提供了一種全新的快速簡便的基因診斷技術(shù)。
文檔編號C12Q1/68GK102329885SQ20111032842
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月26日
發(fā)明者李艷, 童永清 申請人:李艷, 童永清