專利名稱：可直接觀察HBV cccDNA在肝組織中分布定位的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種原位檢測乙肝病毒cccDNA的方法，特別是涉及一種可直接觀察 HBVcccDNA在肝組織中分布和定位的的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，以下簡稱為 HBVcccDNA)的檢測在病毒疾病的發(fā)病機(jī)理和抗病毒治療研究方面具有重要意義。目前，有文獻(xiàn)采用套式PCR方法在肝組織中原位檢測HBVcccDNA表達(dá)，此方法無法排除非閉合環(huán)狀DNA和整合HBV DNA的干擾。PCR技術(shù)能夠在反應(yīng)管中將微量的核酸擴(kuò)增幾百萬倍用于分析，但不能反映擴(kuò)增產(chǎn)物與組織結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。原位雜交技術(shù)雖然能夠反映擴(kuò)增產(chǎn)物與組織結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，但在每個(gè)細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下，該方法的敏感性明顯下降。原位PCR技術(shù)將PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來，是直接在細(xì)胞或組織標(biāo)本上原位擴(kuò)增目的DNA片段，并在原位檢測其擴(kuò)增產(chǎn)物的技術(shù)。1990年Haase等首先報(bào)道了一個(gè)成功的原位PCR實(shí)驗(yàn)，隨后許多實(shí)驗(yàn)室相繼有了報(bào)道。按檢測方式不同主要分為直接原位和間接原位PCR.直接原位PCR是使用標(biāo)記的引物或游離核苷酸進(jìn)行原位PCR反應(yīng)，這種標(biāo)記分子隨后進(jìn)入擴(kuò)增產(chǎn)物中，擴(kuò)增結(jié)果可直接觀察而不需要進(jìn)行原位雜交。直接原位PCR具有操作簡便、流程短、省時(shí)的優(yōu)點(diǎn)。但直接原位PCR易發(fā)生引物錯(cuò)配或非特異性退火，容易出現(xiàn)假陽性；此外，標(biāo)記的引物還會(huì)降低PCR效率。間接原位PCR是在沒有標(biāo)記物的情況下進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，再用原位雜交技術(shù)來檢測擴(kuò)增的信號(hào)。該方法可以克服由于DNA修復(fù)或引物錯(cuò)配引起的非特異性問題。該方法需要進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)后的洗脫和原位雜交過程，因而所需時(shí)間相對較長。滾環(huán)擴(kuò)增(rolling cycle amplification,RCA)是一種體外等溫核酸擴(kuò)增方法。原理是寡核苷酸引物與環(huán)狀模板結(jié)合后，在特異的聚合酶的作用下循環(huán)擴(kuò)增。中國專利申請20101023T281. 4 “檢測石蠟包埋肝組織乙肝病毒cccDNA”是本發(fā)明人先前的工作，采用滾環(huán)擴(kuò)增加跨缺口實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測閉合環(huán)狀DNA的方法定量檢測HBV cccDNA，較好地解決了制約HBV cccDNA定量檢測的瓶頸。雖然，該方法與常規(guī)使用的熒光探針定量檢測等技術(shù)相比，可同時(shí)提高檢測反應(yīng)特異性和靈敏度，以及與僅用滾環(huán)擴(kuò)增方法相比，可進(jìn)行HBV cccDNA定量檢測，但是仍存在以下缺點(diǎn)與不足一是檢測方法比較復(fù)雜，必須先把肝組織制成勻漿，把細(xì)胞破壞，從中抽提出核酸做模板，然后在反應(yīng)管中用熒光定量PCR儀進(jìn)行定量檢測。結(jié)果判定需要制做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以 β-actin作為內(nèi)參照。此外，該方法是用來定量檢測肝組織中HBVcccDNA的特異性方法，但不能將 HBVcccDNA的分布與肝組織形態(tài)或組織病理特征相聯(lián)系，不能反映HBVcccDNA與肝組織結(jié)
3構(gòu)的關(guān)系，不能觀察HBVcccDNA在肝細(xì)胞內(nèi)的分布和定位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可在顯微鏡下肉眼直接觀察到HBV cccDNA在肝組織中的分布和定位的原位HBV cccDNA檢測方法，反映HBVcccDNA與肝組織結(jié)構(gòu)的關(guān)系。本發(fā)明的另一目的是開發(fā)可直接觀察HBVcccDNA在肝組織中的分布及定位的檢測試劑盒。本方法的技術(shù)方案是一種直接觀察HBVcccDNA在肝組織中分布定位的檢測方法，步驟為將患者肝組織樣本固定，消化，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物；其特征是1)所述樣本固定是將肝組織樣本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片；2)所述消化是用蛋白酶和PSAD酶進(jìn)行消化；3)所述PCR擴(kuò)增是在肝組織切片上進(jìn)行原位滾環(huán)加跨缺口 PCR擴(kuò)增；4)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測是在滾環(huán)加跨缺口 PCR擴(kuò)增后的肝組織切片上滴加堿磷酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，孵育一定時(shí)間后，滴加NBT/BCIP;室溫普通顯微鏡下肉眼直接觀察肝組織切片顯色情況，細(xì)胞核出現(xiàn)藍(lán)色、紫色及紫藍(lán)色顆粒者為HBVcccDNA表達(dá)陽性，細(xì)胞核出現(xiàn)紅色者為HBVcccDNA表達(dá)陰性；5)整個(gè)檢測過程均在載有肝組織切片的玻璃載玻片上進(jìn)行。所述肝組織樣本固定的方法是將肝組織樣本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，二甲苯脫蠟后，梯度乙醇脫水，室溫干燥。所述消化是先采用蛋白酶消化肝組織切片增加組織通透性，然后采用PSAD酶消化組織中非共價(jià)閉合環(huán)狀DNA。所述進(jìn)行原位滾環(huán)加跨缺口 PCR擴(kuò)增所用儀器為原位PCR儀。進(jìn)行原位滾環(huán)加跨缺口 PCR擴(kuò)增是在肝組織切片上加入滾環(huán)擴(kuò)增引物和跨缺口引物，進(jìn)行滾環(huán)加跨缺口原位PCR擴(kuò)增HBVcccDNA，所述滾環(huán)擴(kuò)增引物和跨缺口引物是 RCA1、RCA2、RCA3、RCA4、RCA5、RCA6、RCA7、RCA8、P59、P83 十個(gè)引物(引物的序列見實(shí)施例 1)。所述加入滾環(huán)擴(kuò)增引物和跨缺口引物是加入所述十個(gè)引物，每個(gè)引物0.8 μ 1， 在95°C保溫;3min，55°C保溫15s，33°C保溫15s，20°C保溫IOmin ；再將上述每個(gè)引物各取 0. 8μ 1，加入 Phi29DNA 聚合酶 1μ 1，Phi29 buffer 1 μ 1，BSA 0. 2 μ 1，dNTP 1.6μ1，無菌去離子水4. 2μ 1，滴加到組織上中，在30°C保溫18個(gè)小時(shí)。所述擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測是在組織切片上滴加堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，37°C 孵育，IX TBS洗滌；滴加NBT/BCIP，暗處室溫顯色；0. 1 %核固紅復(fù)染胞核，室溫干燥后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。如果肝組織中有HBV cccDNA的表達(dá)，則經(jīng)原位滾環(huán)加跨缺口 PCR擴(kuò)增后，在組織切片上滴加堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，該抗體就會(huì)與擴(kuò)增產(chǎn)物中的地高辛結(jié)合， 再與組織切片上滴加的NBT/BCIP反應(yīng)。原理是BCIP+NBT(四唑硝基藍(lán))是堿性磷酸酶最佳的底物組合之一，在堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AP)作用下，BCIP會(huì)被水解產(chǎn)生強(qiáng)反應(yīng)性的產(chǎn)物，該產(chǎn)物會(huì)和NBT發(fā)生反應(yīng)，形成不溶性的深藍(lán)色至藍(lán)紫色的 NBT—formazan。
由于堿性磷酸酶與NBT/BCIP反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)色、藍(lán)紫色顆粒，加上核固紅復(fù)染胞核， 在顯微鏡下不僅可直接觀察到HBV cccDNA在肝組織中的分布和定位，同時(shí)還能觀察組織的
病理變化。核固紅復(fù)染試劑是一種旨在通過核固紅染料的使用，使細(xì)胞核呈現(xiàn)淡紅色，從而與組織化學(xué)中的樣品染色產(chǎn)生色彩差異和對比，便于觀察。用本發(fā)明的方法可以制備肝組織原位檢測乙型肝炎病毒cccDNA的試劑及試劑
品.ο一種可直接觀察HBVcccDNA在肝組織中的分布及定位的檢測試劑盒，含有去污劑、dNTP和1XPBS，其特征是還含有以下一種或多種物質(zhì)組織切片固定劑、脫蠟試劑、封閉試劑、蛋白酶、PSAD酶、Phi四DNA聚合酶、滾環(huán)引物和地高辛標(biāo)記引物。優(yōu)選的，組織切片固定劑是10%甲醛；蛋白酶是蛋白酶K，脫蠟試劑是二甲苯，封閉試劑是BSA、去污劑是TritonX-IOO。試劑盒中還可以含有Wii29 buffer、堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體、1XTBS、 NBT/BCIP、核固紅。上述試劑盒的檢測方法是將肝組織樣本固定，石蠟包埋，進(jìn)行消化，然后進(jìn)行原位滾環(huán)加跨缺口 PCR擴(kuò)增，最后在顯微鏡下肉眼直接觀察肝組織切片顏色。本發(fā)明的有益效果是1、直接觀察到HBV cccDNA在肝組織中的分布和定位有助于研究病毒疾病的發(fā)病機(jī)理和病理過程。尤其在研究病毒和腫瘤的關(guān)系方面，發(fā)揮著重要作用。2、方法比較簡便，不需要將肝組織制成勻漿，抽提出核酸做模板；判定結(jié)果也不需要制做標(biāo)準(zhǔn)曲線。3、靈敏度高當(dāng)乙肝患者病毒含量較低，用現(xiàn)有原位雜交技術(shù)無法檢測到時(shí)，用本方法仍可檢測到肝組織中HBV cccDNA。4、特異性強(qiáng)通過PSAD酶消化，去除非共價(jià)閉合環(huán)狀DNA的干擾，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增加跨缺口 PCR，進(jìn)一步去除PSAD酶未消化完全的非閉合環(huán)狀DNA和整合DNA，進(jìn)一步增強(qiáng)了特異性。5、重復(fù)性、穩(wěn)定性好從實(shí)施例給出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可證實(shí)，對臨床來源的10份樣本進(jìn)行3次重復(fù)檢測，組內(nèi)組間差異無顯著性(P < 0. 05)。


圖1是不同檢測方法檢測慢性乙型肝炎患者肝組織中HBV cccDNA比較圖，其中A 原位PCR方法檢測慢性乙型肝炎患者肝組織中HBV cccDNA ；B =PSAD消化+跨缺口原位PCR法檢測慢性乙型肝炎患者肝組織中HBV cccDNA ；C 本發(fā)明的PSAD消化+RCA+跨缺口原位PCR法檢測慢性乙型肝炎患者肝組織中 HBV cccDNA ；
圖2是不同檢測方法檢測乙肝肝硬化患者肝組織中HBV cccDNA，其中A 原位PCR方法檢測乙肝肝硬化患者肝組織中HBV cccDNA ；B =PSAD消化+跨缺口原位PCR法檢測乙肝肝硬化患者肝組織中HBV cccDNA ；C 本發(fā)明的PSAD消化+RCA+跨缺口原位PCR法檢測乙肝肝硬化患者肝組織中 HBVcccDNA ；圖3是不同檢測方法檢測肝癌患者肝組織中HBV ccc DNA，其中A 原位PCR方法檢測肝癌患者肝組織中HBV cccDNA ；B =PSAD消化+跨缺口原位PCR法檢測肝癌患者肝組織中HBV cccDNA ；C 本發(fā)明的PSAD消化+RCA+跨缺口原位PCR法檢測肝癌患者肝組織中 HBVcccDNA ；圖4是陰性對照，即采用本發(fā)明方法檢測丙型肝炎患者、健康人、轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中HBV cccDNA ；對乙肝肝癌患者肝組織分別設(shè)立無引物、無地高辛標(biāo)記引物、無TaqDNA 聚合酶反應(yīng)體系作為陰性對照。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中提到的PSAD酶和PhU9 DNA聚合酶分別購自Epicentre和New England Biolab，滾環(huán)引物由上海生物工程有限公司合成。實(shí)施例1直接觀察HBVcccDNA在肝組織中分布定位的檢測方法一、研究樣本研究對象為解放軍302醫(yī)院2010年3月 2011年5月期間50例慢性乙型肝、肝硬化、肝細(xì)胞癌患者，其中男34例，女16例，年齡范圍7 68歲。診斷符合2000年第十次全國病毒性肝炎會(huì)議修訂的病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒及輸血傳播病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒感染以及酒精性、藥物性、自身免疫性肝病。另收集非乙肝患者肝組織樣本作為陰性對照。二、方法1、組織切片的處理把來自患者的肝穿組織放入10%甲醛固定液(85%無水乙醇、10%甲醛、5%冰醋酸)70°C，20分。梯度乙醇溶液脫水95%乙醇I 70°C 20分一95%乙醇II70°C 20分一無水乙醇I 70°C 20分一無水乙醇II70°C 20分乙醇；二甲苯透明20分；石蠟浸蠟30分； 包埋框包埋。肝組織切片。為防止組織脫落并使PCR反應(yīng)成分穿透組織到達(dá)肝細(xì)胞核內(nèi)， 并充分的與靶基因結(jié)合，首先將石蠟包埋的肝組織切成5 μ m,貼于用APES硅化處理過的載玻片上，60°C烘烤池。組織切片按常規(guī)脫蠟至水洗；用0. 2mmol/L的HCL室溫作用3分鐘， IxPBS洗滌；0. 1 %的TritonX-IOO室溫10分鐘，IxPBS洗滌；50 μ g/ml蛋白酶K室溫消化 5分鐘，IxPBS洗滌；梯度乙醇脫水，室溫干燥。2、設(shè)計(jì)、合成引物與地高辛標(biāo)記探針根據(jù)我國常見的HBV基因型B，C基因組全序列，設(shè)計(jì)引物及探針RCAl CATCCTCACAATA*C*CRCA2 GGCTATTCTCCTOOCRCA3 AGTATGGGAGTGG*G*C
RCA4 AGTTTGTCCAAGG*G*CRCA5 ATGCAACTTTTTC*A*CRCA6 CTAGCAGAGCTTG*GRCA7 TACAAGAAGAACT*CRCA8 CCCGGGACATATT*GP59 :5-GGCCACCTCTCTTTA-3P83 5-DIGCGGCACAGCTTGGAGG-33、Plasmid safe ATP_d印endent Dnase 酶消化在玻片上滴加現(xiàn)配的PSAD酶(反應(yīng)緩沖液1微升，ΑΤΡ0. 6微升，PSAD酶0. 5微升，H20 13.3微升)在組織上，37 0C 30分。4、滾環(huán)擴(kuò)增在組織上力口入RCAl、RCA2、RCA3、RCA4、RCA5、RCA6、RCA7、RCA8 八個(gè)弓丨物，每個(gè)弓I 物 0. 8μ 1。95°C 3min，55°C 15s，33°C 15s，20°C IOmin ；再將上述八個(gè)引物0. 8 μ 1/每個(gè)引物，PhU9DNA 聚合酶 1 μ l，PhU9 buffer 1 μ 1，BSA 0. 2 μ 1，d NTP 1. 6 μ 1，無菌去離子水 4. 2 μ 1滴加到組織上。30°C 18個(gè)小時(shí)。5、原位PCR擴(kuò)增肝組織中HBVcccDNA 在肝組織上滴加原位PCR反應(yīng)液(標(biāo)記了地高辛的引物1 μ 1，Mg2+3y 1, dNTP 5μ l，Taq酶 1μ 1，PCR 緩沖液 10μ 1)，95°C 3 分，94°C 1 分，58°C 1 分，72°C 1 分，30 個(gè)循環(huán)， 72 °C 10 分。6、信號(hào)檢測用無水乙醇浸泡10分鐘，4%多聚甲醛固定30分鐘，IxTBS洗滌3次；3% BSA室溫3分鐘，滴加堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，37°C孵育2h，IxTBS洗滌；滴加NBT/BCIP， 暗處室溫顯色0. 5h ；0. 核固紅復(fù)染胞核；室溫干燥后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察分析并記錄結(jié)果。陽性胞核為藍(lán)色、紫色及紫藍(lán)色，陰性胞核為紅色細(xì)胞內(nèi)陽性顆粒半定量分析(“)未見陽性結(jié)果；(+)細(xì)胞核上存在散在、稀疏的陽性顆粒；(++)胞核上陽性顆粒易見；(+++)介于(++)與(++++)之間；(++++)陽性結(jié)果布滿整個(gè)胞核。組織切片陽性分析根據(jù)切片中陽性信號(hào)表達(dá)數(shù)量/該片中估算的細(xì)胞總量，計(jì)數(shù)5-10個(gè)視野，計(jì)算肝細(xì)胞中總陽性表達(dá)率的平均值。7、特異性、靈敏度和可重復(fù)性實(shí)驗(yàn)分別用原位PCR(PCR-ISH)、PSAD消化HBV非共價(jià)閉合環(huán)狀DNA后直接原位PCR 法(PSAD+PCR-ISH)及PSAD消化HBV非共價(jià)閉合環(huán)狀DNA后用RCA+跨缺口原位PCR法 (PSAD+RCA+PCR-ISH，本發(fā)明方法)進(jìn)行HBV cccDNA原位檢測，對臨床來源的10份樣本分別進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。以丙型肝炎患者、健康人、轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織作為陰性對照。8、慢乙肝、乙肝肝硬化、肝細(xì)胞癌患者肝組織HBV cccDNA檢測采用PSAD酶消化后用RCA+跨缺口原位PCR方法(PSAD+RCA+PCR-ISH)分別對50 例慢乙肝、肝硬化、肝細(xì)胞癌患者進(jìn)行HBV cccDNA檢測。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
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1、方法特異性、靈敏度和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)分別以慢乙肝、肝硬化、肝癌患者肝組織為樣本，分三組進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)I組肝組織直接原位PCR方法(PCR-ISH)；II組肝組織經(jīng)PSAD消化后直接跨缺口原位PCR(PSAD+PCR-ISH)；III組肝組織經(jīng)PSAD消化后用RCA+跨缺口原位PCR擴(kuò)增(PSAD+RCA+PCR-ISH， 本發(fā)明方法)；陽性標(biāo)本中均可見原位擴(kuò)增后的HBV cccDNA陽性信號(hào)(圖1 3)，以核型為主， 呈濃密的藍(lán)紫色顯色。對照組均為陰性(圖4)。結(jié)果提示HBV-cccDNA主要存在于細(xì)胞核中，為乙肝病毒持續(xù)感染及復(fù)制的根源。圖IA和圖IB分別采用PCR-ISH和PSAD+PCR-ISH法檢測慢性乙型肝炎患者肝組織標(biāo)本HBV cccDNA, HBV cccDNA陽性信號(hào)很弱(隱約可見藍(lán)色)。圖IC采用本發(fā)明的PSAD消化+RCA+跨缺口原位PCR (PSAD+RCA+PCR-ISH)法檢測慢性乙型肝炎患者肝組織標(biāo)本HBV cccDNA,HBV cccDNA陽性信號(hào)(藍(lán)紫色)主要分布在肝細(xì)胞核(X400)。圖2A和圖2B分別采用PCR-ISH和PSAD+PCR-ISH法檢測乙肝肝硬化患者肝組織標(biāo)本HBV cccDNA, HBV cccDNA陽性信號(hào)很弱(隱約可見藍(lán)色)。圖2C采用本發(fā)明的PSAD消化+RCA+跨缺口原位PCR法檢測乙肝肝硬化患者肝組織標(biāo)本HBV-cccDNA，HBV-cccDNA陽性信號(hào)(藍(lán)紫色)主要分布在肝細(xì)胞核(X400)。圖3A和圖;3B分別采用PCR-ISH和PSAD+PCR-ISH法檢測肝癌患者肝組織樣本 HBVcccDNA, HBV cccDNA陽性信號(hào)很弱(隱約可見藍(lán)色)。圖3C采用本發(fā)明的PSAD消化+RCA+跨缺口原位PCR (PSAD+RCA+PCR-ISH)法檢測肝癌患者肝組織標(biāo)本HBV cccDNA, HBV cccDNA陽性信號(hào)(藍(lán)紫色)主要分布在肝細(xì)胞核 (X400)。圖4HCV采用本發(fā)明的PSAD消化+RCA+跨缺口原位PCR (PSAD+RCA+PCR-ISH)法檢測丙型肝炎患者肝組織標(biāo)本HBV-cccDNA，胞核為紅色，未見HBV cccDNA陽性信號(hào)(藍(lán)紫色) (X20)；圖4HCC采用本發(fā)明的PSAD消化+RCA+跨缺口原位PCR (PSAD+RCA+PCR-ISH)法檢測肝癌患者肝組織標(biāo)本HBV cccDNA,反應(yīng)體系中不加引物，胞核為紅色，未見HBVcccDNA陽性信號(hào)(藍(lán)紫色)(X20)；圖4health adult采用本發(fā)明的PSAD消化+RCA+跨缺口原位 PCR(PSAD+RCA+PCR-ISH)法檢測健康人肝組織標(biāo)本HBV cccDNA,胞核為紅色，未見HBV cccDNA陽性信號(hào)(藍(lán)紫色)(X20)；圖4transgenic mice采用本發(fā)明的PSAD消化+RCA+跨缺口原位 PCR(PSAD+RCA+PCR-ISH)法檢測轉(zhuǎn)基因鼠肝組織標(biāo)本HBV cccDNA,胞核為紅色，未見HBV cccDNA陽性信號(hào)(藍(lán)紫色)(X20)。采用本發(fā)明方法，對臨床來源的10份樣本進(jìn)行3次重復(fù)檢測，組內(nèi)組間差異無顯著性(ρ < 0. 05)。表明本方法穩(wěn)定性及可重復(fù)性較好。通過分析50例患者肝組織中HBV cccDNA分布可知，肝組織中HBV cccDNA大多分布于細(xì)胞核，呈濃密的藍(lán)色或紫藍(lán)色，呈顆粒狀、弧形或圓形團(tuán)塊狀，主要在核及核膜上表達(dá)，(+)—(++++)之間不等。陰性患者及陰性對照肝細(xì)胞胞核為紅色，未見陽性細(xì)胞。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論采用滾環(huán)擴(kuò)增加跨缺口原位PCR的方法檢測乙型肝炎患者肝細(xì)胞內(nèi)HBVcccDNA的分布和定位情況，具有較好的特異性和可靠性。滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)的特點(diǎn)是只能擴(kuò)增閉合環(huán)狀DNA，因而用來擴(kuò)增HBV cccDNA可提高檢測的特異性；通過PSAD酶消化，可去除非共價(jià)閉合環(huán)狀DNA的干擾。由于HBVcccDNA 的含量通常較低，滾環(huán)擴(kuò)增具有在相應(yīng)引物存在下能同溫滾動(dòng)復(fù)制的特征，在PSAD酶消化基礎(chǔ)上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，可以大大提高檢測的靈敏度；加跨缺口 PCR，進(jìn)一步去除PSAD酶未消化完全的非共價(jià)閉合環(huán)狀DNA，進(jìn)一步增強(qiáng)了特異性。綜上證實(shí)，本方法具有較好的特異性、靈敏性和穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
1.一種直接觀察HBVcccDNA在肝組織中分布定位的檢測方法，步驟為將患者肝組織樣本固定，消化，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物；其特征是1)所述樣本固定是將肝組織樣本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片；2)所述消化是用蛋白酶和PSAD酶進(jìn)行消化；3)所述PCR擴(kuò)增是在肝組織切片上進(jìn)行原位滾環(huán)加跨缺口PCR擴(kuò)增；4)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測是在滾環(huán)加跨缺口PCR擴(kuò)增后的肝組織切片上滴加堿磷酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，孵育一定時(shí)間后，滴加NBT/BCIP ；室溫普通顯微鏡下肉眼直接觀察肝組織切片顯色情況，細(xì)胞核出現(xiàn)藍(lán)色、紫色及紫藍(lán)色顆粒者為HBVcccDNA表達(dá)陽性，細(xì)胞核出現(xiàn)紅色者為HBVcccDNA表達(dá)陰性；5)整個(gè)檢測過程均在載有肝組織切片的玻璃載玻片上進(jìn)行。
2.權(quán)利要求1所述的方法，所述肝組織樣本固定的方法是將肝組織樣本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，二甲苯脫蠟后，梯度乙醇脫水，室溫干燥。
3.權(quán)利要求1所述的方法，所述消化是先采用蛋白酶消化肝組織切片增加組織通透性，然后采用PSAD酶消化肝組織中非共價(jià)閉合環(huán)狀DNA。
4.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)行原位滾環(huán)加跨缺口PCR擴(kuò)增所用儀器為原位PCR儀。
5.權(quán)利要求1或4所述的方法，進(jìn)行原位滾環(huán)加跨缺口PCR擴(kuò)增是在組織切片上加入滾環(huán)擴(kuò)增引物和跨缺口引物，進(jìn)行滾環(huán)加跨缺口原位PCR擴(kuò)增HBVcccDNA。
6.權(quán)利要求1所述的方法，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測是在組織切片上滴加堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，37°C孵育，IX TBS洗滌；滴加NBT/BCIP，暗處室溫顯色；0. 核固紅復(fù)染胞核，室溫干燥后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。
7.一種可直接觀察HBVcccDNA在肝組織中的分布及定位的檢測試劑盒，含有去污劑、 dNTP和1XPBS，其特征是還含有以下一種或多種物質(zhì)組織切片固定劑、脫蠟試劑、封閉試劑、蛋白酶、PSAD酶、PhU9 DNA聚合酶、滾環(huán)引物和地高辛標(biāo)記引物。
8.權(quán)利要求7所述的試劑盒，還含有I^i29buffer、堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體、 1XTBS、NBT/BCIP、核固紅；且所述組織切片固定劑是10%甲醛；所述蛋白酶是蛋白酶K，所述脫蠟試劑是二甲苯，所述封閉試劑是BSA、所述去污劑是TritonX-100。
9.權(quán)利要求7所述的試劑盒，其檢測方法是將肝組織樣本固定，石蠟包埋，進(jìn)行消化， 然后進(jìn)行原位滾環(huán)加跨缺口 PCR擴(kuò)增，最后在顯微鏡下肉眼直接觀察肝組織切片顏色。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種原位檢測乙肝病毒cccDNA的方法和試劑盒。將肝組織樣本切片固定，進(jìn)行消化，然后進(jìn)行原位滾環(huán)加跨缺口PCR擴(kuò)增，最后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。本方法可直接觀察到HBV cccDNA在肝組織中的分布和定位，且操作比較簡便，不需要將肝組織制成勻漿，不需抽提出核酸做模板，判定結(jié)果也不需要制做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102534047SQ20111032802
公開日2012年7月4日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者鐘彥偉 申請人:鐘彥偉