專利名稱：黑楊中具有抗蟲效果的胰蛋白酶抑制劑基因及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。涉及一種黑楊基因及用途。
背景技術(shù)：
林木植物是大多數(shù)生態(tài)系統(tǒng)中的主要生命形式，在所有陸地生態(tài)系統(tǒng)中具有最大的生物量和生物生產(chǎn)力，因此具有重要的經(jīng)濟及生態(tài)價值。目前僅我國每年由于森林病蟲害導(dǎo)致的直接經(jīng)濟損失已達千億元，而通過化學(xué)殺蟲劑控制森林病蟲害不僅生產(chǎn)成本高， 且造成生態(tài)環(huán)境的惡化，同時對人畜也產(chǎn)生嚴(yán)重危害，利用基因工程培育抗病蟲植物成為植物病蟲害防治的重要手段。在利用基因工程提高森林物種抗病蟲害能力的工作中，尋找安全、有效的目的基因以供轉(zhuǎn)化是工作的基礎(chǔ)。林木植物由于生長周期較長，總是面臨周圍環(huán)境中各種病蟲害的侵犯，因此在長期的演化過程中，他們自身已獲得了適度、有效的生物抗性機制，能夠最大限度地避免逆境的危害。通過深入挖掘并研究林木植物這種自身的病蟲害防御機制，并在生產(chǎn)實踐中進行應(yīng)用，是當(dāng)前利用基因工程方法進行林木植物病蟲害防治研究中的首要任務(wù)。廣泛存在于植物組織中的蛋白酶抑制劑(protease inhibitor,PI)是一種多肽物質(zhì)，具有抑制病原微生物及某些昆蟲體內(nèi)蛋白消化酶的活性，是植物自然防御體系的重要組成部分。由于來源于林木的植物蛋白酶抑制劑研究開展較晚，木本植物中的植物蛋白酶抑制劑迄今為止僅在蘋果等薔薇科植物和楊柳科植物的歐洲白楊中發(fā)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種黑楊中具有抗蟲效果的胰蛋白酶抑制劑基因。本發(fā)明的第二個目的是提供一種黑楊中具有抗蟲效果的胰蛋白酶抑制劑基因的用途。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下黑楊中具有抗蟲效果的胰蛋白酶抑制劑基因，其特征是用序列表SEQ ID NO. 1或 SEQ IDN0. 2 所示。黑楊中具有抗蟲效果的胰蛋白酶抑制劑基因在防治植物蟲害的應(yīng)用。本發(fā)明分離到黑楊Kimitz型胰蛋白酶抑制劑基因(PnKTIs)，它們對機械損傷以及蟲咬兩種外界誘導(dǎo)刺激均具有高誘導(dǎo)特性，實驗證明具有抗蟲效果，顯著降低了鱗翅目昆蟲的成活率。該發(fā)明能夠為從事抗蟲轉(zhuǎn)基因工程及生防相關(guān)研究人員提供新型抗蟲基因，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展新的抗蟲手段，降低農(nóng)藥使用及其對環(huán)境的惡性污染，維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡和可持續(xù)性發(fā)展。


圖1為黑楊蟲咬后的KTI基因的實時定量PCR結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例11.從楊屬模式植物黑楊中分離出胰蛋白酶抑制劑基因。1. 1通過BLAST搜索基因數(shù)據(jù)庫中的KTI基因，進行多重序列比對。1.2設(shè)計基因特異性引物，利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從黑楊中分離Kimitz型胰蛋白酶抑制劑基因家族中各成員基因。2.通過實時定量PCR和半定量法分析上述Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因的應(yīng)答特性。3.挑選具有高誘導(dǎo)性的Kimitz型胰蛋白酶抑制劑基因，克隆其全長編碼序列 PnKTI A6 DNA 序列(SEQ ID NO. 1 所示)和 PnKTI D2 DNA 序列(SEQ ID NO. 2 所示)用黑楊蟲咬以后M小時，收集葉子，進行RT-PCR試驗的結(jié)果，使用18S rRNA基因作為參考，計算轉(zhuǎn)入基因的相對表達量。其中對照組的表達水平按照1計算。見圖1。實施例2PnKTI A6 DNA 序列(SEQ ID NO. 1 所示)和 PnKTI D2 DNA 序列(SEQ ID NO. 2 所示)在人工機械損傷和春尺蠖蟲咬誘導(dǎo)下的應(yīng)答特性。在擬南芥中過量表達楊樹蛋白酶抑制劑基因可增強對小菜蛾的抗性1.用分離出的SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示的已知序列，設(shè)計引物上游引物5，-ATGAAGATCACTAAAT-3，(SEQ ID N0. 3 所示)；下游引物5，-AATGGTGTCAGAATGA-3，(SEQ ID N0. 4 所示)；擴增后片段經(jīng)酶切連入pCGN1548雙元載體后電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58供擬南芥轉(zhuǎn)化。2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥將農(nóng)桿菌接種于IOml的YEB培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)過夜，之后按照1 50的比例轉(zhuǎn)接入200ml YEP培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)至OD為0. 7時(也可以是0. 6或0. 8)，5000rpm 離心5分鐘，收集菌體。菌體懸于蔗糖溶液調(diào)OD值至0.8。將開花的擬南芥倒置于裝有轉(zhuǎn)化液的容器中，使整個花序浸泡在菌液中15秒，取出擬南芥橫躺在托盤中，用塑料薄膜保濕，并暗處理Mh，然后在合適光照條件下使其距常生長，直到種子成熟。3.擬南芥檢測與篩選將表面進行過消毒的擬南芥種子均勻播種于含有50 μ g/ml卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基上，在合適的光照強度下生長一周，篩選葉子為深綠色的陽性轉(zhuǎn)化植株。待轉(zhuǎn)化植株長到3-4片真葉時，移植到土壤中，收集種子為Tl代轉(zhuǎn)化種子。從葉片中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后以cDNA為模板，用實時定量方法分析獨立轉(zhuǎn)化植株的目的基因表達量。選擇表達量高的Tl 植株進行繼代培養(yǎng)，收集T3代種子，并篩選出純合體供抗性實驗使用。4.抗蟲性測定每種轉(zhuǎn)基因擬南芥選擇三個獨立轉(zhuǎn)化株系進行抗性試驗。每個實驗組飼養(yǎng)50只小菜蛾，每天加入相同重量的新葉，統(tǒng)計剩余舊葉，并且更換培養(yǎng)皿。一周后統(tǒng)計每個實驗組內(nèi)小菜蛾的平均重量、死亡率、結(jié)繭率和化蛾率?？瓜x性測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.黑楊中具有抗蟲效果的胰蛋白酶抑制劑基因，其特征是用序列表SEQID NO. 1或SEQ IDN0. 2 所示。
2.權(quán)利要求1所述基因在防治植物蟲害的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了黑楊中具有抗蟲效果的胰蛋白酶抑制劑基因及用途，黑楊中具有抗蟲效果的胰蛋白酶抑制劑基因，用序列表SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；本發(fā)明分離到黑楊Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因(PnKTIs)，它們對機械損傷以及蟲咬兩種外界誘導(dǎo)刺激均具有高誘導(dǎo)特性，實驗證明具有抗蟲效果，顯著降低了鱗翅目昆蟲的成活率。該發(fā)明能夠為從事抗蟲轉(zhuǎn)基因工程及生防相關(guān)研究人員提供新型抗蟲基因，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展新的抗蟲手段，降低農(nóng)藥使用及其對環(huán)境的惡性污染，維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡和可持續(xù)性發(fā)展。
文檔編號C12N15/15GK102392027SQ201110326290
公開日2012年3月28日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者宋英今, 楊少輝, 王潔華, 陳姍 申請人:天津大學(xué)