專利名稱：預(yù)防西尼羅河病毒的重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E及疫苗與應(yīng)用的制作方法
預(yù)防西尼羅河病毒的重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E及疫苗與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于動(dòng)物病毒學(xué)和動(dòng)物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種表達(dá)西尼羅河病毒prM/E蛋白的重組假型桿狀病毒株的構(gòu)建、用該重組病毒制備的疫苗及其在預(yù)防西尼羅河病毒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
西尼羅河熱(West Nile Fever,簡稱WNF)是由西尼羅河病毒(West Nile Virus, WNV)感染引起的人和多種動(dòng)物共患的急性傳染病。1937年，WNV首次在兩尼羅河地區(qū)一個(gè)發(fā)燒的烏干達(dá)婦女血液中分離出來，并命名為西尼羅河病毒。1999年美國出現(xiàn)疫情，并于隨后幾年迅速擴(kuò)散至全美大部分地區(qū)，導(dǎo)致兩萬多人感染，數(shù)百人死亡(Nash D.F等，The outbreak of West Nile virus infection in the New York City area in 1999. N. Engl. J. Med. 2001,344 :1807-1814)，一度引發(fā)世界性恐慌。目前，該病還沒有有效的疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防。迄今為止，中國尚未發(fā)現(xiàn)WNV感染的臨床病例，但是中國的氣候、地里環(huán)境復(fù)雜，蚊蟲種類繁多，具備傳播條件，隨著國際交流的日益頻繁，WNV傳入中國境內(nèi)的可能性非常大。 因此，開展該病的疫苗研究，對(duì)于WNV的預(yù)防具有重要的意義。
WNV是不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，是一種B群蟲媒病毒，病毒核殼外面包裹著脂質(zhì)雙層膜，膜內(nèi)鑲嵌有前膜蛋白(premembrine protein, PrM)和包膜蛋白(envelope protein, E)。E蛋白是WNV重要的結(jié)構(gòu)蛋白，屬糖蛋白，具有血細(xì)胞凝集素活性，并介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)的粘附和膜融合，是重要的毒力因子；而且具有很強(qiáng)的免疫原性，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生病毒中和抗體，逃避宿主免疫監(jiān)督系統(tǒng)的攻擊。而PrM蛋白對(duì)于E蛋白的正確折疊和切割具有重要作用(Beasley D.W 等，Identification of neutralizing epitopes within structural domain III of the West Nile virus envelope protein. J. Virol. 2002, 76:13097-13100.)。因此，prM/E基因作為WNV的主要免疫原性基因，是研制WNV新型疫苗的主要候選基因。NaohiiO Ohtaki選用CHO細(xì)胞系穩(wěn)定的持續(xù)性共表達(dá)WNV的M前體蛋白(prM)和E蛋白形成VLPs (virus-like particles)，這種大量表達(dá)的VLPs蛋白作為免疫原能保護(hù)小鼠抵抗 WNV(Naohiro Ohtaki 等，Immunogenicity and efficacy of two types of West Nile virus-like particles different in size and maturation as a second-generation vaccine candidate. Vaccine. 2010，28 :6588-6596)。Arroyo J 等利用黃熱病毒YFV-17D作為載體將WNV的prM/E蛋白閱讀框取代黃熱病毒自身的蛋白，構(gòu)建嵌合疫苗(Arroyo J等，Chimer1-vax-West Nile virus live attenuated vaccine preclinical evaluation of safety, immunogenicity and efficacy. J Virol. 2004. 78 497-507.)。這種嵌合疫苗產(chǎn)生了很好的免疫效果，但是這種重組的病毒有可能產(chǎn)生未知的病原特性，不利于實(shí)時(shí)監(jiān)控。徐敏等應(yīng)用慢病毒載體包裝表達(dá)WNV prM/E基因的假病毒，并通過轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞證明該基因可以在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，從而為基于慢病毒載體的 WNV新型疫苗開發(fā)奠定基礎(chǔ)(徐敏等，慢病毒載體介導(dǎo)的西尼羅河病毒prME蛋白的表達(dá)，中國獸醫(yī)科學(xué)，2010，40 :778-782)。
桿狀病毒載體是目前應(yīng)用十分廣泛的病毒載體之一，它被廣泛的應(yīng)用于基因治療、基因功能研究、疫苗開發(fā)等領(lǐng)域。桿狀病毒是昆蟲病毒中最大的一個(gè)科，其宿主范圍主要集中在昆蟲綱鱗翅目。目前，用于外源基因表達(dá)的昆蟲桿狀病毒僅限于核多角體病毒屬，其中苜猜銀紋蛾多粒包埋體核多角型病毒(Autographa californica mulltiple nucleopolyhedrosis virus,簡稱AcMNPV)和草地貪夜蛾細(xì)胞系統(tǒng)是國際上普遍采用的桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)研究模型。長期以來研究者一直認(rèn)為桿狀病毒具有嚴(yán)格的宿主特異性，僅限用于介導(dǎo)外源基因在其受納昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。而研究認(rèn)為，在非受納昆蟲細(xì)胞中， 這種宿主特異性的產(chǎn)生并不是因?yàn)闂U狀病毒不能進(jìn)入細(xì)胞，而是因?yàn)槠浠虿荒茉诩?xì)胞內(nèi)復(fù)制和表達(dá)(Frederick M 等，Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. PNAS. 1996. 93 :2348-2352)。1993年Luckow等成功地將桿狀病毒系統(tǒng)改造成 Bac-to-Bac 系統(tǒng)(Luckow 等，Current Opinion in Biotechnology, 1993,4, 564-572),主要用于在昆蟲細(xì)胞中大量表達(dá)外源基因。1995年，Hofmann等首次報(bào)道了將由巨細(xì)胞病毒極早期啟動(dòng)子(cytomegalovirus immediate early promoter, CMV-1E)驅(qū)動(dòng)的螢光素酶基因重組至AcMNPV基因組，并用此重組AcMNPV感染幾種不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，結(jié)果表明此重組AcMNPV能感染原代人肝細(xì)胞且高效地表達(dá)了報(bào)告基因，其介導(dǎo)的報(bào)告基因的表達(dá)效率高于用磷酸韓沉淀法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(Hofmann C等，Efficient gene transfer into human hepatocytes by baculovirus vectors. PNAS. 1995. 2 :10099-10103) 進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新鮮的血清能阻止病毒介導(dǎo)的基因投送至肝臟細(xì)胞系，而熱滅活后的血清卻無此現(xiàn)象。用缺乏各種補(bǔ)體成分的血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，也沒有阻止病毒的侵入(Hofmann 等，Baculovirus-mediated gene transfer in the presence of human serum or blood facilitated by inhibition of the complement system. Gene Therapy. 1998. 5 531-536)。水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatatis Virus，VSV)膜融合蛋白 G 蛋白是一種穿膜糖蛋白，它能利用其膜融合的活性介導(dǎo)病毒基因組從哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)吞體中逃逸(Barsoum 等，Efficient transduction of mammalian cells by a recombinant baculovirus having the vesicular stomatitis virus G glycoprotein. Human Gene Therapy, 1997,8 :2011-2018) Aieroni等(2001)人研究證明直接注射到鼠四頭肌的VSV-G 假型桿狀病毒有一部分不被補(bǔ)體系統(tǒng)中和。并且這種假型桿狀病毒作為疫苗使用可以誘發(fā)免疫動(dòng)物產(chǎn)生高水平的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答(Pieroni等，In vivo gene transfer in mouse skeletal muscle mediated by baculovirus vectors. Human Gene Therapy, 2001. 12 :871-881)。YML等構(gòu)建的VSV-G假型重組桿狀病毒免疫小鼠，能夠抵抗致死劑量的 JEV 感染(YML Immunization with pseudotype baculovirus expressing envelope protein of Japanese encephalitis virus elicits protective immunity in mice. J Gene Med,2009. 11 :57-65)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù) 在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。其第一個(gè)目的在于獲得一種能夠有效轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞和高效表達(dá)西尼羅河病毒PrM蛋白和E蛋白的重組假型桿狀病毒。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是利用該重組基因工程毒株制備用于防制西尼羅河病毒的基因工程疫苗。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是利用該重組基因工程毒株在制備西尼羅河病毒基因工程疫苗上的應(yīng)用。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
一種由申請(qǐng)人制備的表達(dá)西尼羅河病毒prM蛋白和E蛋白的重組假型桿狀病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrosis virus,簡稱 AcMNPV) Bac-G-prM/E，于2011年8月25日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NO :V201130。
本發(fā)明重組假型桿狀病毒的基本構(gòu)建方法是申請(qǐng)人所在的農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建得到轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PCDNA3. l_prM/E(具體構(gòu)建過程見具體實(shí)施方式
)和 pFastBac-G (YML 等，Immunization with pseudotype baculovirus expressing envelope protein of Japanese encephalitis virus elicits protective immunity in mice. J Gene Med, 2009. 11 :57-65) 將來源于轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pCDNA3. 1-prM/E 的完整的表達(dá)盒即CMV-prM/E，經(jīng)Bgl II和EcoR I酶切后，插入上述構(gòu)建的能夠表達(dá)水泡性口膜炎病毒的膜蛋白G(基因登錄號(hào)AJ318514.1)的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-G和野生型轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacl (購自美國Invitrogen公司)的多克隆位點(diǎn)中，獲得重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pFastBac-G-prM/E 和 pFastBac-prM/E,其中重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pFastBac-prM/E 中表達(dá)盒 CMV-prM/E位于原始質(zhì)粒pFastBacl的pH多角啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)中。然后將上述兩種重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌(E. coli DHlOBac)(購自美國Invitrogen公司)細(xì)胞中，通過轉(zhuǎn)座重組(吳小鐸等，利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子構(gòu)建適于家蠶的Bac-to-Bac快速基因表達(dá)系統(tǒng)，蠶業(yè)科學(xué)，2006，32 =183-188.)，獲得含有CMV-prM/E表達(dá)盒的重組桿狀病毒基因組，將上述重組桿狀病毒基因組Bacmid-G-prM/E和Bacmid-prM/E轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)從而獲得攜帶CMV-prM/E-polyA表達(dá)盒的重組假型桿狀病毒 Bac-G-prM/E和Bac-prM/E。其中，重組桿狀病毒Bac-prM/E用來作為重組假型桿狀病毒 Bac-G-prM/E的對(duì)照，驗(yàn)證該重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E是否能更有效地感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。申請(qǐng)人獲得的重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E (保藏號(hào)為CCTCC NO V201130)能夠共表達(dá)西尼羅河病毒(WNV)的prM/E基因。
進(jìn)一步，本發(fā)明還包含利用上述的重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E用于制備預(yù)防西尼羅河病毒的疫苗，同時(shí)還包含利用上述重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E在制備西尼羅河病毒疫苗中的應(yīng)用(具體步驟請(qǐng)參見實(shí)施例)。
本發(fā)明的積極效果如下
1、本發(fā)明重組的假型桿狀病毒Bac-G-prM/E免疫原性好，能誘導(dǎo)產(chǎn)生高的IgG抗體和細(xì)胞免疫。
2、本發(fā)明重組的假型桿狀病毒Bac-G-prM/E轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，不會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用；在小鼠模型中，安全性高。
3、本發(fā)明重組的假型桿狀病毒Bac-G-prM/E作為預(yù)防西尼羅河病毒的疫苗免疫效果好，產(chǎn)生的體液免疫水平及細(xì)胞免疫水平明顯高于對(duì)照病毒組(P < 0. 01)。


序列表SEQ ID NO :1是本發(fā)明克隆的prM/E基因的的核苷酸序列，序列全長為 2058 個(gè)bp。
圖1 :是本發(fā)明構(gòu)建的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pcDNA3. Ι-prM/E的圖譜和對(duì)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pcDNA3.Ι-prM/E鑒定結(jié)果。其中A :是本發(fā)明構(gòu)建的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pcDNA3. Ι-prM/E圖譜。B 是本發(fā)明的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pcDNA3. Ι-prM/E鑒定結(jié)果。圖中1 DNA marker (DL5000)；
2 pcDNA3. Ι-prM/E轉(zhuǎn)移質(zhì)粒經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切鑒定結(jié)果
3 :DNA marker (DL15000)。
圖2 :是本發(fā)明的pFastBac-prM/E和pFastBac_G_prM/E重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒鑒定結(jié)果。
圖中1 DNA marker(DL5000)；
2 pFastBac-prM/E轉(zhuǎn)移質(zhì)粒Kpn I酶切鑒定結(jié)果；
3 pFastBac-G-prM/E轉(zhuǎn)移質(zhì)粒Xho I酶切鑒定結(jié)果；
4DNA marker(DL15000)。
圖3 :是本發(fā)明構(gòu)建的兩個(gè)重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒圖譜。圖中
A :是本發(fā)明的pFastBac-G-prM/E轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建流程圖。
B :是本發(fā)明的pFastBac-prM/E轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建流程圖。
圖4 :是本發(fā)明中的重組假型桿狀病毒基因組Bacmid-G-prM/E和Bacmid-prM/E 的PCR擴(kuò)增鑒定的電泳圖譜。
圖中A Bacmid-prM/E基因組PCR擴(kuò)增鑒定。
I DNA marker (DL5000)
2 P2和P3為引物，Bacmid-prM/E基因組為模板擴(kuò)增結(jié)果；
3 P2和P3為引物，野生型基因組為模板擴(kuò)增結(jié)果；
4DNA marker(DL15000)。
B :Bacmid-G-prM/E 基因組 PCR 擴(kuò)增鑒定；
I DNA marker (DL5000)；
2 P1和P3為引物，野生型Bacmid為模板擴(kuò)增結(jié)果；
3 P1和P3為引物，Bacmid-G-prM/E為模板擴(kuò)增結(jié)果。
圖5 :是本發(fā)明的重組假型桿狀病毒構(gòu)建流程。
圖6 :是本發(fā)明中的重組假型桿狀病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)prM/E基因，間接免疫熒光檢測分析圖(ant1-E-DIII單抗為一抗)。
圖中A Ba c-prM/E轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21細(xì)胞后prM/E在細(xì)胞中的表達(dá)；
B Bac-G-prM/E轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21細(xì)胞后prM/E在細(xì)胞中的表達(dá)；
C :Bac-EGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21細(xì)胞作為陰性對(duì)照；
D :Bac-G-EGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21細(xì)胞作為陰性對(duì)照。
圖7 :是本發(fā)明中的重組假型桿狀病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)prM/E基因 Western blot 分析圖(ant1-E-DIII 單抗為一抗)。
圖中1 Bac-G-prM/E轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21細(xì)胞后prM/E在細(xì)胞中的表達(dá)；
2 Bac-prM/E轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21細(xì)胞后prM/E在細(xì)胞中的表達(dá)；
3 :Bac-G-EGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21細(xì)胞作為陰性對(duì)照；
4 :Bae-EGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21細(xì)胞作為陰性對(duì)照；
5 :BHK-21細(xì)胞作為空白對(duì)照。
圖8 :是本發(fā)明中的重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E免疫小鼠后血清效價(jià)的檢測結(jié)果。
圖中3WeekS是初次免疫3周后小鼠血清ELISA效價(jià)水平；
6ffeeks是初次免疫6周后小鼠血清ELISA效價(jià)水平。
圖9 :熒光相對(duì)定量RT-PCR方法檢測免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞被特異抗原刺激后 IFN- Y、TNF-a、IL-2、IL-6 的 mRNA 水平。
圖中Bac-G-prM/EIO9 :滴度為 10lclpfu/ml Bac-G-prM/E 免疫組；
Bac-G-prM/E IO8 :滴度為 109pfu/ml Bac-G-prM/E 免疫組；
Bac-prM/E IO9 :滴度為 10lclpfu/ml Bac-prM/E 免疫組；
Bac-prM/E IO8 :滴度為 109pfu/ml Bac-G-prM/E 免疫組；
E-DIII pro. :E_DIII 蛋白免疫組;
Bac-G-EGFP IO9 :滴度為 10lclpfu/ml Bac-G-EGFP 免疫對(duì)照組；
Bac-EGFP IO9 :滴度為 10lclpfu/ml Bac-GFP 對(duì)照組；
PBS :PBS空白免疫對(duì)照組。
圖10 :是重組假型桿狀病毒免疫小鼠后ELISA檢測脾淋巴細(xì)胞被特異抗原刺激后 IFN-Y的分泌水平。
圖中Bac-G_prM/EIO9 :滴度為 10lclpfu/ml Bac-G-prM/E 免疫組；
Bac-G-prM/E IO8 :滴度為 109pfu/ml Bac-G-prM/E 免疫組
Bac-prM/E IO9 :滴度為 10lclpfu/ml Bac-prM/E 免疫組；
Bac-prM/E IO8 :滴度為 109pfu/ml Bac-G-prM/E 免疫組；
E-DIII pro. :E_DIII 蛋白免疫組;
Bac-G-EGFP IO9 :滴度為 10lclpfu/ml Bac-G-EGFP 免疫對(duì)照組；
Bac-EGFP IO9 :滴度為 10lclpfu/ml Bac-GFP 對(duì)照組；
PBS :PBS空白免疫對(duì)照組。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合說明書附圖對(duì)本發(fā)明`的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1
l、pcDNA3. Ι-prM/E 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建
本發(fā)明選取的西尼羅河病毒(WNV)的prM/E基因片段(其核苷酸序列見SEQ ID NO :1所示，序列長度為2058bp)由上海生工生物工程有限公司合成。用BamH I和EcoR I雙酶切(見圖1A)后,插入到經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切的質(zhì)粒pcDNA3. 1(+)(購自Invitrogen 公司，武漢生命技術(shù)有限公司代理)中。得到轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PCDNA3. Ι-prM/E (見圖1A)。用BamH I和EcoR I對(duì)構(gòu)建的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pcDNA3. Ι-prM/E進(jìn)行酶切鑒定，鑒定結(jié)果證實(shí)構(gòu)健的質(zhì)粒正確(見圖1B)。
2、pFastBac-G-prM/E 和 pFastBac-prM/E 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建
以Bgl II和EcoR I雙酶切含有西尼羅河病毒(WNV) prM/E基因的真核表達(dá)質(zhì)粒P⑶NA3. Ι-prM/E (插入了 prM/E基因片段，其核苷酸序列見SEQ ID NO :1，序列長度為2058bp)，回收含有完整的表達(dá)盒即CMV-prM/E的片段。并插入到經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-G (在pFastBacl質(zhì)粒基礎(chǔ)上插入VSV-G-BGH ployA基因，見文獻(xiàn)YML 等，Immunizationwith pseudotype baculovirus expressing envelope protein of Japanese encephalitis virus elicits protective immunity in mice. J Gene Med, 2009. 11 :57-65)和原始質(zhì)粒pFastBacl (購自Invitrogen公司，武漢生命技術(shù)有限公司代理)中，獲得本發(fā)明的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-G-prM/E和pFastBac-prM/E質(zhì)粒(見圖3)。 用Xho I對(duì)pFastBac-G-prM/E質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定結(jié)果證實(shí)所構(gòu)建的質(zhì)粒正確(見圖 2)，同時(shí)用Kpn I對(duì)pFastBac-prM/E質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定結(jié)果證實(shí)構(gòu)建質(zhì)粒正確(見圖2)。 具體構(gòu)建流程如圖3中A，B所示。3、利用同源重組的方法獲得重組假型桿狀病毒的基因組 Bacmid-G-prM/E 和 Bacmid-prM/E
具體步驟如下
在本實(shí)施例中，用pFastBac-G-prM/E和pFastBac-prM/E重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac (購自美國Invitrogen公司(武漢生命技術(shù)有限公司代理)的Bac-to-Bac 表達(dá)系統(tǒng)附帶的菌株；按照Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)的說明書操作)感受態(tài)細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)座重組方法(方法見吳小鐸等，利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子構(gòu)建適于家蠶的Bac-to-Bac快速基因表達(dá)系統(tǒng)，蠶業(yè)科學(xué)，2006,32 :183-188)，將 pFastBac-G-prM/E 和 pFastBac-prM/E 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中CMV-prM/E-PolyA表達(dá)盒重組入假型桿狀病毒基因組中，從而獲得重組假型桿狀病毒基因組Baemid-G-prM/E和Bacmid-prM/E，運(yùn)用常規(guī)報(bào)道的PCR方法(參照J(rèn).薩姆布魯克等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，2002，北京)分別對(duì)基因組Bacmid-G-prM/E和Bacmid-prM/E進(jìn)行鑒定。以Bacmid-G-prM/E基因組為摸板， 以 Pl (引物序列AAGGGAACAACCTATGG)和 P3 (引物序列AGCGGATAACAATTTCACACAGG)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定結(jié)果證實(shí)Bacmid-G-prM/E構(gòu)建正確(見圖4的B);以Bacmid-prM/ E基因組為模板，以P2(引物序列CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG)和P3 (引物序列 AGCGGATAACAATTTCACACAGG)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定結(jié)果證實(shí)Bacmid-prM/E構(gòu)建正確 (見圖4的A)。上述分別進(jìn)行的PCR反應(yīng)的總體積均為30ul，其中包括基因組模板各為2ul， 弓丨物各Iul，dNTTP和PCR反應(yīng)Buffer各3ul，taq酶各O. 5ul，上述PCR反應(yīng)采用寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的PCR反應(yīng)試劑盒，該試劑盒包括反應(yīng)緩沖液(PCR反應(yīng)buffer)、 dNTP、Mgcl2及Taq酶，操作方法按該試劑盒的說明書進(jìn)行)，其余用蒸餾水補(bǔ)齊體系。擴(kuò)增的條件均為93°C,3min ;緊接著35個(gè)循環(huán)94°C，45s ;55°C，45s ；72°C,5min ;最后72°C延伸至 IOrnin0
4、重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E的獲得
應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染技術(shù)(周復(fù)春等，偽狂犬病病毒鄂A株gG /LacZ +突變株的構(gòu)建，畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001，32 (2)，129-133)將重組假型桿狀病毒基因組 Bacmid-G-prM/E轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，操作方法參考樊惠英報(bào)道的方法樊惠英，豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及其特性，生物工程學(xué)報(bào)，2005，Vol. 21 :975-978.),于 2 7°C 下用 Grace’s 培養(yǎng)基(購自 Invitrogen 公司，武漢生命技術(shù)有限公司代理，按照美國Invitrogen公司提供的Bac-to-Bac桿狀病毒使用說明書進(jìn)行操作)培養(yǎng)，72h后收毒，盲傳三代。受重組假型桿狀病毒感染的細(xì)胞能觀察到細(xì)胞病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，停止分裂，折光率增強(qiáng)，直到細(xì)胞裂解，而且會(huì)有很明顯的細(xì)胞融合現(xiàn)象，正常細(xì)胞則沒有這種變化。將獲得的重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E在哺乳動(dòng)物細(xì)胞BHK-21細(xì)胞(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)中進(jìn)行表達(dá)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E和對(duì)照病毒Bac-prM/E均能介導(dǎo)外源基因(prM/E)進(jìn)入BHK-21細(xì)胞中，并能在人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子(CMV)的驅(qū)動(dòng)下高效表達(dá)西尼羅河病毒(WNV)的prM蛋白和E蛋白(見圖6，7)。獲得重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E的操作過程見圖5。
將上述得到的表達(dá)西尼羅河病毒prM蛋白和E蛋白的重組假型桿狀病毒 Bac-G-prM/E于2011年8月25日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號(hào)為CCTCC NO :V201130。
5、重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E基因工程疫苗的制備
將上述獲得的保藏號(hào)為CCTCC NO V201130的重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E 按照常規(guī)方法進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清，運(yùn)用超速離心方法(35000rpm)，離心Ih (儀器為 BECKMAN COULTER 公司生產(chǎn)的 Optima LE-80K Ultracentrifuge)離心后棄上清， 沉淀用 phosphate-buffered saline 憐酸鹽緩沖液(即 PBS,含 NaCl 8. 0g, KCl O. 2g, Na2HPO4 · 12H20 2. 9g，KH2PO4O. 2g，補(bǔ)充蒸餾水至 IOOOmL,經(jīng) 121 °C 高壓蒸汽滅菌 30min, pH7. 4)溶解,用空斑的方法(參照上述Invitrogen公司的Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)提供的說明書)進(jìn)行滴度測定后，將所述的重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E稀釋至lO'fu/ml， 置_80°C保存?zhèn)溆?，即得到本發(fā)明制備的重組假型桿狀病毒基因工程疫苗。
6、重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E基因工程疫苗對(duì)小鼠的免疫效力檢驗(yàn)
將上述制備的重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E基因工程疫苗(設(shè)計(jì)四個(gè)實(shí)驗(yàn)組包括(I)注射滴度為109pfu/ml重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E基因工程疫苗組；(2)1010pfu/ml重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E基因工程疫苗組；(3) 109pfu/ml重組桿狀病毒Bac-prM/E基因工程疫苗組；(4) 1010pfu/ml重組桿狀病毒Bac-prM/E基因工程疫苗組) 分別經(jīng)后腿肌肉注射6周齡的Balb/c小鼠(購自湖北省疾病預(yù)防控制中心)，每組6只， 每只小鼠注射劑量為100 μ 1，共免疫2次，首免后間隔3周。同時(shí)用PBS(配方與制備同上所述)作為免疫的陰性對(duì)照，用原核表達(dá)WNV E-DIII蛋白，經(jīng)提取包涵體純化得到的蛋白 (June Liu Characterization and application of monoclonal antibodies specifi c to West Nile virus envelope protein. Journal of Virological Methods,2008. 154 20-26)作為陽性對(duì)照用，每只小鼠后退肌肉注射50ug(劑量參照Byron E. Martina等發(fā)表的方法，Byron E. Martina 等，Immunization with West Nile virus envelope domainIII protects mice against lethal infection with homologous andheterologous virus. Vaccine. 2008,26 :153-157)。重組假型桿狀病毒 EGFP (YML 等，Immunization with pseudotype baculovirus expressing envelope protein of Japanese encephalitis virus elicits protective immunity in mice. J Gene Med. 2009,11 :57-65)作為假型桿狀病毒野毒對(duì)照。于首免后3、6周經(jīng)尾靜脈負(fù)壓采血，分離血清 ，檢測中和抗體；于首免后6周，通過頸椎處死所有免疫Balb/c小鼠，無菌取出脾臟，利用淋巴細(xì)胞分離液(購自天津TBD公司)分離脾淋巴細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞免疫如IFN-Y的mRNA轉(zhuǎn)錄、分泌水平等檢測(方法見:Xiao 等,Comparison of immune responses and protective efficacy of suicidal DNA vaccine and conventional DNA vaccine encoding glycoprotein C of pseudorabies virus in mice. Vaccine. 2004，22 :345-351)。Balb/c 小鼠首免后 3 周和 6周分別尾靜脈采血，分離血清進(jìn)行ELISA效價(jià)測定。用純化的E-DIII蛋白作為抗原，檢測血清效價(jià)。結(jié)果顯示本發(fā)明構(gòu)建的共表達(dá)西尼羅河病毒(WNV)的prM基因和E基因的重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E基因工程疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的血清效價(jià)明顯高于對(duì)照組，展示了本發(fā)明重組假型桿狀病毒基因工程疫苗能夠更好地誘發(fā)免疫動(dòng)物產(chǎn)生更高的血清效價(jià)(見圖8)。
7、ELISA方法檢測免疫Balb/c小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN- Y水平
采用鼠IFN-Y檢測試劑盒(platinum ELISA試劑盒購自ebioscience公司，按照該試劑盒說明書操作)檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞被特異抗原(E-DIII蛋白)刺激后分泌IFN- Y 的能力。結(jié)果本發(fā)明重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E基因工程疫苗免疫小鼠組的分泌 IFN-Y水平要顯著高于對(duì)照組和E-DIII蛋白免疫組(P < O. 01，t-test)。試驗(yàn)結(jié)果如圖 10。
8、熒光相對(duì)定量RT-PCR方法檢測免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞被特異抗原刺激后 IFN- Y、TNF- a、IL-2、IL-6 的 mRNA 水平
采用熒光相對(duì)定量RT-PCR方法(方法參見章靜波等，細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，化學(xué)工業(yè)出版社，2006年版)檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞被特異抗原刺激后IFN- Y、TNF- a、IL-2、 IL-6的mRNA水平。小鼠脾淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)特異抗原(E-DIII蛋白)刺激后，提取脾細(xì)胞總 RNA,利用購自上海 ToYoBo 公司提供的 2X SYBR Green Realtime PCR Master Mix 試劑盒(按照試劑盒的說明書操作)中oligo dT將mRNA體外轉(zhuǎn)錄成eDNA,利用β-actin 的特異性引物擴(kuò)增小鼠看家基因β-actin基因(登錄號(hào)NM_007393)，并將其作為相對(duì)定量RT-PCR的內(nèi)參；用IFN-Y、TNF-α、TL_2、IL-6特異性引物(見附錄2)擴(kuò)增小鼠 IFN-Y基因(登錄號(hào)NM_008337)、TNF-α基因(登錄號(hào)NM_013693)、IL-2基因(登錄號(hào) NM_008366)、IL-6基因(登錄號(hào)NM_031168)。熒光定量PCR反應(yīng)體系(總體積為25 μ I) 包括target gene和β-actin上下游引物各O. 5 μ I (引物濃度為10 μ M), PCR Master Mix 12. 5μ 1，雙蒸水ΙΙ.Ομ l，cDNA樣品0. 5μ I。每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)。反應(yīng)擴(kuò)增條件為 500C 2min，94°C預(yù)變性IOmin緊接著40個(gè)循環(huán)的94°C變性15s和60°C退火與延伸Imin0 整個(gè)反應(yīng)過程中的熒光信號(hào)的變化由ABI Prism 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(購自美國 Applied Biosystems公司，按照該儀器的說明書操作)檢測。結(jié)果顯示本發(fā)明的重組假型桿狀病毒基因工程疫苗免疫組中IFN-Y、TNF-a、IL-2、IL-6基因的mRNA水平要明顯高于其他免疫組(P < 0. 01，t-test)。試驗(yàn)結(jié)果參見圖9。
附錄I
術(shù)語 定義
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)西尼羅河病毒prM蛋白和E蛋白的重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)為CCTCC NO :V201130。
2.一種預(yù)防西尼羅河病毒的基因工程疫苗，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E。
3.權(quán)利要求1所述的重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E在制備預(yù)防西尼羅河病毒疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于動(dòng)物病毒學(xué)和動(dòng)物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表達(dá)西尼羅河病毒prM蛋白和E蛋白的重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E的構(gòu)建、疫苗制備及應(yīng)用。本發(fā)明得到一種表達(dá)西尼羅河病毒prM蛋白和E蛋白的重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E，該重組假型桿狀病毒保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏號(hào)為CCTCC NOV201130。本發(fā)明還公開了重組假型桿狀病毒的制備及在制備預(yù)防西尼羅河病毒疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明為預(yù)防西尼羅河病毒提供了新型基因工程疫苗。
文檔編號(hào)C12N7/01GK103045544SQ20111031471
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2011年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月17日
發(fā)明者曹勝波, 朱碧波, 徐敏, 葉靜, 楊曉紅, 陳龍, 陳煥春, 錢平, 肖少波 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)