專利名稱：一步法檢測z/s亞型埃博拉病毒的實(shí)時熒光定量rt-pcr方法及其試劑盒的制作方法
—步法檢測Z/S亞型埃博拉病毒的實(shí)時熒光定量RT-PCR方法及其試劑盒技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，特別涉及一種一步法檢測ζ/s亞型埃博拉病毒的實(shí)時熒光定量RT-PCR方法及其試劑盒和引物與探針。
背景技術(shù)：
埃博拉出血熱(Ebolahemorrhagic fever, EHF)是由埃博拉病毒(Ebolavirus, EB0V)引起的，主要以人和非人類靈長類動物為易感動物的急性出血性傳染病。該病1976 年首次發(fā)生于埃博拉河流域的剛果民主共和國(前扎伊爾)，因感染者全身呈出血癥狀，故命名為埃博拉出血熱。據(jù)推測最初人類感染EBOV主要是因?yàn)槿祟惤佑|感染了病毒的動物宿主或者間接宿主的身體。在這之后人與人之間通過直接接觸已經(jīng)感染了病毒的人的身體進(jìn)行傳播。在經(jīng)歷一段2-21天的潛伏期之后，感染病毒的病人就會出現(xiàn)一些發(fā)熱的癥狀。 EHF的主要特征是迅速發(fā)熱，寒冷，頭痛和肌肉疼痛，之后會產(chǎn)生咽喉腫痛，惡心，嘔吐，腹瀉以及腹痛。大約一半的病人會出現(xiàn)出血癥狀，例如從鼻孔出血，出現(xiàn)血尿或者是胃腸出血和陰道出血。EHF目前為止主要呈現(xiàn)地方性流行，絕大部分集中于非洲。非洲以外地區(qū)偶有病例報道，均屬于輸入性或?qū)嶒?yàn)室意外感染，未發(fā)現(xiàn)有EHF流行。EBOV已經(jīng)被證實(shí)是通過體液傳播的，如口腔和結(jié)膜接觸傳播，這在非人靈長類動物試驗(yàn)已確證。自然界的動物各種行為和其它因素都有可能造成EBOV的爆發(fā)。為了防止EBOV進(jìn)入我國，對我國的經(jīng)濟(jì)以及人身安全造成嚴(yán)重的損失，目前我國急需建立一種快速、準(zhǔn)確、敏感的檢測方法。
EHF的病原是EB0V，屬于絲狀病毒科(Filoviridae)絲狀病毒屬(Filovirus) 成員，是非分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒。目前已鑒定的埃博拉病毒有5種亞型，分別是: EBOV-扎伊爾型(Ebola-Zaire，簡稱 EB0V-Z)，EBOV-蘇丹型(Ebola-Sudan 簡稱 EB0V-S)， EBOV-本迪布焦型(Ebola-Bundibugyo,簡稱 EB0V-B), EBOV-科特迪瓦型(Ebola-1vory Coast,簡稱 EB0V-C)，EBOV-萊斯頓型(Ebola-Reston，簡稱 EB0V-R)。感染 EB0V-Z，EB0V-S 和EBOV-B的致死率大約在25% -90%。目前，EHF大爆發(fā)幾乎都是由EBOV-Z和EBOV-S引起的。這兩種亞型病毒的所造成的死亡人數(shù)占由EBOV所造成的死亡人數(shù)的98%以上，所以對Ζ/S兩種亞型的檢測方法建立成為EBOV防控的重點(diǎn)。
熒光定量RT-PCR具有快速、敏感和高通量的特點(diǎn)，一步法熒光定量RT-PCR方法還能降低殘留污染，并且熒光定量RT-PCR方法已作為多種病毒的檢測方法。在EBOV的檢測方法研究領(lǐng)域，IgG-捕獲ELISA和IgM-捕獲ELISA是僅有的兩類常用檢測方法，建立一種敏感、特異的熒光定量RT-PCR方法對EBOV的防控具有重要的實(shí)踐意義。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)沒有EBOV檢測技術(shù)的專利公布。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對沒有EBOV熒光定量PCR檢測技術(shù)的問題，提供一種在一次檢測中即可對Ζ/s兩種亞型埃博拉病毒進(jìn)行檢測的實(shí)時 熒光定量RT-PCR的檢測方法及其試劑盒。該方法檢測的敏感性可達(dá)到100個拷貝的病毒RNA分子，對于單個樣本檢測小于1. 5個小時，操作簡易，可以進(jìn)行高通量的樣品檢測。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明的技術(shù)方案一為，一種特異性擴(kuò)增Z/S亞型埃博拉病毒的引物對，所述的引物長度25±5nt，其中一條引物含有一個簡并堿基，該簡并堿基分別和Z、S兩種亞型EBOV 的特異性遺傳標(biāo)志序列的差異位點(diǎn)相同，該引物中該簡并堿基以外的序列與Z、S兩種亞型 EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列相同；另一條引物也含有一個簡并堿基，該簡并堿基分別和Z、 S兩種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列的差異位點(diǎn)互補(bǔ)，該引物中該簡并堿基以外的序列與Z、S兩種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列互補(bǔ)；該引物對的擴(kuò)增片段為70-300bp，優(yōu)選 196bp0
優(yōu)選的，所述的引物對中，一條是SEQ ID NO :16所示序列的核苷酸，另一條是SEQ ID NO :17所示序列的核苷酸。
本發(fā)明的技術(shù)方案二為，一種檢測Z/S亞型埃博拉病毒的探針，所述的探針長度為18±5nt，該探針含有一個簡并堿基，該簡并堿基分別和本發(fā)明的引物對在Z、S兩種亞型 EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列的差異位點(diǎn)相同，該探針中該簡并堿基以外的序列與本發(fā)明的引物對在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列相同；或者，該簡并堿基分別和本發(fā)明的引物對在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列的差異位點(diǎn)互補(bǔ)，該探針中該簡并堿基以外的序列與本發(fā)明的引物對在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列互補(bǔ)。
優(yōu)選的，所述的探針為Taqman探針。更優(yōu)選的，所述的探針為MGB探針。
優(yōu)選的，所述的探針的序列為SEQ ID NO 180
本發(fā)明的技術(shù)方案三為，一種檢測Z/S亞型埃博拉病毒的實(shí)時熒光定量RT-PCR試劑盒，該試劑盒包括如上所述的的本發(fā)明弓I物對以及探針。
優(yōu)選的，所述的試劑盒還包括陽性對照品、陰性對照品、RNA提取試劑、和熒光定量反應(yīng)液。
優(yōu)選的，所述的熒光定量反應(yīng)液包括PCR緩沖液、dUTPs溶液、Taq DNA聚合酶、AMV 酶、無菌雙蒸水和MgCl2溶液。
本發(fā)明的技術(shù)方案四為，一種一步法檢測Z/S亞型埃博拉病毒的實(shí)時熒光定量 RT-PCR方法，包括以下步驟
I)提取待檢樣品的RNA ；
2)將上述RNA加入熒光定量反應(yīng)液中，采用本發(fā)明所述的引物對以及探針，用實(shí)時熒光PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測；
3)通過比較待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值而對待檢樣品的其實(shí)拷貝數(shù)進(jìn)行定量。
本發(fā)明的技術(shù)方案五為，如上所述的試劑盒在常規(guī)非生物安全P4級實(shí)驗(yàn)室中檢測ζ/s兩種亞型埃博拉病毒的應(yīng)用。
本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。
相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下
本發(fā)明采用的EBOV Z、S亞型一步法MGB熒光定量RT-PCR檢測方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)特異性高。由于MGB探針熒光定量RT-PCR使用核酸雜交原理，具有很高的特異性。 同時，靶序列由引物和探針雙重控制，提高了特異性，降低假陽性；(2)靈敏度高。熒光定量RT-PCR利用擴(kuò)增產(chǎn)物的積累和熒光信號建立對應(yīng)關(guān)系，計算機(jī)輔助設(shè)備接受熒光信號并判定結(jié)果。檢測敏感性比常規(guī)RT-PCR更高。(3)操作簡單、高通量、防污染。使用一步法熒光定量RT-PCR檢測，不需要打開反應(yīng)管蓋進(jìn)行瓊脂糖電泳，不易污染后續(xù)待檢測樣品。擴(kuò)增和檢測一步完成，操作簡單，適合高通量大規(guī)模樣品檢測。(4)節(jié)約時間。采用一步法熒光定量RT-PCR，使RT反應(yīng)和PCR反應(yīng)過程在同一個反應(yīng)管中進(jìn)行，簡化了實(shí)驗(yàn)操作，整個實(shí)驗(yàn)可以更快速完成。(5)安全性高。本發(fā)明中采用的陽性對照是根據(jù)EBOV五種亞型病毒NP基因、MARV NP基因、XHFV NP基因、DHV NP基因序列體外轉(zhuǎn)錄的一段273nt的RNA分子，相對于以滅活病毒液作為陽性對照的檢測，增加了安全性，體外轉(zhuǎn)錄的RNA分子還可以大量制備，陽性對照來源穩(wěn)定、可靠，避免了滅活病毒株在每次實(shí)驗(yàn)中帶來的可能生物安全風(fēng)險。(6)EBOV屬于我國必須嚴(yán)密監(jiān)控其傳播入我國的急性烈性外來人獸共患傳染病，本發(fā)明建立的敏感性高、特異性強(qiáng)、安全性好，能夠同時檢測Ζ/S兩種最常見亞型的EBOV的檢測方法對我國EBOV的防控工作具有重要意義。(7)本發(fā)明是一種通用檢測方法，在一次PCR 檢測中就可以檢測Z、S兩種亞型EB0V。只要待檢樣品中有Z、S兩種亞型EBOV中的任何一種存在或者兩種同時都存在，就能檢測出來陽性。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。
圖1是引物和探針與EBOV、MARV, XFHV, DHFV相應(yīng)基因比對結(jié)果。
圖2是EBOV Z、S亞型一步法MGB熒光定量RT-PCR檢測方法擴(kuò)增曲線。
圖3是EBOV Z、S亞型一步法MGB探針熒光定量RT-PCR檢測方法敏感性擴(kuò)增曲線。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，從埃博拉病毒的NP基因中發(fā)現(xiàn)較合適的擴(kuò)增序列。其中，NP為主要的核衣殼蛋白。NP蛋白對于核衣殼組成至關(guān)重要。核衣殼是病毒吸附、侵入宿主細(xì)胞的主要功能者，與致病性關(guān)系重大，也是影起宿主細(xì)胞抗體反應(yīng)的關(guān)鍵。 因此，選擇這一 NP基因序列作為引物，具有很好的特征性。
由于埃博拉病毒的傳染性和致病性極強(qiáng)，埃博拉病毒的實(shí)驗(yàn)必須在生物安全4級實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作。目前世界上具備上述條件的實(shí)驗(yàn)室為數(shù)不多。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)埃博拉病毒NP基因的某一片段是埃博拉病毒的特征序列，可以代表埃博拉病毒而與其他病毒區(qū)分開來。而這一核苷酸片段沒有任何傳染性或致病性，可以在普通實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用，而不必在生物安全4 級實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作。由此本發(fā)明建立了一種在世界上非P4級實(shí)驗(yàn)室可以用的 檢測方法，可應(yīng)用于調(diào)查我國人或動物是否感染了 EB0V。
目前埃博拉病毒共有Z、S、B、C、R五種亞型，該五種亞型的多個埃博拉病毒株的NP 基因進(jìn)行同源性比較結(jié)果表明，5種亞型間基因序列同源性大于65%，亞型內(nèi)部毒株序列同源性95%以上，亞型間的差異區(qū)域集中在固定的點(diǎn)。
雖然通過同源性比較，NP基因的全長基因中有多個區(qū)域可以作為5種亞型埃博拉病毒的各個亞型的特異性標(biāo)志區(qū)域。但是SEQ ID NO USEQ IDNO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列是特別優(yōu)選的分別適合作為EBOV Z、S、B、C、R的特異性遺傳標(biāo)志的序列。因此,基于 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4, SEQID NO :5，本發(fā)明提供了各型埃博拉病毒的陽性標(biāo)準(zhǔn)分子。還提供了特異性擴(kuò)增這些陽性標(biāo)準(zhǔn)分子的引物對，所述的引物長度25-38個核苷酸，且一個與SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、或 SEQ ID NO 5 所示序列相同，另一個相應(yīng)的與 SEQ ID NO USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、或 SEQ ID NO :5 所示序列互補(bǔ)，并且擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為50-300bp，較佳的如297bp、196bp。例如，SEQ ID NO :6與SEQ ID N0:1所示的序列相同，而另一個引物SEQ ID NO :7與SEQ ID NO :1所示的序列互補(bǔ)，且擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為297bp。這些引物序列優(yōu)選SEQ ID NO 6 15所示。
雖然共有五種亞型的埃博拉病毒，分別為EBOV-Z，EBOV-S，EBOV-B，EBOV-C， EB0V-R。但是目前埃博拉出血熱大爆發(fā)幾乎都是由EBOV-Z和EBOV-S兩種引起的。這兩種亞型病毒的所造成的死亡人數(shù)占由EBOV所造成的死亡人數(shù)的98%以上。其它三種亞型病毒也就感染動物，如豬等引起發(fā)病。所以對Ζ/S兩種亞型的檢測方法建立成為EBOV防控的重點(diǎn)。
因此，本發(fā)明基于埃博拉病毒特異性標(biāo)志片段SEQ ID NO :1_5，本發(fā)明提供了一種利用PCR擴(kuò)增NP基因檢測Z、S兩種亞型埃博拉病毒的方法。還提供了一種快速定量檢測 Z、S兩種亞型埃博拉病毒的熒光定量PCR試劑盒。本發(fā)明的檢測中，最具有特色的是一次可以同時檢測z、S兩種亞型EBOV中的任何一種或者兩種。只要待檢樣品中有Z、S兩種亞型EBOV中的任何一種，或者兩者同時存在，就能檢測出來陽性，表示待檢樣品中含有Z、S兩種亞型EBOV中的任何一種或者兩種RNA。其中最關(guān)鍵的是使用了特殊的的引物對。
引物對
本發(fā)明人根據(jù)5種亞型埃博拉病毒的NP基因特異性標(biāo)志片段，利用他們之間序列上的共同點(diǎn)及其差異，設(shè)計了弓I物對。該引物對在EBOV-Z和EBOV-S的標(biāo)準(zhǔn)株中擴(kuò)增出相應(yīng)的DNA片段，而在其他的埃博拉亞型病毒EBOV-B，EBOV-C，EBOV-R的標(biāo)準(zhǔn)株中不能擴(kuò)增出相應(yīng)的DNA片段，也未在其他相關(guān)病毒，包括馬爾堡病毒、新疆出血熱病毒、登革熱病毒、乙型腦炎病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒中擴(kuò)增出相應(yīng)片段，說明以NP 基因片段為基礎(chǔ)設(shè)計的PCR反應(yīng)系統(tǒng)具有良好的特異性。并且該引物對可以在一個反應(yīng)體系中同時對兩種亞型埃博拉病毒EBOV-Z和EBOV-S進(jìn)行檢測。在一次PCR反應(yīng)中，就可以鑒定EBOV-Z和EBOV-S兩種病毒。只要待檢樣品中有Z、S兩種亞型EBOV中的任何一種存在或者兩種同時存在，就能檢測出來陽性。
就敏感性而言，本發(fā)明以NP基因特異性標(biāo)志片段為基礎(chǔ)設(shè)計的PCR反應(yīng)系統(tǒng)能夠檢測到IO2個陽性標(biāo)準(zhǔn)分子/μ I。本發(fā)明檢測的敏感性可達(dá)到100個拷貝的病毒RNA分子 (體外轉(zhuǎn)錄獲得)，對于單個樣本檢測小于2個小時，操作簡易，可以進(jìn)行高通量的樣品檢測。
本發(fā)明的 引物對對于Z、S兩種亞型EBOV中的任何一種都可以特異性擴(kuò)增得到產(chǎn)物，而對其他序列不能特異性擴(kuò)增，從而可以一次性檢測出待檢樣品中是否含有z、S兩種亞型EBOV中的任何一種或者兩種。該引物對中，引物長度25 ± 5nt，優(yōu)選20 ± 2nt，其中一條引物含有一個簡并堿基，該簡并堿基分別和Z、S兩種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列的差異位點(diǎn)相同，該引物中該簡并堿基以外的序列與Z、S兩種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列相同；另一條引物也含有一個簡并堿基，該簡并堿基分別和Z、S兩種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列的差異位點(diǎn)互補(bǔ)，該引物中該簡并堿基以外的序列與z、S兩種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列互補(bǔ)；該引物對的擴(kuò)增片段為70-300bp，優(yōu)選196bp。優(yōu)選的，所述的引物對中，一條是SEQID NO :16所示序列的核苷酸，另一條是SEQ ID NO :17所示序列的核苷酸。
本發(fā)明所述的特異性擴(kuò)增埃博拉病毒的引物以及檢測用探針，可根據(jù)本發(fā)明的遺傳標(biāo)記物的序列(SEQ ID N0:1 5)進(jìn)行設(shè)計，并通過常規(guī)的DNA合成方法獲得，例如可以用商業(yè)化的DNA自動合成儀合成。
本發(fā)明的這些弓I物可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或者其他化學(xué)發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明所述的引物和探針具有很好的亞種特異性。用本發(fā)明的引物進(jìn)行常規(guī) RT-PCR反應(yīng)，結(jié)果能從含有Z和/或S亞型埃博拉病毒RNA材料中擴(kuò)增出大小196bp的產(chǎn)物。因此，以本發(fā)明引物進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，并通過判斷相應(yīng)大小PCR產(chǎn)物的有無可以準(zhǔn)確、 快速的檢測埃博拉病毒，而且所需的樣品量很少。
探針
為了減少假陽性，還可以對擴(kuò)增產(chǎn)物用埃博拉病毒特異性探針進(jìn)行雜交。優(yōu)選 Taqman探針，更優(yōu)選MGB探針，它可在PCR反應(yīng)中直接實(shí)時的通過熒光信號反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與否以及數(shù)量的高低。MGB探針是一種新型TaqMan探針，具有特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好、優(yōu)化步驟簡單、結(jié)果精確、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)。探針3’端連接的是非熒光性的淬滅基因——淬滅基團(tuán)吸收報告基團(tuán)的能量后并不發(fā)光，大大降低了本底信號的干擾。MGB探針比普通的TaqMan探針背景熒光信號更低，檢測效果明顯優(yōu)于普通TaqMan探針。同時，MGB探針審計的長度較普通Taqman探針更短，可小于20bp。MGB探針可提高配對與非配對模板間的Tm值差異，當(dāng)非配對模板與配對模板間有一個堿基的差異時，該探針即不與其結(jié)合而不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而大大提高檢測的特異性。
本發(fā)明的探針在擴(kuò)增產(chǎn)物的基礎(chǔ)上設(shè)計，長度為18±5nt，最佳的是17nt。本發(fā)明的探針含有一個簡并堿基，該簡并堿基分別和本發(fā)明的引物對在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列的差異位點(diǎn)相同，該探針中該簡并堿基以外的序列與本發(fā)明的引物對在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列相同；或者，該簡并堿基分別和本發(fā)明的引物對在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列的差異位點(diǎn)互補(bǔ)，該探針中該簡并堿基以外的序列與本發(fā)明的引物對在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列互補(bǔ)。優(yōu)選的，探針序列為SEQ ID NO 18。
試劑盒
將本發(fā)明的引物與探針技術(shù)結(jié)合，便得到了本發(fā)明的埃博拉病毒的實(shí)時熒光定量 RT-PCR檢測方法及其試劑盒。這種方法不僅克服了常規(guī)RT-PCT方法中的誤差，而且分析所需的樣品量少，檢出極限低，靈敏度高。
在一優(yōu)選例中，一種檢測Ζ/S亞型埃博拉病毒的實(shí)時熒光定量RT-PCR試劑盒，該試劑盒包括特異性擴(kuò)增埃博拉病毒遺傳標(biāo)記分子的引物和熒光探 針。優(yōu)選的如引物序列為 SEQ ID NO: 16 和 SEQ ID NO : 17，熒光探針序列為 SEQ ID NO: 18。
該試劑盒較佳的還包括陽性對照品，陰性對照品。其中，陽性對照品是Z、S兩種亞型埃博拉病毒的遺傳標(biāo)記核苷酸，優(yōu)選SEQ ID NO :1、2所示序列核苷酸中的任何一種。陰性對照品是馬爾堡病毒、新疆出血熱病毒、或者登革熱病毒的NP基因?yàn)榛A(chǔ)的遺傳標(biāo)記核苷酸?；蛘呤且倚湍X炎病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒、豬繁殖或呼吸綜合征病毒的培養(yǎng)物。該試劑盒較佳的還包括定量校準(zhǔn)品。本發(fā)明中所述的定量標(biāo)準(zhǔn)品是陽性對照分子SEQ IDNO I(選擇本發(fā)明所述的5種亞型病毒陽性對照分子都可以)，定量時采用SEQ ID N0:1的10 倍梯度水稀釋液，稀釋度從ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟΛ在熒光定量PCR中，由于每個稀釋度中RNA分子不同，得到的Ct值就不同，根據(jù)定量標(biāo)準(zhǔn)品(梯度稀釋的陽性對照分子)Ct值定量樣品中的病毒RNA分子。
該試劑盒較佳的還包括常規(guī)的實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒所包含的成分， 如包括RNA提取試劑、實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測試劑。其中較佳的，RNA提取試劑含有 Trizol.RNA酶抑制劑。實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測試劑含有熒光定量反應(yīng)液，其中包括PCR 緩沖液、dUTPs溶液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、無菌雙蒸水、MgCl2溶液。
本試劑盒采用了熒光探針法進(jìn)行Real Time PCR的專用試劑，可快速對目的基因進(jìn)行定量檢測。較佳的，本試劑盒提供的實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測試劑中含有反應(yīng)液熒光定量組合物，其包含了引物、探針、Taq酶等所有組份。使用時只需加入模板即可進(jìn)行PCR反應(yīng)，操作非?？旖莺唵?。
熒光可以被定量PCR儀內(nèi)的熒光劑檢測，熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量成正比例關(guān)系。對埃博拉病毒的定量可以通過與定量校準(zhǔn)品的循環(huán)閾值(Ct, Threshold Cycle) 相比較得出。Ct值是PCR過程中，熒光量的積累超過基底螢光量的循環(huán)數(shù)。Ct值與起始模板數(shù)成一定比例關(guān)系，Ct值越小，起始模板數(shù)越多；相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用梯度力定量校準(zhǔn)品的Ct值 制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測樣品的Ct值可以準(zhǔn)確測出該樣品的起始拷貝數(shù)。
本發(fā)明的檢測埃博拉病毒的熒光定量PCR試劑盒，通過對各組分，如引物濃度、熒光探針濃度、Mg2+濃度、退火溫度等的優(yōu)化，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，試劑盒完全可以滿足快速特異檢測 Z、S兩種亞型埃博拉病毒的實(shí)際需求。
檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明還提供了一種利用本發(fā)明的試劑盒檢測埃博拉病毒的方法，該方法包括以下步驟
I)提取待檢樣品的RNA ；
2)將上述RNA加入熒光定量反應(yīng)液中，采用本發(fā)明所述的引物對以及探針，用實(shí)時熒光PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測；
3)通過比較待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值而對待檢樣品的其實(shí)拷貝數(shù)進(jìn)行定量。
下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所述的“室溫”是指進(jìn)行試驗(yàn)的操作間的溫度，一般為25°C。
以下實(shí)施例中，埃博拉病毒熒光定量RT-PCR弓丨物和MGB探針由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。連接T7啟動子結(jié)合序列的引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。T7 RiboMAX Express RNAi System 試劑盒，dNTPs、dUTP、Taq DNA 聚合酶及其緩沖液、DL2000 Marker 購自大連寶生物工程有限公司。IO X Ex Taq Buffer，AMV 酶、dATP、dAUP、dAGP、dACP， TaKaRa ExTaq (5U/μ I)購自大連寶生物工程有限公司。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。突光定量 PCR 儀是 Mactercycler ep realplex 4 (Effendorf Inc.) ND-1000 微量紫外可見分光光度計購自NanoDrop Technologies, Inc.。
實(shí)施例1引物和探針設(shè)計
一、實(shí)驗(yàn)步驟
埃博拉病毒熒光定量RT-PCR引物指的是長度25±5nt的寡核苷酸鏈，其與EBOV Z、S亞型病毒共有的NP基因的序列完全相同或者互補(bǔ)。埃博拉病毒熒光定量RT-PCR探針指的是長度長度18±5nt的寡核苷酸鏈，其5’端標(biāo)記著熒光激發(fā)基團(tuán)，3’端標(biāo)記著 MGB (minor groove binder);其與EB0VZ、S亞型病毒共有的NP基因的序列完全相同或互補(bǔ)。
根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫中公布的EBOV和MARV、XFHV、DHFV NP基因序列(參考毒株信息見表I)，利用引物和探針設(shè)計軟件Primer Express 2. O (美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)設(shè)計了對于Z、S亞型EBOV特異性的熒光定量PCR引物和探針。引物及探針序列見表2，表2 中引物基因位置指在 Zaire Ebolavirus strain Mayinga(NCBI 登錄號 AF499101.1)基因上位置。設(shè)計的引物和探針與EB0V、MARV、XFHV、DHFV相應(yīng)基因序列比對結(jié)果見圖1。
表1.設(shè) 計引物和探針參考的毒株信息
權(quán)利要求
1.一種檢測Z/S亞型埃博拉病毒的實(shí)時熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于，該試劑盒一引物對和一探針；所述的引物對中，引物長度25±5nt，其中一條引物含有一個簡并堿基，該簡并堿基分別和Z、S兩種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列的差異位點(diǎn)相同，該引物中該簡并堿基以外的序列與Z、S兩種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列相同；另一條引物也含有一個簡并堿基，該簡并堿基分別和Z、S兩種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列的差異位點(diǎn)互補(bǔ)，該引物中該簡并堿基以外的序列與Z、S兩種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列互補(bǔ)；該引物對的擴(kuò)增片段為70-300bp ;所述的探針長度為18±5nt，該探針含有一個簡并堿基，該簡并堿基分別和本發(fā)明的引物對在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列的差異位點(diǎn)相同，該探針中該簡并堿基以外的序列與本發(fā)明的引物對在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列相同；或者，該簡并堿基分別和本發(fā)明的引物對在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列的差異位點(diǎn)互補(bǔ)，該探針中該簡并堿基以外的序列與本發(fā)明的引物對在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列互補(bǔ)。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的引物對中，一條是SEQID N0:16所示序列的核苷酸，另一條是SEQ ID NO :17所示序列的核苷酸。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的探針為MGB探針。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的探針的序列為SEQIDN018o
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括陽性對照品、陰性對照品、RNA提取試劑和熒光定量反應(yīng)液。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的熒光定量反應(yīng)液包括PCR緩沖液、dUTPs溶液、AMV酶、Taq DNA聚合酶、無菌雙蒸水和MgCl2溶液。
7.—種檢測Z/S亞型埃博拉病毒的探針，其特征在于，所述的探針長度為18±5nt，該探針含有一個簡并堿基，該簡并堿基分別和本發(fā)明的引物對在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列的差異位點(diǎn)相同，該探針中該簡并堿基以外的序列與本發(fā)明的引物對在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列相同；或者，該簡并堿基分別和本發(fā)明的引物對在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列的差異位點(diǎn)互補(bǔ)，該探針中該簡并堿基以外的序列與本發(fā)明的引物對在Z、S兩種亞型EBOV的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列互補(bǔ)。
8.如權(quán)利要求7所述的探針，其特征在于，所述的探針的序列為SEQIDN018o
9.一種一步法檢測Z/S亞型埃博拉病毒的實(shí)時熒光定量RT-PCR方法，其特征在于，包括以下步驟 1)提取待檢樣品的RNA； 2)將上述RNA加入熒光定量反應(yīng)液中，采用如權(quán)利要求1-6任一項所述的試劑盒中的引物對以及探針，用實(shí)時熒光PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測； 3)通過比較待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值而對待檢樣品的其實(shí)拷貝數(shù)進(jìn)行定量。
10.如權(quán)利要求1-6任一項所述的試劑盒在常規(guī)非生物安全P4級實(shí)驗(yàn)室中檢測Z/S兩種亞型埃博拉病毒的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種一步法檢測Z/S亞型埃博拉病毒(EBOV)的實(shí)時熒光定量RT-PCR方法及其試劑盒和引物與探針。本發(fā)明是一種通用檢測方法，在一次PCR檢測中就可以檢測Z、S兩種亞型EBOV。只要待檢樣品中有Z、S兩種亞型EBOV中的任何一種存在或者兩種同時都存在，就能檢測出來陽性。本發(fā)明采用的一步法MGB探針熒光定量RT-PCR技術(shù)，利用了PCR技術(shù)的核酸高效擴(kuò)增、MGB探針和計算機(jī)輔助熒光檢測技術(shù)敏感性的優(yōu)點(diǎn)，克服了常規(guī)PCR檢測的不足，極大的提高了檢測的敏感性、特異性和操作的便利性。
文檔編號C12N15/11GK103045754SQ20111031285
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月14日
發(fā)明者馬志永, 史子學(xué), 魏建超, 邵東華, 王少輝, 李蓓蓓, 劉陽 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所