專利名稱：核酸擴增反應(yīng)設(shè)備、方法及用于核酸擴增反應(yīng)設(shè)備的基板的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核 酸擴增反應(yīng)設(shè)備、用于核酸擴增反應(yīng)設(shè)備的基板以及核酸擴增反應(yīng)方法，具體地，涉及ー種包括用于將用作核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場的反射區(qū)域內(nèi)的側(cè)光反射的反射部件的核酸擴增反應(yīng)設(shè)備。
背景技術(shù)：
擴增特定核酸的技術(shù)，例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，被應(yīng)用在生物技術(shù)的各個領(lǐng)域。通常，諸如PCR的核酸擴增反應(yīng)需要檢查目標(biāo)核酸是否是被特異性擴增的步驟。例如，存在通過利用例如聚合酶的凝膠對用于諸如PCR的核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)液體進(jìn)行凝膠電泳，然后對PCR擴增獲得的DNA片段染色來進(jìn)行檢查的方法。此外，例如下列相關(guān)技術(shù)方法也用作用于檢查核酸擴增反應(yīng)中的核酸擴增的方法通過測量用于核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)液體的渾濁度來檢查擴增的方法；使用包括與用作擴增對象的核酸特異性偶聯(lián)的探針的微陣列的方法；以及通過使用與雙鏈DNA偶聯(lián)的熒光標(biāo)記探針或與目標(biāo)PCR產(chǎn)物特異性偶聯(lián)的熒光標(biāo)記探針實時檢查擴增的實時PRC。諸如PCR的核酸擴增反應(yīng)還用于分析例如單核苷酸多態(tài)性(SNP)，并采用上述用于檢查核酸擴增的方法。已經(jīng)提出了ー種分析方法，即，通過使用于野生型的引物和ー種或兩種用于變異型的引物同時或分開地與DNA聚合酶一起作用于包括用作分析對象的SNP部位染色體或其片段上，以基于引物檢查是否存在伸長，并且，電泳用作檢查擴增的核酸的方法。此外，已經(jīng)提出了ー種SNP分析方法，即，通過利用用于包括SNP部位的基準(zhǔn)序列和用于變異型序列的兩種特異性引物和通用引物來擴增目標(biāo)序列部分，并通過對獲得的反應(yīng)液體進(jìn)行電泳來檢查是否存在擴增產(chǎn)物。然而，電泳花費太長的時間并且有污染影響。另ー方面，已經(jīng)提出了一種通過使用分析對象基因組DNA和多對引物擴增包括SNP部位的核酸來進(jìn)行分型的方法。利用用于獲得的擴增產(chǎn)物的標(biāo)記探針等，通過例如雜交進(jìn)行該分型。如果能快速簡便地進(jìn)行SNP分析，則例如能夠?qū)崿F(xiàn)在患者病床邊等做出最佳的治療方法、用藥方法等的個性化醫(yī)療，并建立起符合要求的定點護理(POC)技術(shù)。為了這個目的，期望ー種在核酸擴增反應(yīng)后更加迅速簡便地檢查核酸擴增的方法。對于利用標(biāo)記有熒光物質(zhì)的雜交探針檢測核酸的方法，例如核酸量化法(實時PCR)以及用于檢測諸如單核苷酸多態(tài)性(SNP)的變異體的方法(熔解曲線分析)是已知的。其熒光強度在雜交狀態(tài)(也包括雜交后被切斷的狀態(tài))和游離狀態(tài)之間變化的探針用作這些方法中所使用的熒光標(biāo)記雜交探針，并通過測量該變化來進(jìn)行檢測。這種探針的代表是使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的探針和TagMan 探針，而分子信標(biāo)已知為這種探針的示例。在使用FERT的探針中，需要使用兩種熒光染料報告基團染料和淬滅染料。這樣，探針的設(shè)計就非常復(fù)雜。因此，已知的是利用標(biāo)記有熒光染料的核酸探針與目標(biāo)核酸雜交時熒光染料的發(fā)出光減弱的現(xiàn)象并為了更容易地量化核酸而使用一種熒光染料的核酸探針(參照日本專利公開第2005-261354號和日本專利公開第2002-119291號)。此外，對于標(biāo)記有Alexa flour 350、488、568 ;PacificBlue 以及Cy3的探針來說，還已知的是，在雜交標(biāo)記探針時，一些情況下突光染料的發(fā)出光增強(參照Marras SAE、Kramer FR和TyagiS.(2002), Nucleic Acids Research,30, el22)。下面的方法被認(rèn)為是不使用電泳凝膠、諸如膜的支撐體以及標(biāo)記物質(zhì)的檢測方法。
例如，已知的有，使偏振光穿過核酸擴增反應(yīng)液體并測量旋光性和圓偏振光的二色性的方法(參照日本專利公開第2002-186481號)以及感測伸長的擴增產(chǎn)物的偏振光成分的變化的方法(參照日本專利公開第2002-171997號、日本專利公開第2002-171998號以及日本專利公開第2002-171999號)。例如，已知的有，觀察由于隨著擴增反應(yīng)的進(jìn)行所產(chǎn)生的焦磷酸和鎂導(dǎo)致的不溶物質(zhì)的沉淀的方法(參照國際專利公開WO 01/83817說明書(brochure))。此外，已知的有，用含有氧化酶的酶反應(yīng)試劑處理作為擴增產(chǎn)物的焦磷酸且氧化酶作用時發(fā)生的電子轉(zhuǎn)移在電化學(xué)活性插入劑存在的情況下被擴增，從而被電化學(xué)檢測為電流的方法(參照日本專利公開第2003-299號和日本專利公開第2003-47500號)。另外，已知的有，基于核酸擴增反應(yīng)中脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和焦磷酸間偶聯(lián)能力的不同，通過金屬指示劑感測反應(yīng)液體中金屬離子量的變化來檢測是否存在核酸擴增的方法(日本專利公開第2004-283161號)。

發(fā)明內(nèi)容
盡管上述檢測方法被經(jīng)常使用，但是在檢測核酸擴增方面還具有許多缺點。例如，在利用熒光染料的核酸探針的情況下，盡管在核酸檢測時將探針插入雙鏈核酸內(nèi)時的熒光致敏性較大，但是，多個探針的激發(fā)波長和熒光波長區(qū)別不大，即，斯托克司頻移較小。因此，在干擾和增益方面還存在許多缺點。此外，盡管基于焦磷酸鎂沉淀的檢測非常簡單并且實用，但是其信號識別性能和訴求力(appeal power)稍差。因此，在核酸擴增的檢測(反應(yīng))時，要求以易用的構(gòu)造來提高檢測靈敏度。期望一種用于提供易用并能實現(xiàn)高檢測靈敏度的核酸擴增反應(yīng)設(shè)備、用于核酸擴增反應(yīng)設(shè)備的基板以及核酸擴增反應(yīng)方法的技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明的實施方式，提供一種核酸擴增反應(yīng)設(shè)備，包括反應(yīng)區(qū)域，被構(gòu)造為用作核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場；照射單元，被構(gòu)造為用于將光照射到反應(yīng)區(qū)域；以及光檢測單元，被構(gòu)造為用于檢測反射光量。在該核酸擴增反應(yīng)設(shè)備中，設(shè)置有用于將由于由照射單元照射的光而在反應(yīng)區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生的側(cè)光反射并將光導(dǎo)向光檢測單元的反射部件。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，提供一種基板，包括反射部件，被構(gòu)造為用于將來自用作核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場的反應(yīng)區(qū)域的側(cè)光反射。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，提供一種核酸擴增反應(yīng)方法，包括通過設(shè)置在反應(yīng)區(qū)域周圍的反射部件將由于光照射產(chǎn)生的且來自用作核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場的反應(yīng)區(qū)域的側(cè)光導(dǎo)向光出射面方向和/或光入射面方向上；以及通過光檢測器檢測導(dǎo)向的光量。本發(fā)明的實施方式提供易于使用且能實現(xiàn)更高檢測靈敏度的核酸擴增反應(yīng)設(shè)備、基板以及核酸擴增反應(yīng)方法。


圖I是根據(jù)本發(fā)明實施方式的核酸擴增反應(yīng)設(shè)備(第一實施方式)的概念圖；圖2A和圖2B示出了沿著根據(jù)本發(fā)明實施方式的基板內(nèi)的光入射面方向-光出射面方向的反應(yīng)區(qū)域的周邊區(qū)域的截面圖以及其中的光路的示例；圖3是根據(jù)本發(fā)明實施方式的基板內(nèi)反應(yīng)區(qū)域的周邊區(qū)域的透視圖；圖4A至圖4C示出了根據(jù)本發(fā)明實施方式的反應(yīng)區(qū)域周圍的基板的示例；圖5A至圖5G簡化地示出了根據(jù)本發(fā)明實施方式的基板制造過程；圖6A至6F示出了用于制造根據(jù)本發(fā)明實施方式的基板的制造所使用的樹脂模具的方法的示例；以及圖7是根據(jù)本發(fā)明實施方式的核酸擴增反應(yīng)設(shè)備(第二實施方式)的概念圖。
具體實施例方式將參照附圖描述用于執(zhí)行本發(fā)明的優(yōu)選方式。以下要描述的本發(fā)明的實施方式為本發(fā)明的代表性實施方式的一個示例，并不由于這些實施方式而狹窄地解釋本發(fā)明的范圍。I.核酸擴增反應(yīng)設(shè)備(第一實施方式)(I)反應(yīng)區(qū)域(1-a)反射部件(1-b)側(cè)壁部(I-C)熒光體部件(2)基板(2-a)基板的制造方法(3)核酸擴增反應(yīng)(3-a)核酸擴增(產(chǎn)物)的檢測方法(4)照射單元(5)溫度控制單元(6)光檢測單元2.核酸擴增反應(yīng)設(shè)備(第一實施方式)的操作(I)檢測從核酸擴增反應(yīng)中的渾濁物質(zhì)得到的光成分(1-a)基板中沒有熒光體部件的情況 (1-b)基板中有熒光體部件的情況(2)檢測從核酸擴增反應(yīng)中的熒光物質(zhì)得到的光成分(2-a)基板中沒有熒光體部件的情況(2-b)基板中有熒光體部件的情況3.核酸擴增反應(yīng)設(shè)備(第二實施方式)
4.核酸擴增反應(yīng)設(shè)備(第二實施方式)的操作5.變形例(I)RT-LAMP 設(shè)備的操作(2) RT-PCR設(shè)備的操作〈I.核酸擴增反應(yīng)設(shè)備>圖I是根據(jù)本發(fā)明實施方式的核酸擴增反應(yīng)設(shè)備I (第一實施方式)的概念圖。圖2A和圖2B示出了沿著根據(jù)本發(fā)明實施方式的基板內(nèi)的光入射面方向-光出射面方向的反應(yīng)區(qū)域的周邊區(qū)域的截面圖以及其中的光路的示例。圖3是根據(jù)本發(fā)明實施方式的基板內(nèi)反應(yīng)區(qū)域的周邊區(qū)域的透視圖。圖4A至圖4C示出了根據(jù)本發(fā)明實施方式的反應(yīng)區(qū)域周圍的基板的不例。 在下述附圖中，為了便于描述，以簡化等方式示出了設(shè)備的構(gòu)造等。圖I中所示的根據(jù)本發(fā)明實施方式的核酸擴增反應(yīng)設(shè)備(第一實施方式)包括反應(yīng)區(qū)域2、照射單元3以及用于控制核酸擴增反應(yīng)以擴增并量化核酸的光檢測單元5，并適宜地設(shè)置有溫度控制單元。在本發(fā)明實施方式的核酸擴增反應(yīng)設(shè)備I中，溫度控制單元4和可拆卸的反應(yīng)區(qū)域2(基板6)設(shè)置在照射單元3和光檢測單元5之間。此外，為了調(diào)節(jié)光量、光成分等，可在反應(yīng)區(qū)域2和照射單元3之間適宜地設(shè)置針孔7、激發(fā)濾光片8以及聚光透鏡9。另外，為了調(diào)節(jié)光量、光成分等，可在反應(yīng)區(qū)域2和光檢測單元5之間適宜地設(shè)置熒光濾光片10和聚光透鏡11。優(yōu)選地，本發(fā)明實施方式的核酸擴增反應(yīng)設(shè)備I設(shè)置有控制器(未示出)，用于對與本發(fā)明實施方式的設(shè)備有關(guān)的各種操作(例如，光控制、溫度控制、核酸擴增反應(yīng)、光檢測控制、所檢測出的光的量的計算以及檢測)進(jìn)行控制。下面將對各個構(gòu)成進(jìn)行詳細(xì)說明。(I)反應(yīng)區(qū)域反應(yīng)區(qū)域2是用作核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場的區(qū)域，并設(shè)置在能被來自照射單元3的光照射的這樣的位置處(參見圖I、圖2A、圖2B和圖7)。在該反應(yīng)區(qū)域2內(nèi)隨著擴增反應(yīng)的進(jìn)行生成核酸擴增產(chǎn)物，并且在該核酸擴增產(chǎn)物被來自照射單元3的光照射時，發(fā)生光朝向反應(yīng)區(qū)域2的側(cè)方。反射部件20被設(shè)置成使該側(cè)光導(dǎo)向光檢測單元5(參見圖I、圖2A、圖2B和圖7)。反應(yīng)區(qū)域2的形狀不被特定地限制，只要用作核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場的區(qū)域設(shè)置在內(nèi)部即可。形狀的示例包括圓柱形、圓錐臺形、多角錐臺形(例如，四角錐臺形)和立方體形狀。(1-a)反射部件反射部件20不被特定地限制，只要反射部件20被設(shè)置成將來自反應(yīng)區(qū)域2的側(cè)光反射并最終將光導(dǎo)向光檢測單元5(參見圖I和圖7)即可。優(yōu)選地，如圖2A和圖2B所示，例如，反射部件20 (反射面201)設(shè)置在反射區(qū)域2周圍，從而將來自反應(yīng)區(qū)域的側(cè)光導(dǎo)向光出射面方向和/或光入射面方向。在這種情況下，側(cè)光的反射方向可使用多個反射部件20 (反射面201)(未示出)來調(diào)整。例如，可通過一個反射面使側(cè)光基本水平的反射，然后可通過另一反射面使側(cè)光反射到光出射面方向和/或光入射面方向。
沿著光入射面方向-光出射面方向切割反射部件20時得到的反射部件20的反射面201可以為任意面，只要其是能夠反射側(cè)光的傾斜面即可。傾斜面的示例包括平面、曲面以及部分為曲面的平面(例如，參見圖2A、圖2B、圖4A至圖4C)。對于由該反射面201和與該反射面相交的反應(yīng)區(qū)域2的面形成的鈍角(0)，角0的范圍優(yōu)選為90度< 0 ^ 150度(參見圖2A和圖2B)。此外，反射部件20的三維形狀可以是任意的形狀，只要反射部件20能夠有效地將側(cè)光導(dǎo)向光出射面方向和/或光入射面方向(參見圖3和圖4A到圖4C)即可。三維形狀的示例包括漏斗形、圓錐臺形以及角錐臺形。三維形狀的整個面(全部)可用于反射側(cè)光，或可使用反射部件20的整個面的一部分(一個塊)?？商鎿Q地，三維形狀可分成多個塊，并可使用每個塊。作為一示例，側(cè)光的出射方向可基于各個分割塊而變化。例如，塊可以以一個塊可將光出射到光出射面方向上而其他塊可將光出射到光入射面方向的方式設(shè)置。這樣的塊可適宜地在反應(yīng)區(qū)域周圍設(shè)置單個或多個。
反射部件20 (反射面201)的用于反射光的材料可以是任意的材料，只要該材料對側(cè)光具有高的反射率即可。材料的示例包括選自于銀、金、鋁、銠等中的金屬膜材料的一種或多種。其中，銀和主要由銀組成的材料是優(yōu)選的。通過利用這種材料進(jìn)行離子濺射，可形成用以反射側(cè)光的單層或多層金屬膜作為反射部件20 (反射面201)。金屬膜的厚度在約30nm 約200nm足以，但并不特定地局限于此，每一層金屬膜的厚度在約30nm 約70nm足以。在利用透射光的相關(guān)技術(shù)檢測系統(tǒng)中，特別是渾濁度檢測系統(tǒng)中，S/N比較低，很難進(jìn)行充分的確定。與之相比，設(shè)置上述反射部件使得能夠簡便地從反應(yīng)區(qū)域提取側(cè)光，從而增大了投影表面積。特別是在渾濁度檢測系統(tǒng)中，在測量初始階段幾乎沒有側(cè)散射，在該階段核酸擴增產(chǎn)物(散射物)的量較小，因此，如果將該側(cè)散射光用作基準(zhǔn)，則可確保測量初始階段足夠高的S/N比。這樣，在測量初始階段也是易于進(jìn)行確定的，因此，即構(gòu)造簡單，又還能提聞檢測靈敏度。對于通過采用上述反射部件(反射面)(反射技術(shù))達(dá)到的優(yōu)點，光檢測單元5(光接收器)可適宜地設(shè)置在光入射面或光出射面?zhèn)?。因此，在設(shè)置光學(xué)系統(tǒng)的靈活性及光學(xué)系統(tǒng)的裝配形式的靈活性方面，采用上述反射部件對于空間設(shè)計是有利的。(1-b)側(cè)壁部側(cè)壁部21設(shè)置在反應(yīng)區(qū)域2和反射部件20之間，且該側(cè)壁部21在側(cè)壁22處與反應(yīng)區(qū)域2接觸(參見圖2A到圖4C)。側(cè)壁部21 (側(cè)壁22)可分成多個塊(參見圖3)。根據(jù)目的，側(cè)壁部21或其每個塊由透射或遮擋來自反應(yīng)區(qū)域2的側(cè)光或使必要光成分透射的材料形成。為了使側(cè)光透過，側(cè)壁部21 (例如，側(cè)壁22和反射部件20之間的部分)或其一部分可以為空間，或者該空間可填充有塑料材料(例如，沒有特定波長選擇性的材料)。沒有波長選擇性的材料可以是任意的材料，只要至少散射光和熒光透過該材料即可。材料的示例包括下面要描述的具有光透過性的示例性材料。優(yōu)選地，當(dāng)側(cè)光透過側(cè)壁部21 (側(cè)壁22)時，反射光并使不必要的光成分減少以及使側(cè)光變成具有期望特定波長(熒光等)的光成分的這種含有熒光物質(zhì)等的塑料材料等用于側(cè)壁部21或其一部分(塊)。此外，對于側(cè)壁部 21的一部分(塊)，可使用采用遮擋(吸收)光的物質(zhì)的材料或含有這種物質(zhì)的塑料材料等，使得對光檢測有影響的不必要的側(cè)光可被遮擋。(1-c)熒光體部件優(yōu)選地，在反應(yīng)區(qū)域2和反射部件20之間設(shè)置一個或多個熒光體部件23。在這種情況下，為了將側(cè)光變成具有期望特定波長的光成分，可使用含有上述熒光體材料的側(cè)壁部21 (側(cè)壁22)作為熒光體部件23。使用具有熒光體部件23的可拆卸反應(yīng)區(qū)域2 (基板6)使得能夠根據(jù)檢測核酸擴增產(chǎn)物的方法簡便地提取具有期望特定波長的光成分(例如，熒光)。另外，也允許減少反射光和不必要的光成分(例如，散射光的雜散光)。上述方式中的構(gòu)造不但易于以低成本獲得，而且還提高了檢測靈敏度。例如，由于核酸擴增中產(chǎn)生的焦磷酸及金屬鹽的沉淀物質(zhì)的側(cè)散射光，使得熒光體部件中的熒光體被激發(fā)，并且熒光體部件發(fā)出熒光。因而，在不使用核酸擴增反應(yīng)液的熒光物質(zhì)(熒光探針)的情況下也能測量熒光成分。此外，在監(jiān)測時，易于將基準(zhǔn)設(shè)定為初始值0%。這樣，還具有的優(yōu)勢在于用戶能夠簡便地執(zhí)行初始階段的監(jiān)測。另外，如果通過側(cè)散射光獲得熒光，則還可以對光檢測單元(光接收器)應(yīng)用濾光片(例如，用于消除干擾的熒光(波長選擇性透射)濾光片)。因此，還使得能夠使相對入射光的S/N比提高。熒光體部件可在側(cè)壁部21中形成為多個層(例如，參見圖4C中的熒光體部件231和 232)。通過設(shè)置多個熒光體層，還允許預(yù)先去除不必要的光成分。此外，可減少用于消除設(shè)備中的干擾的濾光片的數(shù)目。因此，提高了檢測靈敏度，而且還實現(xiàn)了設(shè)備自身的小型化。此外，例如，通過如圖4C所示以一定間隔形成多個不同的層達(dá)到下面的效果。具體地，在來自反應(yīng)區(qū)域的側(cè)散射光透過熒光體部件231并變成熒光成分后，熒光成分的一部分通過反射部件而導(dǎo)向光檢測單元5。剩余的熒光成分進(jìn)一步穿過熒光體部件232并變成不同的熒光成分。之后，該熒光成分通過反射部件而導(dǎo)向光探測單元5。即，還可以將各個不同的熒光成分導(dǎo)向光探測單元5。這樣，從一個樣品同時獲得不同的另一條信息也是允許的，從而還實現(xiàn)了工作效率的提高。另外，可減少設(shè)備中熒光(波長選擇性透射)濾光片的數(shù)目，從而還允許設(shè)備自身的小型化。對于用于熒光體部件的熒光體材料，根據(jù)期望的熒光成分(約300nm到750nm)，可米用公知的突光體材料。對于突光體材料，可米用有機突光體或無機突光體。然而，無機突光體是優(yōu)選的，這是因為能夠簡便地降低成本和簡便地實現(xiàn)期望的波長選擇。下面將舉例說明各種無機熒光體和有機熒光體。然而，熒光體材料并不局限于此。下列材料可用作無機熒光體材料?？蛇m宜地單獨使用其中任一種，也可組合使用其中兩種以上。引用了由硅鋁氧氮聚合材料(Si-Al-O-N)作為母體組成的熒光體，特別是主要由被Eu激活的a -硅鋁氧氮聚合材料組成并通過向該a -硅鋁氧氮聚合材料添加Ca、Y或Mg元素所獲得的熒光材料(例如，參照日本專利公開第2009-108223號)。另外，還引用了由不同結(jié)構(gòu)的￠-硅鋁氧氮聚合材料作為母體組成的熒光材料、與CaSiAlN^e0體具有相同晶體結(jié)構(gòu)的無機化合物以及與A2Si5N8具有相同晶體結(jié)構(gòu)的熒光材料。這些熒光材料的優(yōu)點在于通過利用用作光源的藍(lán)色發(fā)光二級管(LED)發(fā)出紅光和綠光簡便獲得白光。引用了由石榴石類的Y3Al5O1Jt為母體組成的氧化物熒光體材料。例如，引用了由作為通式的(ReI-rSmr) 3 (All-sGas) 5012:Ce (0 ^ r < 1,0 ^ s ^ I, Re 為選自 Y和 Gd 中的至少一種兀素)表不的突光材料(例如，參照日本專利公開第2009-135545號)。另外，引用了基于堿土金屬鋁酸鹽的綠色系熒光體(通式(Cal-a，Ma)0 a Al2O3 ^ Ce2O3 -Tb2O3 (M為選自Mg、Sr、Ba和Zn中的至少一種元素，0彡a彡0. 9，0. 5彡a彡5.0，0.015彡^ ^ 0. 40,0.015 彡 g 彡 0.42)等)。引用了基于稀土絡(luò)合物和向列型液晶陣列的熒光層的開發(fā)，鹵化磷酸鹽熒光體(通式(Ml-u-vEuuMnv) *mX2 n (PO4)6 (0 < u/v < 100,1 > u+v, 0 < m < 10，0 < n < 10,I > 10n), M = Mg, Ca, Sr, Ba, X = F, Cl, Br, I),以及堿土娃酸鹽突光體((Sra, Bab, Caz,Euw)2Si04)(例如，參照日本專利公開第2005-307035號)。引用了摻雜有Eu離子的Ca-Al-Si-O-N類材料以及氮氧化物玻璃(例如，參照日本專利公開第2008-227550號)。另外，引用了氮氧化物類的熒光材料、通過向石榴石結(jié)構(gòu)類的熒光體添加V族元素獲得的熒光體、以及通過向例如Ga、Al或In的氧化物添加作為激活劑的Eu并使氧化物的一部分硫化所獲得的添加紅色的黃色熒光體和黃綠色熒光體。引用了用于白色LED的硅鋁氧氮聚合材料熒光體，例如，黃色a -硅鋁氧氮聚合材料和綠色￠-硅鋁氧氮聚合材料(例如，參照日本專利公開第2010-116564號)。與硅酸鹽類的綠色熒光體相比，￠-硅鋁氧氮聚合材料的特性在于，相對于溫度升高，亮度和顏色變化較小。引用了由通過不同的金屬氧化物(例如，Al2OjP Y3Al5O12)連續(xù)的三維相互絡(luò)合所形成的固化體組成的光轉(zhuǎn)換材料(例如，參照日本專利公開第2006-173433號)。引用了通過在非晶態(tài)YAG中沉淀YAG晶體所獲得的復(fù)合材料(例如，參照日本專利公開第2008-231218號)。引用了 CdS等的半導(dǎo)體納米晶體以及納米晶體和金屬氧化物的復(fù)合體(例如，參照日本專利公開第2010-114079號)。引用了通過在聚合物基質(zhì)中分散ZnS等的半導(dǎo)體納米晶體所獲得的材料(例如，參照J(rèn)P-T-2010-528118)。引用了通過將不吸收藍(lán)色LED光的電介質(zhì)粒子(具有寬帶隙的粒子、A1N、氣泡等)和熒光(磷光)材料所獲得的電介質(zhì)熒光粉(例如，參照日本專利公開第2002-261328號)有機熒光體材料的示例包括下列分子結(jié)構(gòu)低分子系、金屬絡(luò)合物、高分子系、 共軛高分子材料、O-共軛聚合物材料、含低分子色素的聚合物系材料以及摻雜劑。可
適宜地單獨使用其中任一種，或可組合使用其中兩種以上。分子結(jié)構(gòu)低分子系的示例包括二苯乙烯基聯(lián)苯類的藍(lán)色發(fā)光材料、二米基(mesityl)硼基偶聯(lián)的非晶態(tài)發(fā)光材料、芪類共軛樹狀聚物發(fā)光材料、聯(lián)吡啶苯二甲腈發(fā)光材料、甲基取代苯并惡唑類的熒光和磷光發(fā)光材料、聯(lián)苯乙烯類的紅色發(fā)光材料、耐熱型咔唑類的綠色發(fā)光材料、苯并屈類藍(lán)綠色發(fā)光材料、芳基胺類發(fā)光材料、芘取代寡聚噻吩類的發(fā)光材料、二乙烯基苯基偶聯(lián)三亞苯類的發(fā)光材料、二萘嵌苯類的紅色發(fā)光材料、PPV寡聚物類的發(fā)光材料、(咔唑-氰基對苯二甲亞基類)的發(fā)光材料、芳基乙炔基苯類的藍(lán)色熒光發(fā)光材料、五聯(lián)吡啶類的發(fā)光材料、芴類的星形發(fā)光材料、噻吩類的非晶態(tài)綠藍(lán)色發(fā)光材料、低摩爾質(zhì)量的液晶發(fā)光材料、(乙腈-三亞苯胺)類的紅色發(fā)光染料、二噻唑類的發(fā)光、材料、(咔唑-萘二甲酰亞氨基)類的發(fā)光染料、聯(lián)六苯類的藍(lán)色發(fā)光材料以及二米基硼的蒽類發(fā)光材料。金屬絡(luò)合物的示例包括惡二唑-鈹藍(lán)色發(fā)光絡(luò)合物、銪類的磷光發(fā)光絡(luò)合物、耐熱性鋰類藍(lán)色發(fā)光絡(luò)合物、磷光發(fā)光性磷化氫-金絡(luò)合物、鋱類發(fā)光絡(luò)合物、噻吩-鋁黃色發(fā)光絡(luò)合物、鋅類黃綠色發(fā)光絡(luò)合物、非晶鋁類綠色發(fā)光絡(luò)合物、硼類發(fā)光絡(luò)合物、鋱取代銪類發(fā)光絡(luò)合物、鎂類發(fā)光絡(luò)合物、磷光發(fā)光性鑭系元素類近紅外發(fā)光絡(luò)合物、釕類發(fā)光絡(luò)合物以及銅類磷光發(fā)光性絡(luò)合物。高分子系的示例包括寡聚苯撐亞乙烯基四聚物發(fā)光材料。-共軛高分子材料的示例包括液晶性芴類藍(lán)色偏振發(fā)光聚合物、含聯(lián)二萘的發(fā)光聚合物、亞乙硅烷基寡聚亞噻吩基類發(fā)光聚合物、芴-咔唑類藍(lán)色發(fā)光共聚物、二氰苯撐亞乙烯基-PPV類發(fā)光共聚物、硅藍(lán)色發(fā)光共聚物、共軛含發(fā)色團的發(fā)光聚 合物、惡二唑類發(fā)光聚合物、PPV類發(fā)光聚合物、亞噻吩基-苯撐類發(fā)光共聚物、液晶手性取代芴類發(fā)光聚合物、螺芴類藍(lán)色發(fā)光聚合物、熱穩(wěn)定性二乙基苯類發(fā)光聚合物、聯(lián)萘-芴類藍(lán)色發(fā)光共聚物，葉啉基接枝PPV類發(fā)光聚合物、液晶性二辛基芴類發(fā)光聚合物、添加環(huán)氧乙烷基的噻吩類發(fā)光聚合物、寡聚噻吩類發(fā)光聚合物、PPV類藍(lán)色發(fā)光聚合物，熱穩(wěn)定性乙炔類發(fā)光聚合物、(惡二唑-咔唑-萘二甲酰亞胺)類發(fā)光共聚物、(乙烯基-吡啶)類凝膠發(fā)光聚合物、PPV類發(fā)光液晶聚合物、噻吩類發(fā)光聚合物、(噻吩-芴)類發(fā)光共聚物、烷基噻吩類發(fā)光共聚物、添加環(huán)氧乙烷寡聚物的PPV類發(fā)光聚合物、(咔唑基丙烯酸脂-香豆素)類的發(fā)光共聚物、n-型全芳香族的惡二唑類發(fā)光聚合物、咔唑基氰基對苯二亞甲酯類發(fā)光聚合物、耐熱抗輻射性萘二甲酰亞胺類發(fā)光聚合物、鋁螯合物類發(fā)光聚合物以及含八氟聯(lián)苯基的發(fā)光聚合物。O -共軛高分子材料的示例包括聚硅烷類發(fā)光聚合物。含低分子色素的聚合物類材料的示例包括咔唑側(cè)鏈偶聯(lián)的PPMA類發(fā)光聚合物以及聚硅烷/色素類發(fā)光組合物。摻雜劑的示例包括摻雜Eu絡(luò)合物的磷光發(fā)光材料、三烯丙基吡唑啉摻雜劑化合物、摻雜六苯并苯的PVK發(fā)光材料、摻雜噻吩類化合物的(PVK/PBD)發(fā)光材料、摻雜Ir絡(luò)合物的PVK類發(fā)光材料、摻雜二吡唑吡啶類化合物的發(fā)光材料、摻雜吡喃類化合物的Alq3發(fā)光材料、摻雜還原性R卜啉的Alq3發(fā)光材料、摻雜香豆素或二氫喹B丫唳的Alq類發(fā)光材料、摻雜鋁鹽的于PVCz類發(fā)光聚合物、摻雜并噻吩類化合物的苯并咪唑類發(fā)光材料、共摻雜(丁二烯類化合物TPA)的PVK類發(fā)光材料、共摻雜染料(TTP = DCM)的Alq3發(fā)光材料、摻雜離子性發(fā)光染料的PVK類發(fā)光材料以及色素?fù)诫s型EL元件。(2)基板優(yōu)選地，在用作核酸擴增反應(yīng)的如微芯片等的反應(yīng)容器(例如，基板6)中形成單個或多個反應(yīng)區(qū)域2。反應(yīng)容器至少包括反應(yīng)區(qū)域2和反射部件20 (反射面201)，并且優(yōu)選地根據(jù)需要，反應(yīng)容器包括側(cè)壁部21 (側(cè)壁22)和熒光體部件23。在這種情況下，優(yōu)選地，以上述順序(即，從反應(yīng)區(qū)域2側(cè)來看，以側(cè)壁部21 (側(cè)壁22)、熒光體部件23以及反射部件20 (反射面201)的順序)，在各個反應(yīng)區(qū)域2周圍設(shè)置各個部件(參見圖2A到圖4C)。(2-a)基板制造方法用于形成含有反應(yīng)區(qū)域2和反射部件20的核酸擴增反應(yīng)微芯片(基板6)的方法不被特定地限制。優(yōu)選地，例如通過玻璃基板層的濕蝕刻或干蝕刻或納米壓印、塑料基板層的注塑成型或切割加工來在基板中形成反應(yīng)區(qū)域2。所形成的反應(yīng)區(qū)域2可預(yù)先填充有用于核酸擴增反應(yīng)的試劑。優(yōu)選地，例如通過在反應(yīng)區(qū)域2周圍形成傾斜面并通過濺射在該表面上沉積金屬膜，來在基板6中形成反射部件20?；?的材料不被特定地限制，因此，優(yōu)選地，根據(jù)檢測方法、加工容易度、耐久性等選擇材料。對于該材料，可根據(jù)期望的檢測方法適宜地選擇具有光透過性的材料。材料的示例包括玻璃以及各種塑料(聚丙烯、聚碳酸酯、環(huán)烯烴聚合物、聚二甲基硅氧烷(PDMS)
下面將基于下列步驟(A)到(G)(工藝流程)對用于制造本發(fā)明實施方式的基板6(微流路芯片)的方法進(jìn)行詳細(xì)描述。這些步驟是用于制造本發(fā)明實施方式的基板6的方法一個示例，并且制造方法并不局限于此。(A)首先，采用用于形成反射部件的透明樹脂30(例如，SU8感光樹脂)用作微流路芯片(基板6)的模具(參見圖5A)。(B)利用透明樹脂30通過光刻法將用于提供鉆孔(well)的圓柱形結(jié)構(gòu)制造成任意的形狀(參見圖5B)。(C)然后，形成具有傾斜面的透明樹脂(參見圖5C)。圖5C所示的透明樹脂(樹脂模具31)用作基板6 (反應(yīng)區(qū)域2)的模具?；跇渲＞?1，在基板61 (例如，玻璃板)上澆鑄并固化透明樹脂62 (例如，PDMS)的混合液，并通過分離法剝離模具(參見圖OT)。(D)確認(rèn)在模具從其剝離的透明樹脂62 (基板61)上形成用作鉆孔的通孔和通孔圓周的傾斜面。然后，通過例如濺射在基板61的整個表面上形成反射部件20 (例如，金屬膜Ag膜和隨后的Au膜)(參見圖5E)。此時，優(yōu)選地，使用對發(fā)光波長的光具有極高反射率的物質(zhì)(例如，Ag或主要由Ag組成的金屬)作為反射部件20(膜)的材料。這允許端面發(fā)出光和通過玻璃/PDMS反射所返回的循環(huán)光被該反射膜有效地反射，最終，簡便地將光提取到外部。(E)通過光刻法在反射部件20上形成具有預(yù)定圓形的光致抗蝕圖樣，使用該光致抗蝕圖樣作為掩模蝕刻反射部件20 (金屬膜)(參見圖5E)。從而，在基板61 (透明樹脂)上方的傾斜面上形成反射部件20 (具有Ag/Au結(jié)構(gòu)的圓形反射膜)。(F)然后，通過上述方法，基于用于制造如圖5B所示的鉆孔的樹脂模具澆鑄并固化透明樹脂的混合液，并根據(jù)上述步驟(D)，通過分離法將模具剝離(參見圖5F)。從而，形成側(cè)壁部21。此時，可通過對側(cè)壁部21的側(cè)壁涂覆混合有熒光體材料的樹脂來形成熒光體部件23(側(cè)壁)(未示出)?？商鎿Q地，可通過將熒光體材料與以孔狀形式澆鑄的上述混合液混合，來形成整個側(cè)壁部21作為熒光體部件。(G)設(shè)置基板63，從而形成用作反應(yīng)區(qū)域2的空間(例如，玻璃或塑料)。通過上述步驟，獲得根據(jù)本發(fā)明實施方式的具有反應(yīng)區(qū)域2的微流路芯片(基板6)。例如，通過根據(jù)上述方法制造基板并在基板完成后將其翻轉(zhuǎn)可獲得具有用于將光反射到光入射面方向上(例如，參見圖2B)的反射部件的基板。用于制造上述樹脂模具31的方法示例包括但并不特定地局限于下列方法(參見圖6A至6F)。在第一種方法(參見圖6A)中，通過利用旋涂法在整個表面上涂覆透明樹脂來將傾斜面自動設(shè)定成角度92。在第二種方法(參見圖6B)中，通過利用例如旋涂法涂覆透明樹脂，然后使該透明樹脂硬化收縮來將傾斜面設(shè)定成角度％。在第三種方法(參見圖6C)中，通過光刻技術(shù)形成透明樹脂。具體地，通過使用抗蝕劑(感光性樹脂)作為透明樹脂，并對該抗蝕劑執(zhí)行涂覆、曝光和顯影處理，來將傾斜面設(shè)定成角度92。
在第四種方法(參見圖6D)中，利用預(yù)定的模具對透明樹脂進(jìn)行沖壓成型來將傾斜面設(shè)定成角度92。在第五種方法(參見圖6E)中，通過對透明樹脂進(jìn)行熱壓印成型將傾斜面設(shè)定成角度％。在第六種方法(參見圖6E)中，通過對透明樹脂進(jìn)行UV壓印成型將傾斜面設(shè)定成角度％。在第七種方法中(參見圖6F)，通過利用例如旋涂法涂覆透明樹脂，然后在將該透明樹脂壓向可彈性變形的脫模層的狀態(tài)下固化該透明樹脂，來將傾斜面設(shè)定成角度e2。(3)核酸擴增反應(yīng)在本發(fā)明的實施方式中，“核酸擴增反應(yīng)”包括實施溫度循環(huán)的現(xiàn)有聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法和不伴隨有溫度循環(huán)的各種等溫擴增法。等溫擴增法的示例包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)法、智能擴增工藝(SMAP)法、基于核酸序列的擴增(NASBA)法、核酸的等溫的和嵌合引物觸發(fā)的擴增(ICAN)⑧法、轉(zhuǎn)錄-逆轉(zhuǎn)錄協(xié)同(TRC)法、鏈置換擴增(SDA)法、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增(TMA)法及滾環(huán)擴增(RCA)法。另外，“核酸擴增反應(yīng)”廣泛地涵蓋基于用于核酸擴增目的的變溫或等溫過程的核酸擴增反應(yīng)。此外，這些核酸擴增反應(yīng)還涵蓋伴隨有擴增的核酸鏈的定量的反應(yīng)，例如，實時 PCR(RT-PCR)法以及 RT-LAMP 法?！霸噭卑ㄓ糜谠谏鲜龊怂釘U增反應(yīng)中獲得擴增的核酸鏈的試劑，具體為，具有與目標(biāo)核酸鏈互補的堿基序列的寡聚核苷酸引物、核酸單體(dNTP)、酶以及反應(yīng)緩沖液(緩沖劑)溶質(zhì)。在上述PCR法中，連續(xù)進(jìn)行擴增循環(huán)熱變性(95°C左右)一引物退火(55°C到60°C左右)一伸長反應(yīng)(72°C左右)。上述LAMP法是通過使用DNA的環(huán)成形在恒溫下獲得用作DNA和RNA的擴增產(chǎn)物的dsDNA的方法。作為一示例，添加下列成分和(iii)并在內(nèi)引物能形成對于模板核酸上的互補序列是穩(wěn)定的堿基對的溫度下通過培育進(jìn)行處理，并且，鏈置換聚合酶能保持酶活性。優(yōu)選地，培育溫度為50°C到70°C，時間為約I分鐘到約10小時。成分⑴兩種內(nèi)引物、或另外兩種外引物、或另外兩種環(huán)狀引物；成分(ii):鏈置換聚合酶；成分(iii):基質(zhì)核苷酸(3-a)核酸擴增(產(chǎn)物)的檢測方法
用于檢測上述核酸擴增的方法的示例包括采用渾濁物質(zhì)的方法以及采用熒光物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的方法。采用渾濁物質(zhì)的方法的示例包括采用由于核酸擴增反應(yīng)的結(jié)果得到的焦磷酸所產(chǎn)生的沉淀物質(zhì)以及能與焦磷酸偶聯(lián)的金屬離子的方法。該金屬離子為單價或二價金屬離子。當(dāng)與焦磷酸偶聯(lián)時，其形成不溶或難溶于水的鹽并變成渾濁物質(zhì)。金屬離子的具體示例包括堿金屬離子、堿土金屬離子以及二價過渡金屬離子。其中，選自諸如鎂(11)、1丐(II)以及鋇(II)的堿土金屬離子中的一種或多種金屬離子；以及諸如鋅(II)、鉛(II)、錳(II)、鎳(II)以及鐵(II)的二價過渡金屬離子是優(yōu)選的。鎂
(II)、猛(II)、鎳(II)以及鐵(II)是特別優(yōu)選的。
優(yōu)選地，添加的金屬離子的濃度在0. OlmM到IOOmM的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，將檢測波長設(shè)定為300nm到800nm。采用熒光物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的方法的示例包括采用特異性插入到雙鏈核酸中并發(fā)出熒光的熒光色素(衍生物)的插入法，以及采用通過將熒光色素偶聯(lián)于寡聚核苷酸所獲得的探針的探針標(biāo)記法，其中寡聚核苷酸是要擴增的核酸序列所特有的。探針標(biāo)記法的示例包括雜交(Hyb)探針法和水解(TagMan)探針法。Hyb探針法為被設(shè)計為兩種探針預(yù)先相互接近的采用兩種探針的方法，即，標(biāo)記有供體染料的探針和標(biāo)記有受體染料的探針。當(dāng)這兩種探針與目標(biāo)核酸雜交時，被供體染料激發(fā)的受體染料發(fā)出熒光。TagMan探針法為采用標(biāo)記為使報告基團染料和淬滅染料相互接近的探針的方法。該探針在核酸伸長時水解。此時，淬滅染料和報告基團染料相互分開，并響應(yīng)于報告基團染料的激發(fā)發(fā)出熒光。采用熒光物質(zhì)的方法中所使用的熒光染料(衍生物)的示例包括SYBR GreenI、SYBR GreenII,SYBR Gold、YO(惡唑黃)、T0(噻唑橙)、PG( Pico Green)以及溴化乙錠。采用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的方法中所使用的有機化合物的示例包括發(fā)光氨、洛粉堿、光澤精以及草酸鹽。(4)照射單元照射單元3可以是任意的單元，只要照射單元3包括光源3a并具有使光源發(fā)出的光LI照射到反應(yīng)區(qū)域2的這樣的構(gòu)造即可。例如，由支撐體3b支撐的光源3a可設(shè)置在反應(yīng)區(qū)域2的上方和/或下方(參見圖I)。此外，例如，可設(shè)置將從光源3a發(fā)出的光LI導(dǎo)向反應(yīng)區(qū)域2的導(dǎo)光部件(未示出)。優(yōu)選地，照射單元3包括導(dǎo)光部件。光入射端部設(shè)置在導(dǎo)光部件中，并且從一個或多個光源3a發(fā)出的光入射在光入射端部上。用于將入射光L導(dǎo)向各個反應(yīng)區(qū)域的部件(例如，棱鏡、反射板以及凹凸部)設(shè)置在導(dǎo)光部件內(nèi)。通過設(shè)置導(dǎo)光部件，可減少光源的數(shù)目，并向基板6上的一個或多個反應(yīng)區(qū)域2照射均勻的光。此外，檢測渾濁度時的檢測靈敏度和檢測精度也較好。另外，由于減少了光源數(shù)目，還可減小整個設(shè)備的大小，尤其是減小厚度，且還實現(xiàn)了功率消耗的降低。盡管光源3a不被特定地限制，但是優(yōu)選的是，發(fā)出有利于目標(biāo)核酸擴增產(chǎn)物檢測的期望光的光源作為光源3a。光源3a的示例包括激光源、白色或單色發(fā)光二級管(LED)、汞燈以及鎢絲燈。其中，LED是優(yōu)選的，這是因為其允許降低功率消耗和減少成本。此外，LED是有利的，這是因為如果采用多種濾光片，其還能實現(xiàn)期望的光成分。激光源并不受激光種類的特定限制。發(fā)出例如氬(Ar)離子激光、氦-氡(He-Ne)激光、染料激光或氪(Kr)激光的光源足夠用作激光源。對于該激光源，可使用一種激光源，或可自由組合使用兩種以上的激光源。(5)溫度控制單元溫度控制單元4用于加熱反應(yīng)區(qū)域2。溫度控制單元4的示例包括但并不特定地局限于珀耳帖元件等的加熱器以及具有光透過性的ITO加熱器。溫度控制單元4的形狀示例包括薄膜形和平板形。優(yōu)選地，溫度控制單元4設(shè)置在熱量易于傳遞到反應(yīng)區(qū)域2的這樣的位置處。例如，優(yōu)選地，溫度控制單元4被設(shè)置為靠近反應(yīng)區(qū)域2。具體地，其可設(shè)置在諸如反應(yīng)區(qū)域2 上方、下方或旁邊位置的任意位置和反應(yīng)區(qū)域2的外圍上的位置。特別地，優(yōu)選地，溫度控制單元4具有薄膜形或平板形，并設(shè)置在反應(yīng)區(qū)域2的上方和/或下方。在這種情況下，溫度控制單元4可構(gòu)造為基板支撐臺。此外，可在溫度控制單元4中加工孔，從而光可從孔中穿過。這就消除了增加距熱源的距離的需要，因而有利于反應(yīng)區(qū)域2內(nèi)的溫度控制。因此，提高了檢測靈敏度和檢測精度。(6)光檢測單元光檢測單元5可以是任意的單元，只要其是能夠?qū)νㄟ^利用反射部件20將反應(yīng)區(qū)域2的側(cè)光反射所獲得的光束L3和L4(L5)的光量進(jìn)行檢測的機構(gòu)即可。光檢測單元5設(shè)置有至少一個光學(xué)檢測器5a，該光學(xué)檢測器5a相應(yīng)地由支撐體5b支撐。例如，將每個光學(xué)檢測器5a設(shè)置為對應(yīng)于所導(dǎo)向的光并且以一維、二維或三維的方式設(shè)置光學(xué)檢測器5a就足以。光學(xué)檢測器5a的示例包括但不特定地局限于諸如光電二極管(PD)陣列、電荷耦合器件(CCD)圖像傳感器和互補金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS)圖像傳感器等區(qū)域成像元件、小型光學(xué)傳感器、線傳感器掃描以及光電倍增管(PMT)?？蓪ζ渲械娜我膺M(jìn)行適宜的組合。通過光學(xué)檢測器5a檢測由核酸擴增反應(yīng)產(chǎn)生的熒光物質(zhì)、渾濁物質(zhì)等。可適宜地在本發(fā)明實施方式的核酸擴增反應(yīng)設(shè)備I中設(shè)置激發(fā)濾光片和熒光濾光片。利用激發(fā)濾光片，可根據(jù)檢測核酸擴增反應(yīng)的方法獲得具有期望特定波長的光成分，并可去除不必要的光成分。利用熒光濾光片，光變成檢測所需的光成分(散射光、透射光以及熒光)。這提高了檢測靈敏度和檢測精度?！?.操作核酸擴增反應(yīng)設(shè)備I的操作>下面將對上述核酸擴增反應(yīng)設(shè)備I的操作以及使用該設(shè)備進(jìn)行的核酸擴增反應(yīng)方法進(jìn)行描述。(I)檢測從核酸擴增反應(yīng)中的渾濁物質(zhì)得到的光成分下面將參照圖I和圖2A進(jìn)行關(guān)于用于檢測由于焦磷酸和金屬鹽所形成的渾濁物質(zhì)導(dǎo)致的散射光的量(熒光量)的核酸擴增反應(yīng)方法的描述。(1-a)基板6中沒有熒光體部件23的情況〈步驟laA>,光LI從光源3a發(fā)出并由于激發(fā)濾光片8而變成光L2(激發(fā)光)。該光L2照射到用作核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場的反應(yīng)區(qū)域2。
〈步驟laB>，此時，生成核酸擴增反應(yīng)中沉淀的物質(zhì)(渾濁物質(zhì))，從而增加了光散射的度。光L2照射到隨著反應(yīng)區(qū)域2內(nèi)核酸擴增反應(yīng)的進(jìn)行所生成的沉淀物質(zhì)。此時，從反應(yīng)區(qū)域2中的沉淀物質(zhì)產(chǎn)生散射光L3和側(cè)散射光L4。<步驟laC>，側(cè)散射光L4被設(shè)置在反應(yīng)區(qū)域2側(cè)方的反射部件20 (反射面201)反射并被出射到光出射面方向上?！床襟ElaD>，對于出射光L4，通過光檢測單元5(光學(xué)檢測器5a)檢測光量。S卩，對由于隨著擴增反應(yīng)的進(jìn)行所產(chǎn)生的沉淀物質(zhì)所引起的散射光的量進(jìn)行檢測。還可以通過C⑶等的光檢測單元(未示出)檢測散射光L3。然而，通過在基板6 中設(shè)置光遮擋物質(zhì)來阻止散射光L3通過也是可行的。(1-b)基板6中有熒光體部件23的情況<步驟lbA>,該步驟與上述〈步驟laA>相同。<步驟lbB>,該步驟與上述〈步驟laB>相同?！床襟ElbC>，來自反應(yīng)區(qū)域2的側(cè)散射光L4透過熒光體部件23(包括熒光體部件的側(cè)壁、突光體部件層等)，從而變成突光(光L5)。光L5被設(shè)置在反應(yīng)區(qū)域2側(cè)方的反射部件20 (反射面201)反射并出射到光出射面方向上。〈步驟lbD>，通過光檢測單元5(光學(xué)檢測器5a)檢測出射光L5作為光量。即，基于熒光量檢測隨著擴增反應(yīng)的進(jìn)行所產(chǎn)生的沉淀物質(zhì)。散射光L3與上述情況(1-a)相同。(2)檢測從核酸擴增反應(yīng)中的熒光物質(zhì)得到的光成分下面將參照圖I和圖2A進(jìn)行關(guān)于用于檢測核酸擴增反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光物質(zhì)的核酸擴增反應(yīng)方法的描述。(2-a)基板6中沒有熒光體部件23的情況<步驟2aA>,該步驟與上述〈步驟laA>相同。<步驟2aB>，光L2照射到隨著反應(yīng)區(qū)域2內(nèi)核酸擴增反應(yīng)的進(jìn)行所產(chǎn)生的熒光物質(zhì)。此時，由于核酸擴增反應(yīng)中熒光物質(zhì)的產(chǎn)生，熒光量增加。因此，從反應(yīng)區(qū)域2中的熒光物質(zhì)產(chǎn)生前向熒光L3和側(cè)向熒光L4。<步驟2aC>，光L4被設(shè)置在反應(yīng)區(qū)域2側(cè)方的反射部件20 (反射面201)反射并出射到光出射面方向上?！床襟E2aD>，通過光檢測單元5(光學(xué)檢測器5a)檢測出射光L4作為光量。S卩，對于由于隨著擴增反應(yīng)的進(jìn)行所產(chǎn)生的熒光物質(zhì)導(dǎo)致的熒光量進(jìn)行檢測。還可以通過另一光檢測單元檢測熒光L3。然而，也可以通過在基板6中設(shè)置光遮擋物質(zhì)來阻止熒光L3的通過。(2-b)基板6中有熒光體部件23<步驟2bA>,該步驟與上述〈步驟laA>相同。<步驟2bB>，來自反應(yīng)區(qū)域2的光L4透過熒光體部件23 (包括熒光體部件的側(cè)壁、熒光體部件層等)，從而變成具有特定波長的熒光成分(光L5)。該光L5被設(shè)置在反應(yīng)區(qū)域2側(cè)方的反射部件20 (反射面201)反射并在出射到光出射面方向上。〈步驟2bC>，對于光L5，通過光檢測單元5(光學(xué)檢測器5a)檢測出射光量。S卩，基于具有特定波長的光成分的熒光量檢測隨著擴增反應(yīng)的進(jìn)行所產(chǎn)生的熒光物質(zhì)。
熒光L3與上述情況(2-a)相同。<3.核酸擴增反應(yīng)設(shè)備(第二實施方式)>圖7是示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明第二實施方式的核酸擴增反應(yīng)設(shè)備I的示意性概念圖。與第一實施方式相同構(gòu)造的描述將被省略。根據(jù)本發(fā)明實施方式(第二實施方式)的核酸擴增反應(yīng)設(shè)備I至少包括具有反應(yīng)區(qū)域2和反射部件20的可拆卸基板6、照射單元3以及光檢測單元5，并可適宜地包括溫度控制單元4。在本發(fā)明實施方式的核酸擴增反應(yīng)設(shè)備I中，光檢測單元5設(shè)置在照射單元3和反應(yīng)區(qū)域2 (基板6)之間?？稍诠鈾z測單元5和照射單元3之間適宜地設(shè)置激發(fā)濾光片8和聚光透鏡9。此 夕卜，可在光檢測單元5和反應(yīng)區(qū)域2之間適宜地設(shè)置聚光透鏡11和熒光濾光片10。根據(jù)需要，可在反應(yīng)區(qū)域2的光出射面?zhèn)仍O(shè)置光檢測單元51，并可在反應(yīng)區(qū)域2和光檢測單元51之間設(shè)置熒光濾光片(未示出)。這允許用于照射光的初始值的初始化的檢測，并提高了檢測靈敏度，尤其是反應(yīng)開始時的檢測靈敏度?？稍诜磻?yīng)區(qū)域2的光入射面?zhèn)壬线m宜地設(shè)置基板支撐臺(溫度控制單元4)。<4.操作核酸擴增反應(yīng)設(shè)備(第二實施方式)的操作〉圖2B所示的基板6優(yōu)選地用作裝配在上述核酸擴增反應(yīng)設(shè)備I (第二實施方式)中的基板6 (微流路芯片)。來自反應(yīng)區(qū)域2的側(cè)光被反射部件20 (反射面201)反射，從而經(jīng)過返回后出射到光入射面方向上。下面將對其與核酸擴增反應(yīng)設(shè)備I (第二實施方式)的操作一起進(jìn)行詳細(xì)說明。來自照射單元3的光LI透過激發(fā)濾光片8并變成光L2。光L2透過用于支撐光檢測單元5的支撐體5b并進(jìn)一步透過溫度控制單元4 (基板支撐臺)，從而照射到反應(yīng)區(qū)域2。光L2照射到反應(yīng)區(qū)域2中的核酸擴增產(chǎn)物，所產(chǎn)生的朝向側(cè)方的光L4被反射部件20 (反射面201)反射到光入射面方向。該反射光L4穿過溫度控制單元4、經(jīng)過聚光透鏡11并然后穿過熒光濾光片10，從而通過光檢測單元5檢測光成分。〈5 變形例〉在本發(fā)明實施方式的核酸擴增反應(yīng)設(shè)備中，反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)區(qū)域2可設(shè)置在例如溫度控制單元4上并還可用作核酸擴增檢測設(shè)備。此外，還可以將本發(fā)明實施方式的基板6 (微流路芯片)安裝在LAMP設(shè)備和PCR設(shè)備中，并利用反應(yīng)區(qū)域中的熒光物質(zhì)或渾濁物質(zhì)作為指標(biāo)來量化核酸。下面將對渾濁物質(zhì)用作指標(biāo)時這些設(shè)備的操作進(jìn)行說明。(I)RT-LAMP 設(shè)備的操作下面將對RT-LAMP設(shè)備中通過步驟Sll的工序檢測核酸的方法進(jìn)行說明。在溫度控制步驟(步驟Sll)中，溫度被設(shè)定為在反應(yīng)區(qū)域2中保持恒溫(60°C到650C )，從而進(jìn)行各個反應(yīng)區(qū)域2中的核酸擴增。在該LAMP法中，不用進(jìn)行從單鏈核酸到雙鏈核酸的熱變性，并在該等溫條件下重復(fù)進(jìn)行引物退火和核酸伸長。作為該核酸擴增反應(yīng)的結(jié)果，產(chǎn)生焦磷酸，并且金屬離子與該焦磷酸偶聯(lián)，從而形成不溶或難溶鹽并且該鹽用作渾濁物質(zhì)(測量波長300nm到800nm)。入射光(光L)照射到該渾濁物質(zhì)，從而變成散射光(光LI、L2)。通過光檢測單元5實時地測量散射光量，以進(jìn)行量化。也可量化透射光量。如果基板中有熒光體部件23，則可量化熒光量。當(dāng)在核酸擴增反應(yīng)中使用熒光物質(zhì)時，如果基板包括熒光體部件23，則光可變成特定的熒光成分，并可量化該特定的熒光成分的熒光量。(2) RT-PCR設(shè)備的操作以下將對RT-PRC設(shè)備中通過步驟Spl (熱變性)、步驟Sp2(引物退火)和步驟Sp3(DNA伸長)的工序檢測核酸的方法進(jìn)行說明。在熱變性步驟(步驟Spl)中，溫度被溫度控制單元控制為在反應(yīng)區(qū)域2中保持95 0C，并且雙鏈DNA通過變性變成單鏈DNA。 在隨后的退火步驟(步驟Sp2)中，溫度被設(shè)定成在反應(yīng)區(qū)域2中保持55°C。從而，引物和與該單鏈DNA互補的堿基序列偶聯(lián)。在下一 DNA延伸步驟(步驟Sp3)中，溫度被控制為在反應(yīng)區(qū)域2中保持72°C。從而，通過使用引物作為DNA合成的起點，進(jìn)行聚合酶反應(yīng)以將cDNA伸長。通過重復(fù)這些步驟Spl到Sp3的溫度循環(huán)，各個反應(yīng)區(qū)域2中的DNA被擴增。作為該核酸擴增反應(yīng)的結(jié)果，產(chǎn)生焦磷酸，且以上述方式檢測渾濁物質(zhì)，使得按照上述方法量化核酸的量。如果基板中具有熒光體部件，則可量化熒光量。當(dāng)在核酸擴增反應(yīng)中使用熒光物質(zhì)時，如果基板包括熒光體部件23，則光可變成特定的熒光成分，并可量化該特定的熒光成分的熒光量。優(yōu)選地，在本發(fā)明實施方式的核酸擴增反應(yīng)方法中，由于光照射產(chǎn)生的且來自用作核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場的反應(yīng)區(qū)域的側(cè)光，通過設(shè)置在該反應(yīng)區(qū)域周圍的反射部件導(dǎo)向到光出射面方向和/或光入射面方向上，并通過光檢測器檢測所導(dǎo)向的光量。此外，優(yōu)選地，側(cè)光為側(cè)散射光，檢測該側(cè)散射光透過熒光體部件所產(chǎn)生的熒光量。因此，這使得可以簡便地提取散射光和熒光。因而，可以更高的靈敏度簡便地測量核酸擴增。另外，消除了使用昂貴的有機熒光探針的需要。因此，可以低成本進(jìn)行測量，并提高了試劑的質(zhì)量保持。此夕卜，具有的優(yōu)勢在于，采用本方法，在通過現(xiàn)有技術(shù)的渾濁度檢測進(jìn)行的反應(yīng)檢測還是通過有機熒光探針進(jìn)行的光學(xué)檢測兩者中都不會有問題?！磳嵤├抵圃炖齀 :制造具有反光鏡的微芯片首先，利用用作微流路芯片的模具的SU8感光樹脂，通過光刻法將用于提供鉆孔的圓柱形結(jié)構(gòu)制造成任意的形狀。通過旋涂法在整個表面上涂覆透明樹脂來將傾斜面自動設(shè)定成角度0 2基于上述制造的模具，澆鑄并固化TOMS混合液，并通過分離法剝離模具。確認(rèn)在模具從其剝離的PDMS樹脂上形成用作鉆孔的通孔和通孔圓周的傾斜面。然后，通過例如濺射在PDMS基板的整個表面上順次形成Ag膜和Au膜。此外，通過光刻法在其上形成具有預(yù)定圓形的光致抗蝕圖樣，并利用該光致抗蝕圖樣作為掩模來蝕刻Ag膜和Au膜。從而，在透明樹脂上形成具有Ag/Au結(jié)構(gòu)的圓形反射膜。對于反射膜的材料，可采用對發(fā)出光的波長的光具有極高反射率的基板(例如，Ag或主要由Ag組成的金屬)。這是因為這允許端面發(fā)射光和通過玻璃/PDMS的反射而返回的循環(huán)光可被該反射膜有效地反射，最終，容易將光提取到外部。測試?yán)齀 :測試方法
(I)單鏈DNA弓丨物試劑的固定干燥混合用于LAMP的弓丨物溶液。通過利用從目標(biāo)序列的5'側(cè)的六個域，S卩，F(xiàn)3域、F2域、Fl域、BI域、B2域和B3域，執(zhí)行LAMP法引物的設(shè)計。在基本LAMP法中，使用四種引物(兩種內(nèi)引物和兩種外引物)。內(nèi)引物將Flc與F2偶聯(lián)并將Blc與B2偶聯(lián)。上游環(huán)狀引物設(shè)置用于Fl域和F2域之間的域的互補鏈，下游環(huán)狀引物設(shè)置用于BI域和B2域之間的域的互補鏈F2/B2、F3/B3和LF/LB的3丨末端的自由能和Flc/Blc的5丨末端的自由能設(shè)置成小于或等于_4kcal/mol。從整個目標(biāo)域，設(shè)計FIP-BIP以及F3和B3域，然后，對各個FIP-BIP域設(shè)計通過選擇和組合一對F3和B3域所獲得的引物集。FIP-BIP、F3和B3域的組合從5'末端開始 并繼續(xù)道3'末端。然后，該組合再次從5'末端開始，朝向3'末端向前進(jìn)行設(shè)計，并且對于一個FIP-BIP,最多組合三種F3-B3。由Primer Explorer設(shè)計的引物代碼如表I所示。表I
序列I上游內(nèi)部引物(FIP):
號 I TACACCTTTGTTCGAGTCATGATGAAAGGTTTGAGATATTCCCA 序列下游內(nèi)部引物(BIP):
號 2 CTCATGCTGGAGCAAAAAGCTTCATTTGCTGAGCTTTGGGT
序歹丨J F3 ；_
號 3 GCAATTGAGCTCAGTGTCAT
序歹丨J B3_
弓4 TCTTTCCCTTTATCATTAATGTAGG
序歹丨J LF ；_
號 5 TGGGCCATGAACTTGTCT 序列 LB:
號 6 GGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCA
(2)芯片粘合制造所有鉆孔固定有酶和引物的PDMS基板在O2 =IOccUOOff以及30秒將表面轉(zhuǎn)變成親水面的條件下進(jìn)行DP灰化。然后，在真空狀態(tài)下將roSM基板粘合到蓋玻片上。(3) LAMP 反應(yīng)用無痛針穿過PDMS，并將用于與定量的副本數(shù)反應(yīng)的提取混合液引入芯片的流路中。然后，對于每個反應(yīng)區(qū)域(鉆孔)，將該芯片設(shè)置在包括測量基板上的熒光探測器和加熱器的熒光檢測設(shè)備中。在該設(shè)備中，在反應(yīng)的同時，來自LED的激發(fā)光從微芯片基板中的各個鉆孔上方照射，并檢測由反應(yīng)區(qū)域中的反應(yīng)副產(chǎn)物散射的光。鉆孔中散射的激發(fā)光照射到鉆孔側(cè)壁的無機熒光體，然后發(fā)出熒光。該熒光通過在設(shè)置在激發(fā)光源的光軸上的微芯片基板反應(yīng)區(qū)域的下方設(shè)置的熒光檢測光檢測器檢測和測量。(4)結(jié)果確定(關(guān)于加熱時間)
根據(jù)LAMP反應(yīng)開始后每0. I分鐘測量的結(jié)果和以更短的時間間隔的測量結(jié)果，獲得產(chǎn)物，并且在流感病毒系統(tǒng)中，在約9分鐘時熒光強度開始變強。但是，直到反應(yīng)開始逝去16分鐘后，才能目視確認(rèn)鉆孔中的白色渾濁度。在使用透射光的現(xiàn)有技術(shù)的渾濁度系統(tǒng)中，S/N比較低，直到焦磷酸鎂膠體的特定大小變得足夠大并且產(chǎn)生白色渾濁度的程度，還難以進(jìn)行確定。與之相比，通過提取側(cè)方散射光增加了投影表面積。因而，可確保足夠高的S/Nt匕，這是因為在沒有散射物的透射光學(xué)系統(tǒng)中幾乎不存在側(cè)散射。此外，作為反射型的優(yōu)點，可確認(rèn)的是，可增強相對入射光的S/N比，這是因為光接收器可設(shè)置在入射光側(cè)上，并且如果通過側(cè)散射光獲得熒光，則可向光接收器設(shè)置濾光 片。根據(jù)本發(fā)明實施方式的核酸擴增反應(yīng)設(shè)備可通過反射部件反射側(cè)光來確保足夠高的S/N比，并且允許以高的檢測靈敏度進(jìn)行測量，而且設(shè)備容易使用。另外，通過使用熒光體部件，還可去除不必要的光成分而實現(xiàn)特定的光成分。因此，即成本低，又可以以高的檢測靈敏度容易地測量。本發(fā)明包含于2010年10月22日向日本專利局提交的日本優(yōu)先權(quán)專利申請JP2010-237174的相關(guān)主題，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合于此。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)設(shè)計要求和其他因素，可以進(jìn)行各種修改、組合、子組合以及替換，只要它們在所附權(quán)利要求書或其等同物的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種核酸擴增反應(yīng)設(shè)備，包括 反應(yīng)區(qū)域，被構(gòu)造為用作核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場； 照射單元，被構(gòu)造為向所述反應(yīng)區(qū)域照射光；以及 光檢測單元，被構(gòu)造為檢測反射光的量， 其中，設(shè)置有反射部件，所述反射部件將由于來自所述照射單元的光照射而在所述反應(yīng)區(qū)域產(chǎn)生的側(cè)光反射并將光導(dǎo)向所述光檢測單元。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸擴增反應(yīng)設(shè)備，其中，所述反射部件以將來自所述反應(yīng)區(qū)域的側(cè)光導(dǎo)向光出射面方向和光入射面方向的方式設(shè)置在所述反應(yīng)區(qū)域周圍。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸擴增反應(yīng)設(shè)備，其中，所述反射部件以將來自所述反應(yīng)區(qū)域的側(cè)光導(dǎo)向光出射面方向的方式設(shè)置在所述反應(yīng)區(qū)域周圍。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸擴增反應(yīng)設(shè)備，其中，所述反射部件以將來自所述反應(yīng)區(qū)域的側(cè)光導(dǎo)向光入射面方向的方式設(shè)置在所述反應(yīng)區(qū)域周圍。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸擴增反應(yīng)設(shè)備，其中，在所述反應(yīng)區(qū)域和所述反射部件之間設(shè)置一個或多個熒光體部件。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的核酸擴增反應(yīng)設(shè)備，其中，所述照射單元包括導(dǎo)光部件。
7.一種基板，包括 反射部件，被構(gòu)造為將來自用作核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場的反應(yīng)區(qū)域的側(cè)光反射。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基板，還包括 熒光體部件，被構(gòu)造為設(shè)置在所述反應(yīng)區(qū)域和所述反射部件之間。
9.一種核酸擴增反應(yīng)方法,包括 通過設(shè)置在用作核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場的反應(yīng)區(qū)域周圍的反射部件，將由光照射產(chǎn)生的且來自所述反應(yīng)區(qū)域的側(cè)光導(dǎo)向光出射面方向和光入射面方向；以及 通過光檢測器檢測導(dǎo)向的光量。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的核酸擴增反應(yīng)方法，其中，所述側(cè)光為側(cè)散射光，且對由所述側(cè)散射光透過熒光體部件所產(chǎn)生的熒光量進(jìn)行檢測。
11.一種核酸擴增反應(yīng)方法，包括 通過設(shè)置在用作核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場的反應(yīng)區(qū)域周圍的反射部件，將由光照射產(chǎn)生的且來自所述反應(yīng)區(qū)域的側(cè)光導(dǎo)向光出射面方向；以及 通過光檢測器檢測導(dǎo)向的光量。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的核酸擴增反應(yīng)方法，其中，所述側(cè)光為側(cè)散射光，對由所述側(cè)散射光透過熒光體部件所產(chǎn)生的熒光量進(jìn)行檢測。
13.—種核酸擴增反應(yīng)方法,包括 通過設(shè)置在用作核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場的反應(yīng)區(qū)域周圍的反射部件，將由光照射產(chǎn)生的且來自所述反應(yīng)區(qū)域的側(cè)光導(dǎo)向光入射面方向；以及 通過光檢測器檢測導(dǎo)向的光量。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的核酸擴增反應(yīng)方法，其中，所述側(cè)光為側(cè)散射光，對由所述側(cè)散射光透過熒光體部件所產(chǎn)生的熒光量進(jìn)行檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了核酸擴增反應(yīng)設(shè)備、方法及用于核酸擴增反應(yīng)設(shè)備的基板，該核酸擴增反應(yīng)設(shè)備包括反應(yīng)區(qū)域，被構(gòu)造為用作核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)場；照射單元，被構(gòu)造為用于將光照射到反應(yīng)區(qū)域；以及光檢測單元，被構(gòu)造為用于檢測反射光的量，其中，設(shè)置有用于將由于照射單元的光照射而在反應(yīng)區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生的側(cè)光反射并將光導(dǎo)向光檢測單元的反射部件。
文檔編號C12Q1/68GK102703309SQ201110312670
公開日2012年10月3日 申請日期2011年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月22日
發(fā)明者小島健介, 梶原淳志 申請人:索尼公司