專利名稱：一種監(jiān)測dna合成期生物發(fā)光報告基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細胞分子生物學領(lǐng)域，主要涉及一種監(jiān)測DNA合成期的生物發(fā)光報告基因，本發(fā)明還涉及該基因在抗腫瘤藥物篩選中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細胞從一次分裂結(jié)束開始，經(jīng)過物質(zhì)積累，直到下一次細胞分裂結(jié)束為止，稱為一個細胞周期。一個細胞周期可以人為地分為4個時期，即DNA合成前期(Gl期)、DNA合成期 (S期)、DNA合成后期(G2期)和有絲分裂期(M期)。正常細胞周期的運轉(zhuǎn)由多種機制控制， 以確保細胞分裂的有序進行，而當細胞周期調(diào)節(jié)失控時會導致腫瘤的發(fā)生。腫瘤細胞與一般正常細胞的最大差別是在于它能夠一直無限的增殖，這是腫瘤細胞的細胞周期已不受正常調(diào)控最明顯的證據(jù)。如果能夠利用藥物去抑制腫瘤細胞的細胞周期，使腫瘤細胞停止生長，甚至誘導腫瘤細胞發(fā)生程序性死亡，那么就能夠達到殺死腫瘤細胞治療惡性腫瘤的目的。S期是細胞進行大量DNA復制的階段，組蛋白和非組蛋白也在此期大量合成，最后完成染色體的復制。DNA復制需要多種酶的參與，包括DNA聚合酶、DNA連接酶、胸腺嘧啶核苷酸激酶、核苷酸還原酶等。由于S期是細胞周期的關(guān)鍵時刻，因此目前許多抗腫瘤藥物都是針對影響腫瘤細胞的S期所研發(fā)的。在抗癌藥物的研發(fā)過程中，傳統(tǒng)的動物實驗方法需要腫瘤生長到一定程度后處死動物切除腫瘤，然后通過免疫組化等技術(shù)才能獲得檢測指標。這種具有侵襲性的研究方法， 需要處死大量的動物，不能在同一組動物身上重復試驗，很難直觀、活體、動態(tài)地連續(xù)觀察腫瘤的生長轉(zhuǎn)移情況，特別是無法研究藥物作用下影響細胞的增殖動態(tài)變化以及細胞死亡的動力學變化等重要的時空信息。因此，建立一種可以在活體小動物實時、反復、非侵襲性地研究抗腫瘤藥物模型不僅可以加速藥物的研發(fā)，快速優(yōu)化新的治療方案，降低在研發(fā)藥物上所用動物的數(shù)量，而且還可以對癌癥治療中癌細胞的變化進行實時觀測和評估，對于抗腫瘤藥物的篩選及其作用機制研究具有重要意義。分子光學成像技術(shù)作為一種非侵入性動態(tài)成像技術(shù)，以其高分辨率、高靈敏度正越來越多的應(yīng)用于生命科學、醫(yī)學研究及藥物開發(fā)等方面，成為近年來動物模型研究最重要的進展，這一技術(shù)的完善和發(fā)展使非侵襲性研究抗腫瘤藥物的分子機制成為可能。該技術(shù)可以利用活體生物發(fā)光或熒光成像實時及連續(xù)動態(tài)監(jiān)測活細胞在動物體內(nèi)的各種生物學過程，因而能夠在不處死實驗動物的前提下，實時監(jiān)測體內(nèi)疾病變化的整個過程，可以對同一動物體進行連續(xù)觀察，減少動物個體間差異的影響，還可以減少實驗動物的數(shù)量。鑒于上述情況，本發(fā)明擬利用熒光素酶基因標記細胞周期蛋白A2 (cyclinA2),從而構(gòu)建一種具備高度敏感性，可以實時、反復地測定S期變化的光學影像報告系統(tǒng)，用于探討研究篩選 S期敏感的抗腫瘤藥物。cyclinA2由432個氨基酸組成，其中210 295位氨基酸為“ cyclin box，，， 在N末端47 55位氨基酸序列稱為“destruction box(D-Box)",D-Box決定泛素連接酶 APCwk2tl是否特異性地與CyClinA2結(jié)合，是泛素化介導的蛋白降解的重要信號。CyClinA2與CDK2結(jié)合，在G廣S轉(zhuǎn)變過程中被活化，從而調(diào)控S期進展。在整個細胞周期中， cyclinA2的變化是受轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后修飾來調(diào)節(jié)的。在Gl晚期開始逐漸增加，S期積累到峰值，早中期后通過依賴APC/C泛素化途徑降解，CDC20分子在此降解過程中發(fā)揮重要作用。因此CyClinA2可以視為一種細胞周期S期的特異性蛋白，反映CyClinA2蛋白的轉(zhuǎn)錄與翻譯后調(diào)控的報告基因可以報告細胞周期的S期?；谝陨螩yClinA2的調(diào)控機制，本發(fā)明通過基因工程技術(shù)將CyClinA2基因全長與熒光素酶基因融合作為S期的報告基因，在離體培養(yǎng)的細胞株中驗證了其作為篩選S期特異性抗腫瘤藥物的分子影像報告系統(tǒng)的可行性，并為在體篩選S期抗腫瘤藥物及研究S期的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個實時、非侵襲性地監(jiān)測DNA合成期(S期)的生物發(fā)光報
告基因。本發(fā)明的另一目的是提供該基因在以S期為靶點的抗腫瘤藥物篩選領(lǐng)域中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的
一種監(jiān)測DNA合成期生物發(fā)光報告基因，其特征在于將細胞周期蛋白A2與熒光素酶基因融合，從而形成一種可以用于監(jiān)測細胞周期S期的生物發(fā)光報告基因，其核苷酸序列為
AAGCTTGCCACCATGTTGGGCAACTCTGCGCCGGGGCCTGCGACCCGCGAGGCGGGCTCGGCGCTGCTAGCA TTGCAGCAGACGGCGCTCCAAGAGGACCAGGAGAATATCAACCCGGAAAAGGCAGCGCCCGTCCAACAACCGCGGAC CCGGGCCGCGCTGGCGGTACTGAAGTCCGGGAACCCGCGGGGTCTAGCGCAGCAGCAGAGGCCGAAGACGAGACGGG TTGCACCCCTTAAGGATCTTCCTGTAAATGATGAGCATGTCACCGTTCCTCCTTGGAAAGCAAACAGTAAACAGCCT GCGTTCACCATTCATGTGGATGAAGCAGAAAAAGAAGCTCAGAAGAAGCCAGCTGAATCTCAAAAAATAGAGCGTGA AGATGCCCTGGCTTTTAATTCAGCCATTAGTTTACCTGGACCCAGAAAACCATTGGTCCCTCTTGATTATCCAATGG ATGGTAGTTTTGAGTCACCACATACTATGGACATGTCAATTGTATTAGAAGATGAAAAGCCAGTGAGTGTTAATGAA GTACCAGACTACCATGAGGATATTCACACATACCTTAGGGAAATGGAGGTTAAATGTAAACCTAAAGTGGGTTACAT GAAGAAACAGCCAGACATCACTAACAGTATGAGAGCTATCCTCGTGGACTGGTTAGTTGAAGTAGGAGAAGAATATA AACTACAGAATGAGACCCTGCATTTGGCTGTGAACTACATTGATAGGTTCCTGTCTTCCATGTCAGTGCTGAGAGGA AAACTTCAGCTTGTGGGCACTGCTGCTATGCTGTTAGCCTCAAAGTTTGAAGAAATATACCCCCCAGAAGTAGCAGA GTTTGTGTACATTACAGATGATACCTACACCAAGAAACAAGTTCTGAGAATGGAGCATCTAGTTTTGAAAGTCCTTA CTTTTGACTTAGCTGCTCCAACAGTAAATCAGTTTCTTACCCAATACTTTCTGCATCAGCAGCCTGCAAACTGCAAA GTTGAAAGTTTAGCAATGTTTTTGGGAGAATTAAGTTTGATAGATGCTGACCCATACCTCAAGTATTTGCCATCAGT TATTGCTGGAGCTGCCTTTCATTTAGCACTCTACACAGTCACGGGACAAAGCTGGCCTGAATCATTAATACGAAAGA CTGGATATACCCTGGAAAGTCTTAAGCCTTGTCTCATGGACCTTCACCAGACCTACCTCAAAGCACCACAGCATGCA CAACAGTCAATAAGAGAAAAGTACAAAAATTCAAAGTATCATGGTGTTTCTCTCCTCAACCCACCAGAGACACTAAA TCTGCAAGCTTGGCATTCCGGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGC CATTCTATCCGCTGGAAGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGA ACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGGACATCACTTACGCTGAGTACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGC AGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTC AACAGTATGGGCATTTCGCAGCCTACCGTGGTGTTCGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAA AAAGCTCCCAATCATCCAAAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGT TCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTGCCAGAGTCCTTCGATAGGGACAAGACAATT GCACTGATCATGAACTCCTCTGGATCTACTGGTCTGCCTAAAGGTGTCGCTCTGCCTCATAGAACTGCCTGCGTGAG ATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCC ATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAA GAAGAGCTGTTTCTGAGGAGCCTTCAGGATTACAAGATTCAAAGTGCGCTGCTGGTGCCAACCCTATTCTCCTTCTT CGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGTGGCGCTCCCCTCTCTA AGGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCCAAGAGGTTCCATCTGCCAGGTATCAGGCAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACA TCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAA GGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAAAGAGGCGAACTGTGTGTGAGAGGTCCTATGATTA TGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATA GCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATCGTTGACCGCCTGAAGTCTCTGATTAAGTACAAAGGCTATCAGGT GGCTCCCGCTGAATTGGAATCCATCTTGCTCCAACACCCCAACATCTTCGACGCAGGTGTCGCAGGTCTTCCCGACG ATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGAT TACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCT TACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGATCGCCGTGTAA。本發(fā)明技術(shù)方案包括構(gòu)建pGL3-CYCA-Luc重組表達載體，該載體含有上述核苷酸序列。本發(fā)明的技術(shù)方案包括pGL3-CYCA-Luc重組表達載體在以細胞周期S期為靶點的抗腫瘤藥物篩選中的應(yīng)用。本發(fā)明以包含人CyClinA2基因全長的PBS質(zhì)粒為模板，在cyclinA2基因兩端設(shè)計引物，擴增cyclinA2 cDNA全長并克隆至pGL3-Control載體Luc基因的5’端，形成一種可表達融合蛋白的真核重組表達載體，即“pGL3-CYCA-Luc”載體。該載體轉(zhuǎn)染至腫瘤細胞后可表達融合蛋白“CYCA-Luc”。體外實驗證明該融合蛋白可通過泛素化依賴性途徑降解，呈細胞周期依賴性變化并能用于監(jiān)測S期特異性抗腫瘤藥物作用效果。本發(fā)明將在篩選針對S期的抗腫瘤藥物等領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。下面對本發(fā)明內(nèi)容作進一步的詳述。構(gòu)建真核重組表達載體pGL3-CYCA-Luc。利用I^rimer軟件設(shè)計引物，以PBS質(zhì)粒為模板擴增cyclinA2 cDNA全長，引物具體如下
Sense :GCGCAAGCTTGCCACCATGTTGGGCAACTCTGCGC，引物中加入 Kozak 序列以提高翻譯起始效率。Anti-sense :GCCAAGCTTGCAGATTTAGTGTCTCTGGTGGGTTG
PCR擴增后的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，在1200 bp位置可見明顯條帶。利用限制性內(nèi)切酶Hind III分別酶切PCR產(chǎn)物和載體pGL3-Control并回收產(chǎn)物。本實驗中為防止載體自連，酶切后的載體進行去磷酸化處理。酶切產(chǎn)物回收后，用T4 DNA連接酶在4 V連接過夜。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，在含抗生素Amp平板上篩選重組子，通過酶切鑒定和測序確定得到重組表達載體pGL3-CYCA-Luc。本發(fā)明中重組表達載體具有以下基本結(jié)構(gòu)啟動子(3￥40)、融合蛋白編碼區(qū)(0701丨1^2-111(^作^86)、終止密碼子(144)、0嫩序列(0嫩復制起始點等)順序連接而成的雙鏈環(huán)狀DNA分子，如圖1所示。將構(gòu)建好的重組表達載體以脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染U20S細胞，通過Western blot鑒定轉(zhuǎn)染細胞株是否表達融合蛋白CYCA-Luc。結(jié)果顯示，使用熒光素酶和CyClinA2的抗體在110 KD位置均可發(fā)現(xiàn)特異性條帶，體外熒光素酶活性分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pGL3-CYCA-Luc 質(zhì)粒的細胞熒光素酶相對強度比轉(zhuǎn)染pcDNA3. 1質(zhì)粒即對照組高4000倍左右，表明融合蛋白可在轉(zhuǎn)染細胞株表達。隨后利用G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細胞，命名為 “U20S-CYCA-LUC”。在接下來得實驗中，通過細胞周期同步化方法進一步分析了融合蛋白CYCA-Luc 是否隨細胞周期變化。本發(fā)明中S期同步化藥物為mimosine。流式分析結(jié)果顯示，mimosine 處理細胞20 h后，隨著釋放時間的增加，S期細胞比例逐漸增加。Westren bloot和熒光素酶活性分析結(jié)果顯示，隨著S期細胞比例的增加CYCA-Luc表達和熒光素酶相對強度增加， 提示CYCA-Luc表達與S期細胞比例密切相關(guān)。后期促進復合物(anaphase-promoting complex/cyclosome, APC/C)在調(diào)控有絲分裂的過程中起到重要的作用。APCedc^在有絲分裂途徑前中期被激活，通過泛素化依賴性途徑降解CyClinA2。為確定融合蛋白是否呈泛素化依賴性降解，本發(fā)明中使用CDC20 小分子干擾RNA封閉⑶C20表達，以確定⑶C20表達下調(diào)后是否可導致CYCA-Luc表達的上調(diào)。將⑶C20小分子干擾RNA以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染U20S-CYCA-Luc細胞后，分別進行熒光素酶活性分析和Western blot檢測。結(jié)果表明，⑶C20小分子干擾RNA可使 U20S-CYCA-Luc細胞熒光素酶相對強度升高和CYCA-Luc表達上調(diào)，而NC (陰性對照)則無明顯變化，表明CYCA-Luc呈泛素化依賴性途徑降解。確定CYCA-Luc呈泛素依賴性途徑降解后，本發(fā)明隨后驗證了該融合蛋白是否可以作為生物發(fā)光報告蛋白準確反映S期特異性抗腫瘤藥物作用效果。使用目前臨床常用的 S期特異性藥物如5-氟尿嘧啶(5-FU)和羥基喜樹堿(HCPT)作用U20S-CYCA-LUC細胞使其發(fā)生S期阻滯，通過熒光素酶活性分析和western blot檢測確定是否可以引起細胞的熒光素酶相對強度升高和CYCA-Luc表達上調(diào)。結(jié)果顯示5-FU和HCPT可使U20S-CYCA_Luc 細胞CYCA-Luc表達上調(diào)和熒光素酶相對強度升高，提示該蛋白可以用于監(jiān)測S期特異性抗腫瘤藥物活性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果通過基因工程技術(shù)將S期特異性蛋白CyClinA2克隆于熒光素酶基因上游，形成重組表達載體pGL3-CYCA-Luc。通過上述研究工作，將融合蛋白CYCA-Luc作為監(jiān)測S期的生物發(fā)光報告蛋白。該報告蛋白可受泛素化依賴性的蛋白體系調(diào)控，可在培養(yǎng)的細胞株中通過光學信號變化準確反映S期特異性抗腫瘤藥物作用效果。該發(fā)明應(yīng)用活體小動物后，利用活體成像系統(tǒng)可實現(xiàn)在體條件下實時、反復、非侵襲性地研究S期特異性抗腫瘤藥物，從而避免傳統(tǒng)方法中需要處死實驗動物等諸多局限。因此，該發(fā)明不僅可以加速藥物的研發(fā)速度，快速優(yōu)化新的治療方案，降低在研發(fā)藥物上所用動物的數(shù)量，而且還可以對癌癥治療中癌細胞的變化進行實時觀測和評估，對于S期特異性抗腫瘤藥物的篩選及其作用機制研究具有重要意義。


圖1 :pGL3-CYCA-Luc構(gòu)建及酶切鑒定。其中A: pGL3-CYCA_Luc構(gòu)建示意圖；B: pGL3-CYCA-Luc 酶切結(jié)果。圖2 :pGL3-CYCA-Luc在U20S細胞中表達。其中A western blot結(jié)果；B 熒光素酶活性分析結(jié)果。圖3 細胞周期同步化分析。其中A 流式分析結(jié)果；B western blot結(jié)果；C 焚光素酶活性分析結(jié)果。圖4 ⑶C20小分子干擾實驗結(jié)果。其中A western blot結(jié)果；B 熒光素酶活性分析結(jié)果。圖5 =S期特異性抗腫瘤藥物作用實驗。其中A western blot結(jié)果；B 熒光素酶活性分析。
具體實施例方式(一)構(gòu)建真核重組表達載體pGL3-CYCA_Luc
1.引物設(shè)計利用primer軟件設(shè)計一對引物。在上游引物5’端加入保護堿基、 HindIII酶切位點及Kozak序列，下游引物5’端加入保護堿基和HindIII酶切位點。整理好的引物序列送寶生物工程(大連)有限公司合成。2. PCR擴增目的片段反應(yīng)體系50 μ , Premix ExTaq 25 μ ；模板 (PBS-cyclinA2) 5 μ ；引物 1 20 Mm, 1. 5 μ ；引物 2 20 Mm, 1. 5 μ ；滅菌水 17 μ 。充分混勻后，在 PCR 儀上完成下列操作94°C 5 min,98°C 10 s，56°C 30 s，72°C 1 min，30 cycles。3.質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物的酶切與回收總體系20 μ , Hind III 1 μ , 10 X Mbuffer 2 μ ，PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒DNA<1 Pg，滅菌水補齊至20 μ 。4.線性質(zhì)粒的去磷酸化反應(yīng)總體系50 μ , DNA Fragments in TE Buffer 5 pmol, 10 X ALKaline, Phosphatase Buffer 2 μ , dH20 up to 50 PL，37°C 反應(yīng) 30 min, DNA回收試劑盒回收反應(yīng)產(chǎn)物，20 μ TE Buffer溶解沉淀。5. PCR產(chǎn)物與目的片段的連接總體系25 μ , Τ4 DNA連接酶1 μ ，10 X Mbuffer 2 μ ，PCR 產(chǎn)物 0.3 pmol, pGL3-control 0. 03 pmol，滅菌水補齊至 25 PL，4°C過
夜連接。6.轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞將-80 V下保存的100 μ 感受態(tài)細胞置于冰上，完全解冰后輕輕地將細胞均勻懸?。患尤? PLpGL3-control質(zhì)粒，DNA濃度為0.5 μβ/μ ，輕輕混勻；冰上放置30 min ；42 °C水浴熱激90 s ；冰上放置5 min ；加ImL無Amp的LB 培養(yǎng)液，37 V培養(yǎng)60 min，使細菌恢復正常生長狀態(tài)；室溫下4000 rpm離心5 min，用槍頭吸掉1 mL上清液，用剩余的培養(yǎng)液將細胞懸浮；將細菌涂布在Amp/LB瓊脂平板上， Amp工作濃度100；37 °C正向放置1 h，待接種的液體吸收進瓊脂后，將平皿倒置培養(yǎng)過夜。7.質(zhì)粒的小量提取、酶切鑒定及測序詳細步驟見TaKaRa公司MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. 0產(chǎn)品說明書。酶切步驟如下
第一組總體系 20 μ L,DNA 3 yL, 10 X Buffer 2 yL，無菌水 15 μ L ；第二組總體系 20 μ L,DNA 3 yL, 10 X Buffer 2 μ L,NheIl μ L, 14 μ L無菌水；第三組總體系20 μ L, DNA 3 μ L, 10 X Buffer 2 μ L，NcoIl μ L, 14 μ L 無菌水；第四組總體系 20 μ L, DNA 3 μ L, 10 X Buffer 2 μ L，NcoIl μ L，NheIl μ L, 13 μ L 無菌水。輕輕混勻， 37 V酶切2 h，結(jié)果見圖1。提取質(zhì)粒送至公司測序，測序結(jié)果顯示DNA序列及插入方向正確，表明成功構(gòu)建重組表達載體pGL3-CYCA-Luc。(二)建立U20S-CYCA-Luc穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細胞
將構(gòu)建好的pGL3-CYCA-Luc質(zhì)粒以脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染U20S細胞，具體方法為將 U20S細胞培養(yǎng)于六孔培養(yǎng)板至匯合70%左右；根據(jù)Lipofectamine 2000的說明書加 8. 0 μ g pGL3-CYCA-Luc 質(zhì)粒及 20 yL 的 Lipofectamine 2000 進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染 48 h 后消化細胞，RLB裂解，制備蛋白樣品，通過Western blot鑒定融合蛋白表達。結(jié)果顯示， 使用熒光素酶和CyClinA2的抗體在110 KD位置均可發(fā)現(xiàn)特異性條帶，而未轉(zhuǎn)染細胞則未見條帶，表明融合蛋白已在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細胞表達。體外熒光素酶活性分析結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細胞熒光素酶表達活性比對照細胞高4000倍左右，如圖2所示。這些結(jié)果表明，我們構(gòu)建的真核重組表達載體可在哺乳動物細胞中表達融合蛋白。為獲得穩(wěn)定表達融合蛋白的細胞，本發(fā)明中使用1000 Pg/mL濃度的G418對轉(zhuǎn)染細胞進行了篩選。由于pGL3-CYCA-Luc質(zhì)粒無G418抗性基因Neo，因此在轉(zhuǎn)染 pGL3-CYCA-Luc質(zhì)粒同時需共轉(zhuǎn)染pcDNA3. 1質(zhì)粒，該質(zhì)粒含Neo基因。具體轉(zhuǎn)染的方法為首先，在EP管中加入500 μ 無血清培養(yǎng)基，然后加入15 μ Lipo 2000(Invitrogen 公司)轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻后，室溫下靜置5 min0取12 μg質(zhì)粒，其中含有pcDNA3. 1和 pGL3-CYCA-Luc兩種質(zhì)粒，二者比例為1 10，加入以上的混合物中，輕輕混勻。室溫下靜置 20 min后，取以上混合物加入培養(yǎng)皿中，置于5% CO2、濕度95%和37°C條件下培養(yǎng)。 24 h后，把培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液換為含有G418的常規(guī)DMEM培養(yǎng)液進行篩選。待對照細胞即未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞被全部被殺死后，將細胞置于藥物濃度為800 Pg/mL的DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。在上述條件下，細胞能夠持續(xù)生長，表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株已被成功建立。建立的細胞株用于進一步分析使用。(三)在培養(yǎng)細胞株研究融合蛋白CYCA-Luc是否報告S期。1.細胞周期同步化在60mm的培養(yǎng)皿中加適量的U20S-CYCA_Luc細胞，將細胞培養(yǎng)至指數(shù)生長期的早期，密度約為50%左右；棄掉培養(yǎng)基，加入含0.2 mmol mimosine (sigma公司)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20 h ；棄掉含mimosine的培養(yǎng)基，用PBS液洗2次，換普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；在更換培養(yǎng)基后的0、3、6、9、12 h各時間點收獲細胞樣品用于流式分析細胞周期。2.流式分析細胞周期將上述收獲的細胞用PBS洗二遍；用70%的冰浴酒精過夜固定；離心去乙醇，PBS清洗一次；每管細胞樣品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液(碧云天)，緩慢并充分重懸細胞沉淀，37°C避光溫浴30 min。流式檢測和分析。實驗結(jié)果表明， 隨著釋放時間的延長，S期細胞所占比例逐漸增加，如圖3所示。3.熒光素酶活性分析和Western blot檢測將上述收獲的細胞用PBS洗二次后轉(zhuǎn)至ImL EP管中；每個樣品中加入100 μ RLB裂解液，制備蛋白樣品；BCA法測定蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)至相等，利用熒光發(fā)光儀(lumat LB 9507，BERTHO⑶公司)檢測熒光素酶相對活性及Western blot檢測融合蛋白表達，以確定該報告蛋白是否在S期積聚。結(jié)果顯示，mimosine處理細胞20 h后，隨著釋放時間的延長熒光素酶相對強度和CYCA-Luc 表達量均逐漸增加，說明報告蛋白的表達的變化與S期細胞數(shù)量的變化相一致，如圖3所
7J\ ο4.確定CYCA-Luc是否受泛素化依賴性降解調(diào)控。細胞周期進入有絲分裂期后，CyClinA2被APCede2tl,即E3連接酶復合物降解， 所以這一降解的過程屬泛素化依賴性。這一內(nèi)容中主要探討CDC20基因沉默后，能否引起CYCA-Luc重新積聚以確定本發(fā)明的融合蛋白CYCA-Luc降解途徑是否依賴APCdc^活性。首先用DEPC水處理相關(guān)實驗用品，在60 mm培養(yǎng)皿中加入適量的U20S-CYCA_Luc 細胞；根據(jù) Lipofectamine2000 Gnvitrogen 公司)的說明書加入 200 pmol siRNA 及 10 μ L的Lipofectamine 2000進行轉(zhuǎn)染；48 h后用RLB裂解液裂解細胞；利用BCA法測蛋白濃度，蛋白樣品分兩部分，一部分用做熒光素酶活性檢測，一部分用做western blot 分析。結(jié)果顯示，利用siRNA干擾⑶C20后，CYCA-Luc的表達上調(diào)、熒光素酶相對強度增強，表明CYCA-Luc通過⑶C20介導的泛素化依賴性途徑降解，如圖4所示。⑶C20 siRNA 序列如下
Scramble siRNA:
Sense5' -UUCUCCGAAC⑶⑶CAC⑶TT-3‘
Anti-Sense 5' -AC⑶GACACGUUCGGAGAATT-3‘ CDC20 siRNA:
Sense5' -GGGAAUAUAUAUCCUCU⑶TT-3‘
Anti-Sense 5’ -ACAGAGGAUAUAUAUUCCCTT-3， (四)驗證S期靶向藥物是否誘導融合蛋白CYCA-Luc表達上調(diào)為進一步確定本發(fā)明的融合蛋白CYCA-Luc是否可以作為生物發(fā)光報告蛋白用于篩選細胞周期S期特異性藥物，本發(fā)明利用目前臨床上使用的S期特異性藥物，如5-FU和 HCPT處理U20S-CYCA-Luc細胞，并進行熒光素酶活性分析和Western blot檢測，以確定 S期靶向藥物對CYCA-Luc蛋白表達的影響。M期特異性藥物紫杉醇(PTX)在這一實驗中作為陰性對照藥物。首先用1 Pg/mL的5-FU、HCPT或50 nM的PTX處理U20S-CYCA_Luc 細胞，18 h后收集細胞樣品，流式分析細胞周期，檢測兩種藥物對細胞周期分布的影響。收集的另一部分細胞利用RLB裂解液進行裂解，BCA法測定蛋白濃度后進行熒光素酶活性和Western blot檢測。流式分析結(jié)果顯示，5-FU和HCPT處理細胞18 h后，S期細胞數(shù)量明顯增加，而PTX則使S期細胞數(shù)量明顯降低。熒光素酶活性分析和Western blot檢測結(jié)果顯示，5-FU和HCPT處理細胞18 h后可使熒光素酶相對強度增加和CYCA-Luc表達上調(diào)，而PTX則使熒光素酶相對強度降低和CYCA-Luc表達下調(diào)，如圖5所示。上述結(jié)果提示，細胞周期S期特異性抗腫瘤藥物作用U20-CYCA-Luc細胞后可使融合蛋白CYCA-Luc 表達上調(diào)和熒光素酶相對強度增加，表明該融合蛋白可作為生物發(fā)光報告蛋白用于指示細胞周期S期并用于細胞周期S期特異性抗腫瘤藥物篩選。
權(quán)利要求
1. 一種監(jiān)測DNA合成期生物發(fā)光報告基因，其特征在于將細胞周期蛋白A2與熒光素酶基因融合，從而形成一種可以用于監(jiān)測細胞周期S期的生物發(fā)光報告基因，其核苷酸序列為AAGCTTGCCACCATGTTGGGCAACTCTGCGCCGGGGCCTGCGACCCGCGAGGCGGGCTCGGCGCTGCTAGCA TTGCAGCAGACGGCGCTCCAAGAGGACCAGGAGAATATCAACCCGGAAAAGGCAGCGCCCGTCCAACAACCGCGGAC CCGGGCCGCGCTGGCGGTACTGAAGTCCGGGAACCCGCGGGGTCTAGCGCAGCAGCAGAGGCCGAAGACGAGACGGG TTGCACCCCTTAAGGATCTTCCTGTAAATGATGAGCATGTCACCGTTCCTCCTTGGAAAGCAAACAGTAAACAGCCT GCGTTCACCATTCATGTGGATGAAGCAGAAAAAGAAGCTCAGAAGAAGCCAGCTGAATCTCAAAAAATAGAGCGTGA AGATGCCCTGGCTTTTAATTCAGCCATTAGTTTACCTGGACCCAGAAAACCATTGGTCCCTCTTGATTATCCAATGG ATGGTAGTTTTGAGTCACCACATACTATGGACATGTCAATTGTATTAGAAGATGAAAAGCCAGTGAGTGTTAATGAA GTACCAGACTACCATGAGGATATTCACACATACCTTAGGGAAATGGAGGTTAAATGTAAACCTAAAGTGGGTTACAT GAAGAAACAGCCAGACATCACTAACAGTATGAGAGCTATCCTCGTGGACTGGTTAGTTGAAGTAGGAGAAGAATATA AACTACAGAATGAGACCCTGCATTTGGCTGTGAACTACATTGATAGGTTCCTGTCTTCCATGTCAGTGCTGAGAGGA AAACTTCAGCTTGTGGGCACTGCTGCTATGCTGTTAGCCTCAAAGTTTGAAGAAATATACCCCCCAGAAGTAGCAGA GTTTGTGTACATTACAGATGATACCTACACCAAGAAACAAGTTCTGAGAATGGAGCATCTAGTTTTGAAAGTCCTTA CTTTTGACTTAGCTGCTCCAACAGTAAATCAGTTTCTTACCCAATACTTTCTGCATCAGCAGCCTGCAAACTGCAAA GTTGAAAGTTTAGCAATGTTTTTGGGAGAATTAAGTTTGATAGATGCTGACCCATACCTCAAGTATTTGCCATCAGT TATTGCTGGAGCTGCCTTTCATTTAGCACTCTACACAGTCACGGGACAAAGCTGGCCTGAATCATTAATACGAAAGA CTGGATATACCCTGGAAAGTCTTAAGCCTTGTCTCATGGACCTTCACCAGACCTACCTCAAAGCACCACAGCATGCA CAACAGTCAATAAGAGAAAAGTACAAAAATTCAAAGTATCATGGTGTTTCTCTCCTCAACCCACCAGAGACACTAAA TCTGCAAGCTTGGCATTCCGGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGC CATTCTATCCGCTGGAAGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGA ACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGGACATCACTTACGCTGAGTACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGC AGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTA TGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTC AACAGTATGGGCATTTCGCAGCCTACCGTGGTGTTCGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAA AAAGCTCCCAATCATCCAAAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGT TCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTGCCAGAGTCCTTCGATAGGGACAAGACAATT GCACTGATCATGAACTCCTCTGGATCTACTGGTCTGCCTAAAGGTGTCGCTCTGCCTCATAGAACTGCCTGCGTGAG ATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCC ATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAA GAAGAGCTGTTTCTGAGGAGCCTTCAGGATTACAAGATTCAAAGTGCGCTGCTGGTGCCAACCCTATTCTCCTTCTT CGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGTGGCGCTCCCCTCTCTA AGGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCCAAGAGGTTCCATCTGCCAGGTATCAGGCAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACA TCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAA GGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAAAGAGGCGAACTGTGTGTGAGAGGTCCTATGATTA TGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATA GCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATCGTTGACCGCCTGAAGTCTCTGATTAAGTACAAAGGCTATCAGGT GGCTCCCGCTGAATTGGAATCCATCTTGCTCCAACACCCCAACATCTTCGACGCAGGTGTCGCAGGTCTTCCCGACGATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGAT TACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCT TACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGATCGCCGTGTAA。
2.一種重組表達載體pGL3-CYCA-Luc，該載體含有權(quán)利要求1所述核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的重組表達載體，其特征在于該載體在以細胞周期S期為靶點的抗腫瘤藥物篩選中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學基因合成，主要涉及一種監(jiān)測DNA合成期生物發(fā)光報告基因，本發(fā)明還涉及該基因在抗腫瘤藥物篩選的應(yīng)用。本發(fā)明以包含人cyclinA2基因全長的PBS質(zhì)粒為模板，在cyclinA2基因兩端設(shè)計引物，擴增cyclinA2cDNA全長并克隆至pGL3-control載體Luc基因的5’端，形成一種可表達融合蛋白的真核重組表達載體，即“pGL3-CYCA-Luc”載體。該載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至腫瘤細胞后可表達融合蛋白“CYCA-Luc”。體外實驗證明該融合蛋白通過泛素化依賴性途徑降解，可呈細胞周期依賴性變化并可用于監(jiān)測S期特異性抗腫瘤藥物作用效果。本發(fā)明在篩選針對S期的抗腫瘤藥物等領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/62GK102358905SQ201110312909
公開日2012年2月22日 申請日期2011年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月14日
發(fā)明者張國君, 趙瑞君, 陳志鴻 申請人:汕頭大學醫(yī)學院, 牡丹江醫(yī)學院