專利名稱：基于微孔陣列薄膜的高通量細胞電融合裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基于微孔陣列薄膜的高通量細胞電融合裝置，其主要使用范圍為動物、植物、微生物細胞的融合細胞制備，同時也可應用于電穿孔、電轉染等研究中，可廣泛應用于遺傳學、動植物遠緣雜交育種、發(fā)育生物學、藥物篩選、單克隆抗體制備、哺乳動物克隆等領域。
背景技術：
細胞電融合技術自上世紀80年代起，因為其效率較高、操作簡便、對細胞無毒害， 便于觀察，適于儀器應用和規(guī)范操作等優(yōu)點，得到了快速發(fā)展和廣泛應用。細胞電融合可以分為兩個主要階段細胞排隊和細胞融合。細胞排隊的原理在于生物細胞處于非均勻電場中時，被電場極化形成偶極子，該偶極子在非均勻電場作用中會受到特定的力而發(fā)生運動，即介電電泳 (Dielectrophoresis).利用介電電泳可以控制細胞的運動，在細胞電融合過程中，利用介電電泳現(xiàn)象使細胞排列成串，壓緊相互接觸的細胞，完成細胞電融合過程所需的排隊和融合后壓緊。細胞融合的原理在于強電場作用會導致細胞膜穿孔，這種效應稱為細胞膜電致穿孔效應(Electroporation)。在細胞電融合過程中利用電致穿孔效應，使兩接觸的細胞膜穿孔，從而使細胞間進行膜內物質交換，使細胞質、膜融合，在一定強度的電場作用下的電穿孔是一種可逆穿孔，細胞膜會在減小或撤銷電場強度時回復原狀，產(chǎn)生細胞電融合過程的膜融合。傳統(tǒng)的細胞電融合系統(tǒng)通常都采用大型融合槽，其優(yōu)點在于
(1)操作較為簡便，采用大型融合槽降低了包括樣品進樣與出樣等步驟的難度；
(2)加工簡便，大型融合槽的尺寸一般都在厘米量級，利用傳統(tǒng)的機械加工手段可以較為方便地加工出所需要的融合槽結構；
(3)融合量大，傳統(tǒng)的融合槽可以容納數(shù)毫升樣品，一次實驗即可獲得足夠的細胞進行后期篩選、培養(yǎng)等工作。但傳統(tǒng)的細胞電融合設備也存在一些缺點
(1)由于融合槽中的電極間距較大，要達到夠強度的細胞排隊、融合及壓緊信號，需要很高的外界驅動電壓，往往高達幾百上千伏，對系統(tǒng)的電氣安全性要求高，系統(tǒng)的成本也因此大為提高；
(2)電極間的較大間距不利于對細胞的精確控制等。為解決這一問題，研究者將細胞電融合技術與MEMS加工技術相結合。MEMS技術的加工范圍通常在1 50 μ m，這與細胞的直徑范圍相當，所產(chǎn)生的微結構能有效控制細胞。 有多家研究機構開始研究利用微流控芯片技術或者微電極陣列技術構建生物芯片來實現(xiàn)細胞電融合操作。例如，美國MIT的研究人員提出了利用微流控芯片技術實現(xiàn)對細胞的精確控制，達到高效的細胞配對和融合；國內趙志強等研究人員也提出了利用MEMS技術構建微電極陣列，通過構建微米量級間距的微電極陣列，實現(xiàn)在低電壓條件下的細胞電融合。日本研究者提出的利用一對微電極，通過流路控制細胞的流動，使細胞運動到微電極對位置區(qū)域后，利用電場作用使兩個細胞形成配對，再借助于電脈沖實現(xiàn)電融合。但上述芯片仍然存在一定的問題，如美國MIT所研究的微流控芯片雖然較好的解決了細胞配對的問題，但該芯片兩電極間的間距較大，仍然需要較高的外界電壓才能夠實現(xiàn)電融合。而趙志強提出的芯片所集成的微電極數(shù)量較少，不能實現(xiàn)高通量融合；微電極所產(chǎn)生的電場強度和電場梯度也比較弱，難以實現(xiàn)細胞的精確控制；所選擇的加工材料的抗腐蝕、抗氧化能力也較差；同時，由于未集成進出樣裝置，操作也較為不便。日本研究者提出利用微孔的方式實現(xiàn)兩個通道的分隔，進而實現(xiàn)不同細胞的獨立進樣完成細胞配對，但該方法對微孔的定位要求很高，無法進行大規(guī)模應用，同時，該方法依然采用距離較大的平板電極實現(xiàn)電融合，工作電壓高。(國內外相關專利如下200610(^4121. X，2006年，重慶大學，趙志強等；CN1482234，2003年，中國科學院上海技術物理研究所，張濤等；CN86210174， 1995 年，遼寧腫瘤研究所，梁偉；43269；34，April 27，1982，Pohl ；441972, April 10， 1982，Pohl ；4578168, March 25，1986，Hofman ；4695547, Sep 22，1987，Hillard ； 4699881，Oct 13，1987，Matschke, et al. ；5007995，Apr 16，1991，Takahizuki。)
重慶大學胡寧等研究人員在上述芯片的基礎上也提出了包括三維微電極陣列、柔性微電極陣列、基于微小室結構的細胞電融合芯片等結構，解決了一些問題；本發(fā)明的專利是對上述研究的進一步深入探索。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種基于微孔陣列薄膜的高通量細胞電融合裝置，該細胞電融合裝置借助于微孔改變電場分布這一特性，實現(xiàn)兩樣品池內部細胞吸附于微孔上，形成一對一的細胞配對，同時，還借助于微孔區(qū)域電場最強這一特點，利用電壓調節(jié)使得微孔內部的細胞連接處獲得適宜的融合電場強度，達到高效融合，并避免多細胞融合的發(fā)生。本發(fā)明利用微加工技術加工集成了大量微孔的微孔陣列薄膜，以提高裝置整體的融合通量；結合樣品池形成兩個獨立的空腔，進而可以分別加載不同的細胞，解決不同細胞配對的問題；同時，利用微孔改變兩電極板之間電場分布這一特點，在微孔中央?yún)^(qū)域為整個通道中電場最高區(qū)域，進而可以利用介電電泳效應操控樣品池中的細胞向高電場區(qū)運動， 在微孔上吸附，又因為微孔的直徑小于細胞的直徑，故細胞無法穿過微孔，最終在微孔兩側都吸附一個細胞并在微孔中央形成細胞配對與連接；此外，由于形成細胞連接后，微孔中央?yún)^(qū)域仍然是電場最高區(qū)，在此區(qū)域發(fā)生細胞電融合幾率最大，進而可通過調節(jié)電壓控制細胞電融合，避免多細胞融合的發(fā)生。本發(fā)明所述的一種基于微孔陣列薄膜的高通量細胞電融合裝置，包括微孔陣列薄膜、分別與微孔陣列薄膜兩面貼合的兩個樣品池、設在微孔陣列薄膜和兩個樣品池上面的蓋片，其特征是所述微孔陣列薄膜的中部設有微孔陣列、四角部分別設有一第一定位孔， 兩塊電極板的下端分別穿過蓋片插入兩個樣品池內。進一步，所述兩個樣品池的形狀及結構相同并左右對稱，兩個樣品池內分別設有一用于加注細胞緩沖液的空腔和與空腔聯(lián)通的凹槽，在兩個樣品池上面的角部分別設有兩CN 102321536 A
說明書
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個第二定位孔；在兩個樣品池相對側面的四個角部分別設有一個第三定位孔，這四個第三定位孔與微孔陣列薄膜上的四個第一定位孔一一對應，以實現(xiàn)兩個樣品池和微孔陣列薄膜在水平方向上的定位連接。進一步，所述蓋片的四個角部分別設有一個第四定位孔，這四個第四定位孔與兩個樣品池上面的四個第二定位孔一一對應，以實現(xiàn)兩個樣品池與蓋片在豎直方向上的定位連接；在蓋片上還設有兩個相互對稱的矩形槽口和兩個相互對稱的進/出樣孔，兩個矩形槽口分別與兩個樣品池內的凹槽一一對應，兩個進/出樣孔分別與兩個樣品池內的空腔
--對應。進一步，所述兩塊電極板的下端分別穿過蓋片上的兩個矩形槽口并分別與兩個樣品池內的兩個凹槽配合。進一步，所述微孔陣列薄膜的厚度為3_5μπι，長度為5cm，寬度為km，設在中部的，微孔陣列的區(qū)域面積為3.2cm K 2. 8cm，區(qū)域面積上集成有800 X 700的微孔；微孔之間水平和垂直方向上間距均為 40 μ m，微孔的直徑小于待融合的細胞的最小直徑，以保證細胞不能穿過微孔到對面的樣品池中，達到不同細胞配對控制的目的。微孔陣列薄膜的材料應選用生物相容性好、電絕緣性、韌度好的有機物材料，光敏多聚物材料最適合，可利用軟光刻技術實現(xiàn)微孔陣列的高精度快速加工。樣品池在縱向剖面上與微孔陣列薄膜大小一致，長度為5cm，寬度為km，厚度為 2cm ；樣品池內有一用于加注細胞緩沖液的空腔，空腔在縱向剖面尺寸應大于微孔陣列面積，長寬為3. 3cmX 2. 5cm,空腔的厚度為0. 5_2mm ；同時，樣品池內還有一個用于放置電極板的凹槽；凹槽縱向剖面尺寸為3. 5cmX3cm，厚度為0. 5mm ；樣品池的材料應選擇具有良好生物相容性、電絕緣性、易加工、低成本的材料，如PMMA等材料，可通過機械加工成型。蓋片的厚度為2_3mm，面積為兩個樣品池和一層微孔陣列薄膜之和(5cmX km);蓋片上有兩個進/出樣孔，與用于加注細胞緩沖液的空腔對應，孔徑為Imm;有兩個用于露出電極板的矩形框，其尺寸為3. 5cmK 0. 5mm ；蓋片材料可選擇與樣品池一致的具有良好生物相容性、電絕緣性、易加工、低成本的材料，如PMMA等材料，可通過機械加工成型。電極板面積為3. 5cm X如m，厚度為0. 5mm，插入并固定于樣品池內凹槽中，加載蓋片電極板上端還將露出蓋片0. 7-0. 8cm，可用于外界電信號與電極板的連接，便于加載電信號于裝置內；電極板的材料應選擇具有良好電導特性、生物相容性、抗氧化、抗腐蝕的金、 鉬、鈦等材料。本發(fā)明提出了一種基于微孔陣列薄膜的高通量細胞電融合裝置。所述的基于微孔陣列薄膜的高通量細胞電融合裝置由樣品池、微孔陣列薄膜、蓋片和電極板組成。微孔陣列薄膜置于兩個樣品池之間，三者通過螺栓緊密固定，并形成由微孔陣列薄膜隔離的兩個樣品池；電極板置于樣品池的凹槽中，外部電信號可加載于電極板露出蓋片的區(qū)域上，進而加載信號于兩樣品池中；蓋片上有與兩樣品池對應的進/出樣孔，以及與電極板對應的矩形孔，實現(xiàn)樣品池的整體密封，進/出樣和信號的加載。本發(fā)明通過微孔陣列薄膜將兩樣品池隔離，薄膜上的微孔改變了垂直方向上電場的分布，使得微孔內部區(qū)域的電場強度最高，進而可以利用介電電泳效應實現(xiàn)細胞向高電場區(qū)(微孔)運動，由于微孔的直徑小于細胞的直徑，兩樣品池中的細胞均不能穿過微孔，僅能在微孔側面上形成細胞吸附，并在微孔中央與另一側面所吸附的細胞形成細胞連接，進而達到細胞配對的目的；同時，由于細胞連接處處于微孔內部，進而細胞連接處電場強度也為最高，可實現(xiàn)微孔處配對細胞發(fā)生融合，而其他區(qū)域細胞不融合，提高融合效率，避免發(fā)生多細胞融合。此外，兩電極板之間間距較短，有助于在低電壓條件下實現(xiàn)電融合，而薄膜上大量集成的微孔可保證裝置的高通量。此外，裝置各部分的材料均具有良好生物相容性及抗腐蝕性能，這保證了裝置的可靠性，也提高了細胞融合的安全性。該方法可廣泛應用于遺傳學、動植物遠緣雜交育種、發(fā)育生物學、藥物篩選、單克隆抗體制備、哺乳動物克隆等領域。本發(fā)明具有如下優(yōu)點
(1)由于利用微加工技術加工集成了大量微孔的微孔陣列薄膜，利用微孔結構改變兩電極板之間電場分布，使得微孔中央?yún)^(qū)域為整個通道中電場最高區(qū)域，一方面可利用介電電泳效應操控樣品池中的細胞向高電場區(qū)運動，在微孔上吸附，又因為微孔的直徑小于細胞的直徑，故細胞無法穿過微孔，最終在微孔兩側都吸附一個細胞并在微孔中央形成細胞配對與連接；另一方面，由于形成細胞連接后，微孔中央?yún)^(qū)域仍然是電場最高區(qū)，在此區(qū)域發(fā)生細胞電融合幾率最大，進而可通過調節(jié)電壓控制細胞電融合，避免多細胞融合的發(fā)生， 具有重要應用價值。(2)具有良好的生物相容性及抗腐蝕性能，這保證了裝置的可靠性，也提高了細胞融合的安全性。同時，微孔陣列薄膜上集成了大量的微孔陣列，可實現(xiàn)大量細胞的同時融合，融合效率高，融合通量高。(3)加工過程簡便，成本低廉，有助于細胞電融合技術的推廣應用。


圖1是本發(fā)明的總體示意圖2是本發(fā)明的功能模塊組裝示意圖； 圖3是微孔陣列薄膜的示意圖； 圖4是樣品池的示意圖； 圖5是蓋片的示意圖； 圖6-9是本發(fā)明的工作原理圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明。參見圖1、圖2、圖3、圖4和圖5所示的基于微孔陣列薄膜的高通量細胞電融合裝置，包括微孔陣列薄膜1、分別與微孔陣列薄膜1兩面貼合的兩個樣品池2、設在微孔陣列薄膜和兩個樣品池上面的蓋片3 ；
所述微孔陣列薄膜1的中部設有微孔5陣列、四角部分別設有一第一定位孔6，兩塊電極板4的下端分別穿過蓋片3插入兩個樣品池2內。進一步，所述兩個樣品池2的形狀及結構相同并左右對稱，兩個樣品池2內分別設有一用于加注細胞緩沖液的空腔7和與空腔聯(lián)通的凹槽8，在兩個樣品池2上面的角部分別設有兩個第二定位孔9 ；在兩個樣品池相對側面的四個角部分別設有一個第三定位孔10， 這四個第三定位孔與微孔陣列薄膜1上的四個第一定位孔6 —一對應，以實現(xiàn)兩個樣品池和微孔陣列薄膜在水平方向上的定位連接。進一步，所述蓋片3的四個角部分別設有一個第四定位孔13，這四個第四定位孔與兩個樣品池上面的四個第二定位孔9 一一對應，以實現(xiàn)兩個樣品池與蓋片在豎直方向上的定位連接；在蓋片3上還設有兩個相互對稱的矩形槽口 11和兩個相互對稱的進/出樣孔 12，兩個矩形槽口 11分別與兩個樣品池2內的凹槽8 一一對應，兩個進/出樣孔12分別與兩個樣品池2內的空腔7 —一對應。進一步，所述兩塊電極板4的下端分別穿過蓋片3上的兩個矩形槽口 11并分別與兩個樣品池2內的兩個凹槽8配合。進一步，所述微孔陣列薄膜1的厚度為3-5 μ m，長度為5cm，寬度為km，設在中部的，微孔5陣列的區(qū)域面積為3. 2cmX 2. 8cm,區(qū)域面積上集成有800 X 700的微孔5 ；微孔 5之間水平和垂直方向上間距均為40 μ m,微孔5的直徑小于待融合的細胞的最小直徑?；谖⒖钻嚵薪Y構的細胞電融合裝置，其細胞電融合過程實施過程如下 參見圖1、圖6、圖7、圖8和圖9，細胞懸浮液A (內為A細胞)和細胞懸浮液B (內為B
細胞)分別經(jīng)過蓋片3上的進樣孔12注入樣品池2的內部空腔7中。因為微孔陣列薄膜1 上的微孔5直徑小于A、B細胞的最小直徑，故兩種細胞均不能通過微孔5進入對方的空腔 7中；加載正弦排隊信號于兩電極板4上，由于微孔5改變了兩電極板4間的電場分布，微孔5內部的電場強度最高，在介電電泳效應的作用下，細胞將向高電場區(qū)運動，并在微孔5 兩側各自吸附固定，由于微孔5直徑小，厚度薄(3-5 μ m)，A、B細胞將在微孔5中央形成一對一的細胞連接。加載脈沖穿孔信號于電極板4上，空腔7內部將產(chǎn)生高強度電場以實現(xiàn)細胞融合，同樣因為微孔5內部電場分布的特異性，故僅能在微孔5中央的細胞連接處產(chǎn)生足夠強度的膜電壓差，進而實現(xiàn)微孔5中央連接處細胞的一對一融合，避免了多細胞融合的發(fā)生。完成融合后，加注PBS緩沖液于樣品池2內，微孔5內的融合子將在負向介電電泳效應下從微孔5中脫離，進而可通過出樣孔12收集，進而完成細胞電融合過程。微孔陣列薄膜，其加工流程如下
(1)選擇硅片作為基底；
(2)通過蒸發(fā)沉積或濺射工藝在硅片表面形成一層厚度為500nm的鋁膜(犧牲層)；
(3)旋涂一層厚度為5-8微米的聚酰亞胺膠于鋁膜表面；
(4)利用光刻形成微孔陣列圖形；
(5)置于350°C環(huán)境下40分鐘固化形成微孔陣列薄膜；
(6)置于稀HCl溶液中腐蝕鋁膜(犧牲層)，釋放微孔陣列薄膜。
權利要求
1.基于微孔陣列薄膜的高通量細胞電融合裝置，包括微孔陣列薄膜(1)、分別與微孔陣列薄膜兩面貼合的兩個樣品池(2)、設在微孔陣列薄膜和兩個樣品池上面的蓋片(3)，其特征是所述微孔陣列薄膜(1)的中部設有微孔(5)陣列、四角部分別設有一第一定位孔 (6)，兩塊電極板(4)的下端分別穿過蓋片(3)插入兩個樣品池(2)內。
2.根據(jù)權利要求1所述的基于微孔陣列薄膜的高通量細胞電融合裝置，其特征是所述兩個樣品池(2)的形狀及結構相同并左右對稱，兩個樣品池內分別設有一用于加注細胞緩沖液的空腔(7)和與空腔聯(lián)通的凹槽(8)，在兩個樣品池(2)上面的角部分別設有兩個第二定位孔(9);在兩個樣品池相對側面的四個角部分別設有一個第三定位孔(10)，這四個第三定位孔與微孔陣列薄膜上的四個第一定位孔(6) —一對應，以實現(xiàn)兩個樣品池和微孔陣列薄膜在水平方向上的定位連接。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的基于微孔陣列薄膜的高通量細胞電融合裝置，其特征是 所述蓋片(3)的四個角部分別設有一個第四定位孔(13)，這四個第四定位孔與兩個樣品池上面的四個第二定位孔(9)一一對應，以實現(xiàn)兩個樣品池與蓋片在豎直方向上的定位連接； 在蓋片(3)上還設有兩個相互對稱的矩形槽口( 11)和兩個相互對稱的進/出樣孔(12)，兩個矩形槽口分別與兩個樣品池(2)內的凹槽(8)—一對應，兩個進/出樣孔分別與兩個樣品池(2)內的空腔(7)—一對應。
4.根據(jù)權利要求1、2或3所述的基于微孔陣列薄膜的高通量細胞電融合裝置，其特征是所述兩塊電極板(4)的下端分別穿過蓋片(3)上的兩個矩形槽口(11)并分別與兩個樣品池(2)內的兩個凹槽(8)配合。
5.根據(jù)權利要求1、2、3或4所述的基于微孔陣列薄膜的高通量細胞電融合裝置，其特征在是所述微孔陣列薄膜(1)的厚度為3-5 μ m,長度為5cm，寬度為km，設在中部的，微孔 (5)陣列的區(qū)域面積為3. 2cmχ 2. 8cm，區(qū)域面積上集成有800 X 700的微孔(5)；微孔(5) 之間水平和垂直方向上間距均為40μπι，微孔(5)的直徑小于待融合的細胞的最小直徑。
全文摘要
本發(fā)明公開一種基于微孔陣列薄膜的高通量細胞電融合裝置，包括微孔陣列薄膜、分別與微孔陣列薄膜兩面貼合的兩個樣品池、設在微孔陣列薄膜和兩個樣品池上面的蓋片；所述微孔陣列薄膜的中部設有微孔陣列，兩電極板的下端分別穿過蓋片插入兩個樣品池內。由于利用微加工技術加工集成了大量微孔的微孔陣列薄膜，利用微孔結構改變兩電極板之間電場分布，使得微孔中央?yún)^(qū)域為電場最高區(qū)域，可利用介電電泳效應操控樣品池中的細胞向高電場區(qū)運動，在微孔兩側都吸附一個細胞并在微孔中央形成細胞配對與連接；微孔中央電場強度最高，融合幾率最大，避免了多細胞融合發(fā)生；具有良好的生物相容性及抗腐蝕性能，保證了裝置的可靠性，也提高了細胞融合的安全性。
文檔編號C12M1/42GK102321536SQ20111029674
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權日2011年9月30日
發(fā)明者朱祥佑, 胡寧, 錢詩智 申請人:嶺南大學校產(chǎn)學協(xié)力團