專利名稱：一種新的生產(chǎn)細菌纖維素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵工程領域，具體地說，是一種新的生產(chǎn)細菌纖維素的方法。
背景技術：
細菌纖維素(Bacterial cellulose，BC)又被稱為微生物纖維素，是由含糖基質(zhì)中的某些微生物在生長過程中產(chǎn)生并分泌到基質(zhì)中的一種細長的束狀纖維。細菌纖維素具有良好的持水性和凝膠特性，可作為增稠劑、固體食品成型劑、分散劑和結(jié)合劑等應用于食品工業(yè)中；它還具有很好的生物相容性、透氣性和良好的理化性能，可作為一種具有獨特優(yōu)勢的新型醫(yī)學生物材料；細菌纖維素膜的純度、結(jié)晶度、聚合度及分子度取向非常高，具有優(yōu)良的力學性能，這使其可在造紙、聲學器材以及建材領域得以應用；此外，細菌纖維素還可以應用于酶工程、環(huán)境保護、納米復合材料、燃料電池及木質(zhì)文物修復等許多領域，具備廣泛的應用價值。近年來，國外如日本、美國已經(jīng)開始細菌纖維素規(guī)?；a(chǎn)并開發(fā)其商業(yè)化應用，但國內(nèi)利用微生物合成細菌纖維素的技術還不是十分成熟，仍停留在淺盤式靜態(tài)發(fā)酵上。淺盤靜態(tài)發(fā)酵法是生產(chǎn)細菌纖維素最簡單、傳統(tǒng)的方法，也是目前細菌纖維素生產(chǎn)最常用的方法。該生產(chǎn)方法下，氧氣分布不均且傳遞效果不佳，細菌纖維素只能在氣液表面生成，其最終產(chǎn)量的高低取決于培養(yǎng)基表面積的大小。當培養(yǎng)基表面積一定時，培養(yǎng)基體積增加，其深度亦隨之增加，培養(yǎng)基中溶解氧濃度減小，菌體由于供氧不足而生長受到抑制，進而限制了纖維素的產(chǎn)量；培養(yǎng)基太少，由于營養(yǎng)物質(zhì)有限而限制了菌體的生長和繁殖。據(jù)估計，要達到一天生產(chǎn)一噸干重的細菌纖維素，需要2000平方英尺的氣液表面積。 因此，傳統(tǒng)靜態(tài)發(fā)酵法的占地面積大，生產(chǎn)周期長，勞動強度高，生產(chǎn)效率低，且容易污染雜菌，不適合工業(yè)化的生產(chǎn)。與淺盤靜態(tài)發(fā)酵法相對應的是傳統(tǒng)動態(tài)發(fā)酵法，傳統(tǒng)動態(tài)發(fā)酵包括搖瓶振蕩發(fā)酵，機械攪拌發(fā)酵等，動態(tài)發(fā)酵法有效解決了淺盤靜態(tài)發(fā)酵法供養(yǎng)不足問題，但在提高氧的傳遞效率的同時也加大了對菌體的剪切力，即在振蕩，攪拌過程中外力對菌種的撞擊，特別對某些對剪切力敏感的菌種如本醋桿菌影響很大。因此，傳統(tǒng)動態(tài)發(fā)酵法不適合細菌纖維素的主要生產(chǎn)菌種——木醋桿菌低剪切力的生理要求，不能用于細菌纖維素的規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的生產(chǎn)細菌纖維素的方法，解決淺盤靜態(tài)發(fā)酵法菌體由于供氧不足而生長受到抑制問題，解決傳統(tǒng)動態(tài)發(fā)酵在提高氧的傳遞效率的同時加大了對菌體剪切力，對某些剪切力敏感菌種由于低剪切力的生理要求，不能用于細菌纖維素規(guī)模生產(chǎn)的問題。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明一種新的生產(chǎn)細菌纖維素的方法，采用淋澆發(fā)酵法，以生產(chǎn)食醋的淋澆發(fā)酵塔為生產(chǎn)設備，塔底盛接種有三菌種一木醋桿菌、醋酸菌和安琪酵母菌種子液的培養(yǎng)基發(fā)酵液，培養(yǎng)基為陳米糖化液及酒精發(fā)酵醪的混合液，陳米糖化液的總糖含量在160-180g/L之間，酒精發(fā)酵醪乙醇含量在7-9%v/v，陳米糖化液與酒精發(fā)酵醪混合體積比為3 :5，塔中部為填料層，填玉米芯和谷殼，作菌體附著載體，用泵將塔底三菌種培養(yǎng)基發(fā)酵液提升到塔頂，噴淋于填料層，通過填料層又回到塔底， 如此循環(huán)淋澆，淋澆發(fā)酵溫度^_32°C，淋澆頻率1次/4h，每次淋澆時間lmin，12h為一個控制周期，發(fā)酵時間總長144h，停止淋澆發(fā)酵后，將玉米芯上的細菌纖維素膜撕下，經(jīng)洗滌， 烘干而得產(chǎn)品。填料層玉米芯與谷殼的重量比7. 5:5，玉米芯夾在谷殼中間，填料層厚度為淋澆塔容積高度的1/4-1/3，裝塔前玉米芯和谷殼經(jīng)潤濕和121°C、1小時滅菌處理備用。培養(yǎng)基中陳米糖化液是指陳米經(jīng)糊化、液化、糖化和過濾，然后1 :1用水稀釋而得到的總糖含量為160-180g/L的糖化液；酒精發(fā)酵醪是將陳米糖化液經(jīng)酵母發(fā)酵后過濾，用水調(diào)整得到的乙醇含量為7-9%v/v的酒精發(fā)酵醪，本發(fā)明所用的陳米糖化液和酒精發(fā)酵醪由貴陽市味莼園食品股份有限公司提供。本發(fā)明所用陳米糖化液和酒精發(fā)酵醪各主要成分含量如下陳米糖化液總糖含量160-180g/L、總酸含量0. 2-0. 3g/kg ；酒精發(fā)酵醪總糖含量 0. 7-0. 9g/L、總酸含量 3. 2-3. 5g/kg、乙醇含量 7-9%v/v。所述的種子液是將試管斜面醋酸菌和木醋桿菌接入一環(huán)于各自的試管基礎培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)20小時以作為醋酸菌和木醋桿菌的種子液，安琪酵母菌種子液是取培養(yǎng)基發(fā)酵液重千分之一的安琪釀酒高活性干酵母，用10倍酵母用量的35-40攝氏度的m的糖水活化15-20分鐘，然后溫度降至30-34攝氏度，活化2小時即得安琪酵母種子液。所述培養(yǎng)基發(fā)酵液是將陳米糖化液和酒精發(fā)酵醪按體積比3 5混合，混合液中接種三菌種種子液，接種的順序及量分別為接種木醋桿菌種子液8. 2%V/Vjh后接種醋酸菌種子液8. 2%v/v和安琪酵母菌種子液2. 1%ν/ν，得培養(yǎng)基發(fā)酵液，靜置2小時開始由泵提升淋澆，每隔4小時淋澆一次，每次淋澆時間lmin，從接種木醋桿菌種子液開始算時間，12小時為一周期，第一周期不限氧，第二周期開始，每周期限氧4小時，限氧期間不淋澆，發(fā)酵時間總長144h，所謂限氧是封閉淋澆塔的通氣孔4。填料層的材料可以用疏松透氣的材料包括刨木花、玉米殼、椰子殼及食品包裝用塑料及泡沫材料代替。試驗證明，用塔底盛接種有兩菌種一木醋桿菌和醋酸菌種子液的培養(yǎng)基發(fā)酵液代替接種有三菌種一木醋桿菌、醋酸菌和安琪酵母菌種子液的培養(yǎng)基發(fā)酵液是可行的，但細菌纖維素的產(chǎn)量低于三菌種發(fā)酵。用泵將塔底的培養(yǎng)基發(fā)酵液提升至塔頂后噴淋于填料層，如此循環(huán)淋澆，一方面為吸附于填料之上的菌種提供充足的營養(yǎng)，另一方面在降低剪切力的同時提高發(fā)酵液中溶氧含量，促進木醋桿菌的生長及細菌纖維素的產(chǎn)生。將醋酸菌、酵母菌和木醋桿菌進行混合培養(yǎng)，為木醋桿菌提供乙醇、乙酸等增效因子，促進細菌纖維素的合成，從而提高細菌纖維
素的產(chǎn)量。發(fā)明人根據(jù)生產(chǎn)菌種的最適生長、產(chǎn)纖維素溫度以及實際生產(chǎn)條件確定淋澆發(fā)酵法生產(chǎn)細菌纖維素的發(fā)酵溫度控制在^_32°C。填充層填充方式為玉米芯自然堆放，而谷殼于玉米芯底部和上部分兩層平鋪；發(fā)明人還以發(fā)酵液中溶氧濃度作為指標，根據(jù)淋澆發(fā)酵過程中發(fā)酵液菌體濃度、總糖、總酸含量等理化指標得出淋澆發(fā)酵法生產(chǎn)細菌纖維素的發(fā)酵周期為144h(6天)。本發(fā)明最佳培養(yǎng)基發(fā)酵液總糖含量為172. ^g/L;酒精發(fā)酵醪乙醇含量為 8. 24%v/v,陳米糖化液與酒精發(fā)酵醪體積比3 5混合，混合液中接種三菌種一木醋桿菌 8. 2% (v/v),6h后接種醋酸菌8. 2% (ν/ν)和酵母菌2. 1% (ν/ν)，靜置2h后開始淋澆，每隔 4小時淋澆一次，淋澆時間lmin，從接種木醋桿菌開始算時間，12小時為一周期，第一周期不限氧，第二周期開始，每周期限氧4小時，限氧期間不淋澆，發(fā)酵時間總長144h，可獲得較高的細菌纖維素產(chǎn)量。本發(fā)明一種新的生產(chǎn)細菌纖維素的方法是淋澆發(fā)酵法，介于靜態(tài)和動態(tài)發(fā)酵之間的細菌纖維素生產(chǎn)方法，很好地適應了木醋桿菌高溶氧，低剪切力的嚴格的生理特點，而且還有投資小，生產(chǎn)周期短，耗電低，操作簡單，占地面積小等諸多優(yōu)點，有利于提高細菌纖維素的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，值得一提的是，淋澆發(fā)酵生產(chǎn)的細菌纖維素，其結(jié)構(gòu)性質(zhì)上的優(yōu)越性將會進一步拓寬它的應用范圍。淋澆發(fā)酵法對細菌纖維素的工業(yè)化生產(chǎn)和商業(yè)化應用有極大的意義。本發(fā)明解決了現(xiàn)有細菌纖維素生產(chǎn)方法難以同時滿足木醋桿菌高溶氧量和低剪切力要求的矛盾，提高了細菌纖維素的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。


圖1，淋澆發(fā)酵法生產(chǎn)細菌纖維素所利用的食醋淋澆發(fā)酵塔示意圖，圖中1. T形澆罐器、2.填料層、3.溫度計、4.通氣孔、5.液位罐、6.球形閥、7.過濾器、8.泵。圖2，實施例1雙菌體淋澆發(fā)酵與靜態(tài)單菌發(fā)酵細菌纖維素產(chǎn)量的比較圖。圖3，實施例2三菌種淋澆發(fā)酵細菌纖維素產(chǎn)量與靜態(tài)單菌發(fā)酵和雙菌淋澆發(fā)酵細菌纖維素產(chǎn)量比較圖。
具體實施例方式實施例1 總糖含量171. ^g/L糖化液與乙醇含量為8. 24%v/v的酒精發(fā)酵醪按 3 5 (ν ν)的比例混合后，準確量取8L上述混合液加入經(jīng)沸水消毒30min的淋澆發(fā)酵塔底， 將121°C下滅菌的玉米芯7. 5kg和谷殼5kg趁熱轉(zhuǎn)移至淋澆發(fā)酵塔假底之上的填料層(其中玉米芯自然堆放，谷殼于玉米芯底部和頂部分兩層平鋪)，蓋好頂蓋后夾套通冷卻水強制冷卻，當塔內(nèi)溫度降至35°C后進一步自然冷卻至30°C，然后接種10%(v/v)木醋桿菌和3% 醋酸菌種子液，靜置培養(yǎng)1 后每隔4h淋澆一次，每次淋澆lmin，直至發(fā)酵結(jié)束(144h)， 整個過程采用33°C左右的溫水進行控溫，使塔內(nèi)溫度維持在-32°C。結(jié)果表明，穩(wěn)定生長期內(nèi)菌體濃度在靜態(tài)發(fā)酵的1.35倍以上，發(fā)酵液中殘?zhí)呛?33.8g/L)比靜態(tài)發(fā)酵 (43. 45g/L)低 22. 21%，總酸含量(19. 80g/kg)比靜態(tài)發(fā)酵(17. 88g/kg)高 10. 74%，細菌纖維素最終產(chǎn)量為4. 792g/L，是靜態(tài)發(fā)酵法(2. 667g/L)的1. 8倍。雙菌體淋澆發(fā)酵與靜態(tài)單菌發(fā)酵細菌纖維素產(chǎn)量的比較圖如附圖2。實施例2 總糖含量171. 28g/L糖化液與乙醇含量為8. 24% (ν/ν)的酒精發(fā)酵醪按3:5(V:V)，準確量取8L上述混合液加入經(jīng)沸水消毒30min的淋澆發(fā)酵塔底部，將121°C下滅菌的玉米芯7. 5kg和谷殼5kg趁熱轉(zhuǎn)移至淋澆發(fā)酵塔底之上的填料層(其中玉米芯自然堆放，谷殼于玉米芯底部和頂部分兩層平鋪)，蓋好頂蓋后夾套通冷卻水強制冷卻，當塔內(nèi)溫度降至35°C后進一步自然冷卻至30°C，然后接種8. 2%(ν/ν)木醋桿菌、1. 9%(ν/ν)醋酸菌、2. 1%(ν/ν)酵母菌種子液，以1 為一個控制周期，第一周期不進行限氧，從第二周期開始淋澆頻率為2次/1 (其中限氧4h)，每次淋澆lmin，直至發(fā)酵結(jié)束(144h)，整個過程采用33°C左右的溫水進行控溫，使塔內(nèi)溫度維持在_32°C。結(jié)果表明，細菌纖維素的產(chǎn)量為7. 810g/L,比雙菌淋澆發(fā)酵(4. 792g/L)的提高了 63%，是最初的單菌靜態(tài)發(fā)酵(2. 121g/ L)的3. 68倍。三菌種淋澆發(fā)酵細菌纖維素產(chǎn)量與靜態(tài)單菌發(fā)酵和雙菌淋澆發(fā)酵細菌纖維素產(chǎn)量比較圖為附圖3。實施例3:總糖含量165g/L糖化液與乙醇含量為7. (ν/ν)的酒精發(fā)酵醪按 3:5(V:V)，準確量取8L上述混合液加入經(jīng)沸水消毒30min的淋澆發(fā)酵塔中，將121°C下滅菌的玉米芯7. 5kg和谷殼5kg趁熱轉(zhuǎn)移至淋澆發(fā)酵塔假底之上(其中玉米芯自然堆放，谷殼于玉米芯底部和頂部分兩層平鋪)，蓋好頂蓋后夾套通冷卻水強制冷卻，當塔內(nèi)溫度降至 35°C后進一步自然冷卻至30°C，然后接種1 P/ov/v木醋桿菌，以1 為一個控制周期，第一周期不進行限氧，從第二周期開始淋澆頻率為2次/12h (其中限氧4h)，每次淋澆lmin，直至發(fā)酵結(jié)束(144h)，整個過程采用33°C左右的溫水進行控溫，使塔內(nèi)溫度維持在-32°C。 結(jié)果表明，細菌纖維素的產(chǎn)量為7. 130g/L，低于實施例2的細菌纖維素的產(chǎn)量(7. 810g/L)。實施例4:總糖含量178g/L糖化液與乙醇含量為8. 8% (ν/ν)的酒精發(fā)酵醪按 3:5(V:V)，準確量取8L上述混合液加入經(jīng)沸水消毒30min的淋澆發(fā)酵塔中，將121°C下滅菌的玉米芯7. 5kg和谷殼5kg趁熱轉(zhuǎn)移至淋澆發(fā)酵塔假底之上(其中玉米芯自然堆放，谷殼于玉米芯底部和頂部分兩層平鋪)，蓋好頂蓋后夾套通冷卻水強制冷卻，當塔內(nèi)溫度降至 35°C后進一步自然冷卻至30°C，然后接種11%ν/ν木醋桿菌，以1 為一個控制周期，第一周期不進行限氧，從第二周期開始淋澆頻率為2次/12h (其中限氧4h)，每次淋澆lmin，直至發(fā)酵結(jié)束(144h)，整個過程采用33°C左右的溫水進行控溫，使塔內(nèi)溫度維持在-32°C。 結(jié)果表明，細菌纖維素的產(chǎn)量為6. 920g/L，低于實施例2的細菌纖維素的產(chǎn)量(7.810g/L)。
權(quán)利要求
1.一種新的生產(chǎn)細菌纖維素的方法，其特征是采用淋澆發(fā)酵法，以生產(chǎn)食醋的淋澆發(fā)酵塔為生產(chǎn)設備，塔底盛接種有三菌種一木醋桿菌、醋酸菌和安琪酵母菌種子液的培養(yǎng)基發(fā)酵液，培養(yǎng)基為陳米糖化液及酒精發(fā)酵醪的混合液，陳米糖化液的總糖含量在160-180g/ L之間，酒精發(fā)酵醪乙醇含量在7-9%v/v，陳米糖化液與酒精發(fā)酵醪混合體積比為3 :5，塔中部為填料層，填玉米芯和谷殼，作菌體附著載體，用泵將塔底三菌種培養(yǎng)基發(fā)酵液提升到塔頂，噴淋于填料層，通過填料層又回到塔底，如此循環(huán)淋澆，淋澆發(fā)酵溫度，淋澆頻率1次/4h，每次淋澆時間lmin，12h為一個控制周期，發(fā)酵時間總長144h，停止淋澆發(fā)酵后，將玉米芯上的細菌纖維素膜撕下，經(jīng)洗滌，烘干而得產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新的生產(chǎn)細菌纖維素的方法，其特征是填料層玉米芯與谷殼的重量比7.5 :5，玉米芯夾在谷殼中間，填料層厚度為淋澆塔容積高度的1/4-1/3，裝塔前玉米芯和谷殼經(jīng)潤濕和121°C、1小時滅菌處理備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新的生產(chǎn)細菌纖維素的方法，其特征是培養(yǎng)基中陳米糖化液是指陳米經(jīng)糊化、液化、糖化和過濾，然后1:1用水稀釋而得到的總糖含量為 160-180g/L的糖化液；酒精發(fā)酵醪是將陳米糖化液經(jīng)酵母發(fā)酵后過濾，用水調(diào)整得到的乙醇含量為7-9%v/v的酒精發(fā)酵醪；本發(fā)明所用陳米糖化液和酒精發(fā)酵醪各主要成分含量如下陳米糖化液總糖含量160-180g/L、總酸含量0. 2-0. 3g/kg ；酒精發(fā)酵醪總糖含量0. 7-0. 9g/L、總酸含量 3. 2-3. 5g/kg、乙醇含量 7-9%v/v。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種新的生產(chǎn)細菌纖維素的方法，其特征是所述的種子液是將試管斜面醋酸菌和木醋桿菌接入一環(huán)于各自的試管基礎培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)20 小時以作為醋酸菌和木醋桿菌的種子液，安琪酵母菌種子液是取培養(yǎng)基發(fā)酵液重千分之一的安琪釀酒高活性干酵母，用10倍酵母用量的35-40攝氏度的21的糖水活化15-20分鐘， 然后溫度降至30-34攝氏度，活化2小時即得安琪酵母種子液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種新的生產(chǎn)細菌纖維素的方法，其特征是培養(yǎng)基發(fā)酵液是將陳米糖化液和酒精發(fā)酵醪按體積比3 5混合，混合液中接種三菌種種子液，接種順序和接種量分別為接種木醋桿菌種子液8. 2%V/VJh后接種醋酸菌種子液8. 2%v/v和安琪酵母菌種子液2. P/ov/v,得培養(yǎng)基發(fā)酵液，靜置2小時開始由泵提升淋澆，每隔4小時淋澆一次，每次淋澆時間lmin，從接種木醋桿菌種子液開始算時間，12小時為一周期，第一周期不限氧，第二周期開始，每周期限氧4小時，限氧期間不淋澆，發(fā)酵時間總長144h。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種新的生產(chǎn)細菌纖維素的方法，其特征是本發(fā)明陳米糖化液總糖含量為171. 28g/L ；酒精發(fā)酵醪乙醇含量為8. 24%v/v,陳米糖化液與酒精發(fā)酵醪體積比3 5混合，混合液中接種三菌種一木醋桿菌8. 2% (v/v),6h后接種醋酸菌8. 2% (ν/ν) 和酵母菌2. 1% (ν/ν)，靜置池后開始淋澆，每隔4小時淋澆一次，淋澆時間lmin，從接種木醋桿菌開始算時間，12小時為一周期，第一周期不限氧，第二周期開始，每周期限氧4小時， 限氧期間不淋澆，發(fā)酵時間總長144h，可獲得較高的細菌纖維素產(chǎn)量。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新的生產(chǎn)細菌纖維素的方法，其特征是填料層的材料可以用疏松透氣的材料包括刨木花、玉米殼、椰子殼及食品包裝用塑料及泡沫材料代替。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種新的生產(chǎn)細菌纖維素的方法，其特征是用塔底盛接種有兩菌種一木醋桿菌和醋酸菌種子液的培養(yǎng)基發(fā)酵液代替接種有三菌種一木醋桿菌、醋酸菌和安琪酵母菌種子液的培養(yǎng)基發(fā)酵液。
全文摘要
一種新的生產(chǎn)細菌纖維素的方法，采用淋澆發(fā)酵法，以生產(chǎn)食醋的淋澆發(fā)酵塔為生產(chǎn)設備，塔底盛接種有三菌種—木醋桿菌、醋酸菌和安琪酵母菌的培養(yǎng)基發(fā)酵液，培養(yǎng)基為陳米糖化液及酒精發(fā)酵醪的混合液，塔中部填料層，填玉米芯和谷殼，谷殼于玉米芯底部和上部平鋪，作菌體附著載體，用泵將塔底三菌種培養(yǎng)基發(fā)酵液提升到塔頂，噴淋于填料層，通過填料層又回到塔底，如此循環(huán)淋澆，淋澆發(fā)酵溫度28-32℃，淋澆頻率1次/4h，每次淋澆時間1min，12h為一個控制周期，發(fā)酵時間總長144h，停止淋澆發(fā)酵后，將玉米芯上的細菌纖維素膜撕下，經(jīng)洗滌，烘干而得。
文檔編號C12R1/02GK102337320SQ201110296690
公開日2012年2月1日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者盧紅梅, 張麗平, 彭湘屏, 戴銳, 李大鵬, 王俊, 黃永濤 申請人:貴州大學