專利名稱：一種用于蛋白酶k常溫保存的緩沖液及其應用的制作方法
—種用于蛋白酶K常溫保存的緩沖液及其應用技術領域
本發(fā)明屬于分子生物學及生物工程技術領域，涉及基因工程操作中的一種工具酶的活性維持和保存的緩沖液及其應用。具體地，本發(fā)明涉及一種可以用于蛋白酶K溶液常溫長期保存而不失去活性的緩沖液及其應用。
背景技術：
蛋白酶，又稱蛋白水解酶，是一類催化蛋白質中肽鍵水解的酶，廣泛存在于動物內臟、植物莖葉、果實和微生物中。蛋白酶的種類很多，按照其水解多肽的方式，可以分為內肽酶和外肽酶兩類，前者將蛋白質分子從內部切斷，后者則從蛋白質分子的游離氨基端或羧基端開始逐個將肽鍵水解，游離出單個氨基酸。按照其活性中心和反應條件，蛋白酶又可以分為絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶和金屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。
蛋白酶廣泛存在于生物體內而且被越來越多地應用到基因工程的研究中。重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶等，其中，蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶，被廣泛應用于生物樣品中蛋白質的一般降解。
蛋白酶K(Proteinase K)是一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，在真菌林伯氏白色念球菌(tritirachium album limber)中發(fā)現,現也可以通過基因工程的手段重組表達獲得。野生型蛋白酶K由408個氨基酸組成，研究結果顯示，該酶的三級結構中有兩個Ca2+ 結合位點，該位點以及反應體系中Ca2+的存在對于維持蛋白酶K的結構及其活性有著重要的影響。
蛋白酶K的應用非常廣泛，工業(yè)上，蛋白酶K已廣泛應用在皮革、毛皮、絲綢、醫(yī)藥、 食品、釀造等方面，工業(yè)上大量利用蛋白酶，既節(jié)省時間，又改善勞動衛(wèi)生條件。在分子生物學和基因工程中，蛋白酶K主要用于核酸的抽提，以及在原位雜交等應用中用于雜交前的處理，蛋白酶K具有消化包圍靶DNA蛋白質的作用，以增加探針與靶核酸結合的機會，提高雜交信號。
蛋白酶K作為一種蛋白酶可以起到消化和降解其他蛋白的作用，但同時其本身也是一種蛋白質。和大部分的蛋白質一樣，其活性和穩(wěn)定性也受到溫度、PH值、保存時間等因素的影響，因此，蛋白酶K通常需要用干粉狀態(tài)于O 4°C保存，有效期為一年，或溶液狀態(tài)下于-20°C保存，有效期為半年。這給蛋白酶K的運輸和應用都帶來了不便，如何加強蛋白酶K的穩(wěn)定性、延長其保存期非常有必要。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種可以用于蛋白酶K溶液常溫長期保存而不失去活性的緩沖液及其應用，在該緩沖液中，蛋白酶K可以在常溫運輸和存放超過一年而活性不受顯著影響。
本發(fā)明通過調整 和對比，對緩沖液的成分、pH值，穩(wěn)定離子濃度、各成分的濃度等精心設計，最終獲得了一種對蛋白酶K在室溫保存過程中活性損失最小的緩沖液配方。
本發(fā)明首先公開了一種用于蛋白酶K常溫保存的緩沖液，所述緩沖液中，除水外， 還包括下列組分
Tris 10mmol/L-500mmol/L,優(yōu)選 25mmol/L ;
Ca2+ 2mmol/L-50mmol/L,優(yōu)選 10mmol/L ;
HCl 調節(jié) pH 值至 7.5-8. 4，優(yōu)選 pH 值為 8.0 ;
甘油(即為體積百分比)，優(yōu)選50v%。
所述Ca2+來源于可溶性的含Ca2+的化合物，如CaCl2, CaSO4等。
最優(yōu)選的，本發(fā)明的緩沖液中，除水外，余下的組分為
Tris 25mmol/L,
CaCl2 21 Ommol /I,
HCl 調節(jié) pH 值至 8. O
甘油50v%。
本發(fā)明進一步公開了所述緩沖液的制備方法，包括下列步驟
1.按照配比，將Tris、可溶性的含Ca2+的化合物和水混合均勻，并用HCl調節(jié)pH值至設定值；
2.按照配比，將甘油加入步驟I配制混合液中混勻即制得本發(fā)明的緩沖液。
本發(fā)明的緩沖液可用于常溫保存蛋白酶K。
本發(fā)明進一步公開了一種保存蛋白酶K的方法，為將蛋白酶K溶于本發(fā)明的緩沖液中配制成溶液常溫保存。
配制和溶解過程均為常規(guī)，一般蛋白酶K在緩沖液中的濃度為2mg/mL-20mg/mL。
通常情況下，蛋白酶K作為干粉狀態(tài)保存比較穩(wěn)定，但在本發(fā)明的緩沖液中，蛋白酶K可以在溶液的狀態(tài)下，于常溫下保存超過一年而活性不受明顯影響。且采用本發(fā)明的方法保存的蛋白酶K可無需處理直接應用，如用于核酸抽提等。


圖1是不同保存液保存的蛋白酶K活性比較
第I泳道水溶解蛋白酶K
第2泳道A緩沖液蛋白酶K
第3泳道B緩沖液蛋白酶K
第4泳道C緩沖液蛋白酶K
第5泳道D緩沖液蛋白酶K
第6泳道E緩沖液蛋白酶K
第7泳道F緩沖液蛋白酶K
第8泳道未經消化的BSA
圖2是用本發(fā)明的緩沖液保存一年后的蛋白酶K溶液用于基因組抽提實驗
第1-5泳道使用新配方保存液配制得蛋白酶K
第6-10泳道使用保存一年后的蛋白酶K具體實施方式
下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，旨在進一步舉例說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明所要保護的范圍。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1
蛋白酶K保存液配制
在同樣的實驗條件下，分別用純水，以及下述各種緩沖液配制濃度為10mg/ml蛋白酶K溶液，分別在配制后于室溫存放一年后用于蛋白酶K活性實驗。
緩沖液A:準確稱取O. 363g三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)，然后加入90ml水， 充分混勻后用鹽酸將其pH調至7. 5，用量筒定容置IOOml得到A試劑，其溶液成分為30mM Tris · Cl, pH 7. 5。
緩沖液B:分別準確稱取0. 363g三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、l. 117g乙二胺四乙酸二鈉鹽二水和7. 642g鹽酸胍(GuHCl)，然后加入90ml水，充分混勻后用鹽酸將其pH調至8. O。再準確量取5ml Tween-20和0. 5ml Triton X-100，加入上述溶液中混勻。用量筒定容置 IOOml 得到 B試劑，其溶液成分為 30mM Tris .Cl，pH 8. 0,30mM EDTA,5% Tween-20, 0. 5% Triton X-100,800mM GuHCl
緩沖液C :分別準確稱取0. 121g三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、0.931g乙二胺四乙酸二鈉鹽二水，0. 584g氯化鈉和0. 5g SDS，然后加入90ml水，充分混勻后用鹽酸將其pH 調至8. O。用量筒定容置IOOml得到C試劑，其溶液成分為IOmM Tris · Cl，pH 8. 0,25mM EDTA, IOOmM NaCl，0.5% SDS。
緩沖液D :分別準確稱取0. 363g三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、0· 372g乙二胺四乙酸二鈉鹽二水和Ig SDS，然后加入90ml水，充分混勻后用鹽酸將其pH調至8. O。用量筒定容置IOOml得到D試劑,其溶液成分為30mM Tris · Cl pH 8. O, IOmM EDTA, 1% SDS。
緩沖液E :分別準確稱取O. 303g三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)和O. 147g 二水氯化鈣，然后加入40ml水，充分混勻后用鹽酸將其pH調至8. 0，用量筒定容置50ml。再準確量取50ml甘油，加入上述溶液中，充分混勻。此溶液為E試劑，其成分為25mM Tris-Cl pH 8. O, IOmM CaCl2, 50v% glycerol，最終緩沖液的 pH 值為 8. 0o
緩沖液F :分別準確稱取0. 242g三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)和0. 0147g 二水氯化鈣，然后加入40ml水，充分混勻后用鹽酸將其pH調至7. 4，用量筒定容置50ml。再準確量取50ml甘油，加入上述溶液中，充分混勻。此溶液為F試劑，其成分為20mM Tris-HCl pH7. 4, ImM CaCl2, 50% glycerol。
實施例2
幾種不同緩沖 液對蛋白酶K的保護效果比較
采用牛血清白蛋白(BSA)作為蛋白酶K的消化對象，分別比較在不同緩沖液中保存的蛋白酶K的活性。
2.1 BSA樣品的處理
新鮮配制BSA溶液，準確稱取2mg BSA粉末，充分溶解于Iml水中，獲得2mg/ml的BSA工作液，用于蛋白酶K活性測試。
2. 2蛋白酶K消化
Protease K用上述各溶液配制成10mg/ml溶液，于室溫保存一年后進行后續(xù)實驗。
每個離心管中取100 μ I 2mg/ml的BSA工作液，共8管。取出其中一管作為實驗的對照管，并做好標記。向另外7管溶液中分別加入2 μ I的水溶解蛋白酶K，A緩沖液蛋白酶K，B緩沖液蛋白酶K，C緩沖液蛋白酶K，D緩沖液蛋白酶K，E緩沖液蛋白酶K，F緩沖液蛋白酶K，充分混勻，室溫消化15分鐘。
2. 3 SDS-PAGE檢測蛋白酶K消化效果
按以下配方配制SDS-PAGE
權利要求
1.一種用于蛋白酶K保存的緩沖液，所述緩沖液中，除水外，還包括下列組分Tris 10 mmol/T-500 mmol/LCa2+2 mmol/L-50 mmol/LHCl調節(jié)pH值至7· 5-8. 4甘油 30ν%-60ν%。
2.如權利要求1所述緩沖液，其特征在于，所述Tris的濃度為25mmol/L。
3.如權利要求1所述緩沖液，其特征在于，所述Ca2+的濃度為lOmmol/L。
4.如權利要求1所述緩沖液，其特征在于，所述PH值為8. O。
5.如權利要求1所述緩沖液，其特征在于，所述甘油的濃度為50v%。
6.如權利要求1所述緩沖液，其特征在于，所述Ca2+來源于可溶性的含Ca2+的化合物。
7.如權利要求6所述緩沖液，其特征在于，所述含Ca2+的化合物選自CaCl2和CaS04。
8.如權利要求1所述緩沖液，其特征在于，所述緩沖液中，除水外，余下的組分為Tris 25 mmol /I,CaCl2 10 mmol/LHCl 調節(jié)pH值至8. O甘油 50v%。
9.如權利要求1-8任一權利要求所述緩沖液用于常溫保存蛋白酶K的用途。
10.一種保存蛋白酶K的方法，為將蛋白酶K溶于權利要求1-8任一權利要求所述的緩沖液中配制成溶液常溫保存。
11.如權利要求10所述方法，其特征在于，蛋白酶K在所述緩沖液中的濃度為2mg/ mL-20mg/mLo
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于蛋白酶K常溫保存的緩沖液及其應用。本發(fā)明的緩沖液主要成分包括水、Tris、Ca2+及甘油。在本發(fā)明的緩沖液中，蛋白酶K可以在溶液的狀態(tài)下，于常溫下保存超過一年而活性不受明顯影響。
文檔編號C12N9/56GK103031291SQ201110295618
公開日2013年4月10日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權日2011年9月30日
發(fā)明者李威, 蘆麗亞 申請人:生工生物工程(上海)股份有限公司