專利名稱:采用發(fā)酵法制備富馬酸發(fā)酵液及富馬酸發(fā)酵液分離提取純品富馬酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種采用發(fā)酵法制備富馬酸發(fā)酵液及富馬酸發(fā)酵液分離提取純品富馬酸的方法,屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
富馬酸是一種重要的基本化工原料和精細(xì)化工產(chǎn)品,廣泛用于涂料、樹脂、醫(yī)藥、 增塑劑等領(lǐng)域。工業(yè)上可用于生產(chǎn)不飽和樹脂和醇酸樹脂,以及用作生產(chǎn)電泳漆的原料。 食品級(jí)富馬酸是口味純正的酸味劑,用作飲料、酒類、糕點(diǎn)以及腌菜等的酸味劑,并起著食品防腐劑、抗氧化劑和PH調(diào)節(jié)劑的作用。飼料級(jí)富馬酸及其酸類能提高飼料中有機(jī)物質(zhì)的吸收率和生物學(xué)利用率,減少機(jī)體能量消耗,具有促進(jìn)增重等作用。同時(shí),以富馬酸為原料可以進(jìn)一步合成多種高價(jià)值衍生物。近代已開發(fā)出一系列的富馬酸酯類防霉防蛀劑,其代表性產(chǎn)品富馬酸二甲酯為國外八十年代開發(fā)的一類低毒、高效、價(jià)廉、廣譜的新型防霉防腐劑。以富馬酸作為原料,可以進(jìn)一步合成多種藥品,諸如富馬酸亞鐵已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)上治療人體的小紅血球貧血病。另外,富馬酸作為一種重要的四碳平臺(tái)化合物,還可以通過酶催化轉(zhuǎn)化、酯化、加氫等工藝生產(chǎn)L-天冬氨酸、蘋果酸、琥珀酸、馬來酸等四碳化合物。隨著科技的發(fā)展,富馬酸的應(yīng)用領(lǐng)域和應(yīng)用范圍,將會(huì)得到進(jìn)一步的全面拓寬,社會(huì)對(duì)于富馬酸的需求量將會(huì)與日俱增。為此,高質(zhì)量、低成本制備富馬酸,已成為業(yè)內(nèi)的重點(diǎn)追求。采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)富馬酸,是目前業(yè)內(nèi)所注重的一種方法。Tsao教授等報(bào)道了利用米根霉菌株發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸技術(shù)(Appl Environ Microbiol,1996,62 2926^2931.),并設(shè)計(jì)了一種旋轉(zhuǎn)膜生物接觸器偶聯(lián)吸附柱的裝置,從發(fā)酵液中分離富馬酸的方法;中國專利CN101225412公開了利用木質(zhì)纖維素資源生產(chǎn)富馬酸的報(bào)道,在降低原料成本的基礎(chǔ)上拓寬了生物質(zhì)資源制備富馬酸的原料來源。但由于已有技術(shù)的原料路線所造成的制備工藝復(fù)雜,制備成本高等不足,而嚴(yán)重制約了富馬酸工業(yè)化生產(chǎn)。已有技術(shù)制備富馬酸終端純品富馬酸,是以富馬酸和富馬酸鈣為主的富馬酸發(fā)酵液為原料。通過分離提取純品富馬酸。目前已有多種分離提取方法,諸如中國專利 CN101235394A公開了一種反應(yīng)分離耦合技術(shù),從發(fā)酵液中移出富馬酸的方法,反應(yīng)器中的發(fā)酵液經(jīng)中空纖維膜過濾,納濾濃縮和離子交換吸附過程可將發(fā)酵液中一部分富馬酸及時(shí)移出,從而降低了產(chǎn)物抑制效應(yīng)以及富馬酸積累引起的低PH抑制菌體生理活性等問題。中國專利CN101492366A公開了在添加碳酸鈉作為中和劑得到富馬酸鈉的條件下分離提取富馬酸的方法,通過微濾、超濾、蒸發(fā)濃縮、酸化、離心洗滌過程可獲得高純度富馬酸產(chǎn)品。同樣由于分離提取工藝復(fù)雜,提純成本高等不足,而嚴(yán)重制約了富馬酸發(fā)酵液分離提取純品富馬酸的工業(yè)化生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種工藝相對(duì)簡單,成本相對(duì)較低的采用發(fā)酵法制備富馬酸發(fā)酵液及富馬酸發(fā)酵液分離提取純品富馬酸的方法,為富馬酸工業(yè)化生產(chǎn)和社會(huì)對(duì)富馬酸需求量的日益增長提供技術(shù)支持。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第一個(gè)目的的技術(shù)方案是,提供以葡萄糖為料,通過米根霉菌株發(fā)酵制備富馬酸發(fā)酵液的方法,即
一種采用發(fā)酵法制備富馬酸發(fā)酵液的方法,以葡萄糖為原料,以米根霉菌株ahizopus Oryzae ClCC 40506)為出發(fā)菌株,依次按照種子培養(yǎng)和發(fā)酵二個(gè)步驟進(jìn)行,制備以富馬酸為主的富馬酸發(fā)酵液;所述發(fā)酵步驟,是將種子培養(yǎng)步驟所制備的種子液,與含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基,按一定的體積比接種于已滅菌的裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內(nèi)實(shí)施發(fā)酵,而其
a、按發(fā)酵罐體積的陽 75%將發(fā)酵培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐內(nèi),按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5 15%接種由種子培養(yǎng)步驟制備的種子液,發(fā)酵溫度為3(T40°C,攪拌轉(zhuǎn)速為15(T300RRii。b、通入空氣策略為前24h維持通氣量為1.0 1.2^111,24 3611維持通氣量為 0. 5 0. 6vvm, 36 48h維持通氣量為0 vvm, 48 60h維持通氣量0. 5 0. 6 vvm, 60 72h維持通氣量為1. (Tl. 2 vvm, 72h后繼續(xù)維持通氣量1. (Tl. 2 vvm,并流加無菌葡萄糖溶液,維持發(fā)酵罐中葡萄糖濃度2(T30g/L,直至100 10證發(fā)酵結(jié)束,即獲得所述富馬酸發(fā)酵液。由以上所給出的第一個(gè)技術(shù)方案可以明了,本發(fā)明的種子培養(yǎng),與已有技術(shù)基本相同,但其發(fā)酵培養(yǎng),由于采取了分時(shí)段間歇改變通入空氣流量的方式,而有效提高了糖酸 (葡萄糖/富馬酸)轉(zhuǎn)換率。且所述工藝流程較短,葡萄糖原料廣泛,工藝裝備簡單,工藝操作方便,從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。在上述第一個(gè)主旨技術(shù)方案中,本發(fā)明還主張,所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及各組分單位體積的重量含量是葡萄糖4(T120 g/L,磷酸二氫鉀0.6 1.0 g/L,尿素0. Γθ. 3 g/L, 硫酸鎂0.5 0.6 g/L,硫酸鋅0.廣0. 15 g/L,硫酸亞鐵0.0088 0.01 g/L,碳酸鈣40 50 g/ L ;通過一定濃度的酸或堿的加入,令發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值維持在2. 75^3. 25范圍內(nèi)。但不局限于此。所述用來調(diào)節(jié)PH值的酸或堿,可以是硫酸或碳酸鈉。在上述第一個(gè)主旨技術(shù)方案中,本發(fā)明還主張,所述種子培養(yǎng)步驟的種子培養(yǎng)基的組分及各組分單位體積的重量含量是葡萄糖1(T30 g/L,磷酸二氫鉀0.6 1.0 g/L,硫酸銨廣3 g/L,硫酸鎂0.5 0.6 g/L,硫酸鋅0.廣0. 15 g/L,硫酸亞鐵0. 0088 0. 01 g/L ;在對(duì)所述種子培養(yǎng)基滅菌完畢后,用無菌稀硫酸調(diào)節(jié)其PH值維持在2. 5^3. 5范圍內(nèi)。但不局限于此。以上所述發(fā)酵培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基其中的多種工藝條件添加劑的金屬鹽的含量, 都應(yīng)當(dāng)從嚴(yán)控制,而其葡萄糖的含量,在通常情況下,可以從寬控制,以保證米根霉菌在繁殖、發(fā)育和生長過程中充足的食量,而且在其整個(gè)發(fā)酵過程中,還要嚴(yán)格控制葡萄糖濃度不要低于20 g/L。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第二個(gè)目的的技術(shù)方案是,提供以如前所述富馬酸發(fā)酵液為原料,分離提取純品富馬酸的方法,即
一種如前述第一個(gè)技術(shù)方案所提供的所述富馬酸發(fā)酵液分離提取純品富馬酸的方法, 而其步驟依次按照如下程序進(jìn)行
a、將所述富馬酸發(fā)酵液加熱至6(T90°C,緩緩加入固體鈉鹽,鈉鹽的加入量為所述發(fā)酵液中富馬酸總質(zhì)量的0. 8 1. 2倍,攪拌3(T60min ;b、將步驟a的料液進(jìn)行抽濾或壓榨,除去細(xì)胞菌體以及包括過剩固體碳酸鈣在內(nèi)的其它固體雜質(zhì),得到澄清濾液;
C、在步驟b的澄清濾液中加入較高濃度強(qiáng)酸,調(diào)節(jié)澄清濾液的PH至1. (Γ2. 0之間,得到含有一定量沉淀顆粒的酸化液;
d、將步驟c的酸化液進(jìn)行抽濾或壓榨,收集主要成分為富馬酸以及一定量的不溶性鈣鹽以及雜蛋白的固體沉淀,而所述濾液可循環(huán)用于步驟a ;
e、將步驟d所得的固體物料用熱水浸泡洗滌,并加熱至7(T80°C,攪拌l(T30min,抽濾得到澄清濾液,所得濾液室溫冷卻Mh,至大量沉淀固體析出,固體為富馬酸產(chǎn)品;
f、將步驟e富馬酸產(chǎn)品用清水浸泡洗滌,浸泡用水量為固體富馬酸質(zhì)量的5 10%。g、將步驟f浸泡洗滌后的富馬酸固體通過流化床在6(T80°C溫度下烘干,得到富馬酸純品。由以上所給出的所述提純富馬酸的方法可以明了,本發(fā)明所采用的是富馬酸發(fā)酵液一加鈉鹽一加熱攪拌一抽濾一加酸沉淀一抽濾一熱水浸泡、冷卻沉淀一清水浸泡 —烘干一得固體純品富馬酸的工藝路線。不但所述工藝路線簡單易控;加熱溫度不高 (彡100°C),能源消耗少,環(huán)境無污染;而且所得純品富馬酸含量高(彡99%),從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的第二個(gè)主旨目的。在上述第二個(gè)主旨技術(shù)方案中,本發(fā)明還主張,步驟a加入的所述鈉鹽是碳酸鈉或者是硫酸鈉。本發(fā)明積極推薦的是碳酸鈉。在上述第二個(gè)主旨技術(shù)方案中,本發(fā)明還主張,步驟c所加入的強(qiáng)酸是硫酸或鹽酸或硝酸或磷酸,本發(fā)明積極推薦的是硫酸。上述技術(shù)方案得以實(shí)施后,本發(fā)明所具有的工藝簡單,產(chǎn)品收得率高,產(chǎn)品純度高,制備成本低,環(huán)保無污染和適合工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)是顯而易見的。
圖1是本發(fā)明一種具體實(shí)施方式
的富馬酸發(fā)酵液制備工藝流程圖2是本發(fā)明一種具體實(shí)施方式
的富馬酸發(fā)酵液分離提取純品富馬酸的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1,如附圖1所示,
一種采用發(fā)酵法制備富馬酸發(fā)酵液的方法,其工藝步驟是 (1)菌株選用選用米根霉菌株ahizopus Oryzae CICC40506)。(2)培養(yǎng)基制備
權(quán)利要求
1.一種采用發(fā)酵法制備富馬酸發(fā)酵液的方法,以葡萄糖為原料,以米根霉菌株 (Rhizopus Oryzae ClCC 40506)為出發(fā)菌株,依次按照種子培養(yǎng)和發(fā)酵二個(gè)步驟進(jìn)行, 制備以富馬酸為主的富馬酸發(fā)酵液;所述發(fā)酵步驟,是將種子培養(yǎng)步驟所制備的種子液,與含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基,按一定的體積比接種于已滅菌的裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內(nèi)實(shí)施發(fā)酵,其特征在于a、按發(fā)酵罐體積的陽 75%將發(fā)酵培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐內(nèi),按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5 15%接種由種子培養(yǎng)步驟制備的種子液,發(fā)酵溫度為3(T40°C,攪拌轉(zhuǎn)速為15(T300RRii;b、通入空氣策略為前Mh維持通氣量為1.(Tl. 2vvm, 24^36h維持通氣量為 0. 5 0. 6vvm, 36 48h維持通氣量為0 vvm, 48 60h維持通氣量0. 5 0. 6 vvm, 60 72h維持通氣量為1. (Tl. 2 vvm, 72h后繼續(xù)維持通氣量1. (Tl. 2 vvm,并流加無菌葡萄糖溶液,維持發(fā)酵罐中葡萄糖濃度2(T30g/L,直至100 10證發(fā)酵結(jié)束,即獲得所述富馬酸發(fā)酵液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用發(fā)酵法制備富馬酸發(fā)酵液的方法,其特征在于,所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及各組分單位體積的重量含量是葡萄糖4(T120 g/L,磷酸二氫鉀0. 6^1. 0 g/L,尿素 0. Γ0. 3 g/L,硫酸鎂 0. 5 0. 6 g/L,硫酸鋅 0. Γθ. 15 g/L,硫酸亞鐵 0. 0088 0. 01 g/L,碳酸鈣4(T50 g/L;通過一定濃度的酸或堿的加入,令發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值維持在 2. 75 3. 25范圍內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用發(fā)酵法制備富馬酸發(fā)酵液的方法,其特征在于,所述種子培養(yǎng)步驟的種子培養(yǎng)基的組分及各組分單位體積的重量含量是葡萄糖1(T30 g/L,磷酸二氫鉀0. 6 1. O g/L,硫酸銨Γ3 g/L,硫酸鎂0. 5 0. 6 g/L,硫酸鋅0. Γθ. 15 g/L,硫酸亞鐵0. 0088、. 01 g/L ;在對(duì)所述種子培養(yǎng)基滅菌完畢后,用無菌稀硫酸調(diào)節(jié)其PH值維持在 2. 5^3. 5范圍內(nèi)。
4.一種如權(quán)利要求1所制備的富馬酸發(fā)酵液分離提取純品富馬酸的方法,以如權(quán)利要求1所獲得的所述富馬酸發(fā)酵液為原料,其特征在于,依次按照如下步驟進(jìn)行a、將所述富馬酸發(fā)酵液加熱至6(T90°C,緩緩加入固體鈉鹽,鈉鹽的加入量為所述發(fā)酵液中富馬酸總質(zhì)量的0. 8 1. 2倍,攪拌3(T60min ;b、將步驟a的料液進(jìn)行抽濾或壓榨,除去細(xì)胞菌體以及包括過剩固體碳酸鈣在內(nèi)的其它固體雜質(zhì),得到澄清濾液;c、在步驟b的澄清濾液中加入較高濃度強(qiáng)酸,調(diào)節(jié)澄清濾液的PH至1.(Γ2. O之間,得到含有一定量沉淀顆粒的酸化液;d、將步驟c的酸化液進(jìn)行抽濾或壓榨,收集主要成分為富馬酸以及一定量的不溶性鈣鹽以及雜蛋白的固體沉淀,而所述濾液可循環(huán)用于步驟a ;e、將步驟d所得的固體物料用熱水浸泡洗滌,并加熱至7(T80°C,攪拌l(T30min,抽濾得到澄清濾液,所得濾液室溫冷卻Mh,至大量沉淀固體析出,固體為富馬酸產(chǎn)品;f、將步驟e富馬酸產(chǎn)品用清水浸泡洗滌,浸泡用水量為固體富馬酸質(zhì)量的5 10%;g、將步驟f浸泡洗滌后的富馬酸固體通過流化床在6(T80°C溫度下烘干,得到富馬酸純品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的富馬酸發(fā)酵液分離提取純品富馬酸的方法,其特征在于,步驟a加入的所述鈉鹽是碳酸鈉或者是硫酸鈉。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的富馬酸發(fā)酵液分離提取純品富馬酸的方法,其特征在于,步驟c所加入的強(qiáng)酸是硫酸或鹽酸或硝酸或磷酸,首選的是硫酸。
全文摘要
本發(fā)明所公開的是一種采用發(fā)酵法制備富馬酸發(fā)酵液及富馬酸發(fā)酵分離提取純品富馬酸的方法,以葡萄糖為原料,以米根霉菌株為出發(fā)菌株,以其發(fā)酵培養(yǎng)采用分時(shí)段間歇通入空氣流量為主要特征;而其富馬酸發(fā)酵液的分離提純,以富馬酸發(fā)酵液加鈉鹽加熱攪拌→抽濾→加酸沉淀→抽濾→熱水浸泡、冷卻沉淀→清水浸泡→烘干→得純品富馬酸的工藝流程為主要特征,具有工藝易控,裝備簡單,收得率高,產(chǎn)品純度高,制備成本低,環(huán)保無污染等特點(diǎn)。為制備純品富馬酸提供了一條科學(xué)合理的新途徑。
文檔編號(hào)C12R1/845GK102321683SQ20111029546
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者萬屹東, 尤吉, 朱建國, 王偉, 芮新生, 陸瑾連 申請(qǐng)人:常茂生物化學(xué)工程股份有限公司