一種發(fā)酵制備富馬酸的工藝的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領域，具體涉及一種發(fā)酵制備富馬酸的工藝。
【背景技術】
[0002]富馬酸(Fumaric acid)作為一種重要的有機基本化工原料和大宗化工產品，廣泛應用于涂料、樹脂、醫(yī)藥、增塑劑、食品添加劑等領域，具有重要的市場價值。同時，以富馬酸為原料可以進一步合成多種高價值衍生物，如富馬酸二甲酯(DMF)、富馬酸亞鐵等。另外，富馬酸作為一種重要的四碳平臺化合物，還可以通過酶催化轉化、酯化、加氫等工藝生產L-天冬氨酸、蘋果酸、琥珀酸、馬來酸、1，4-丁二醇、γ-丁內酯和四氫呋喃等四碳化合物。
[0003]目前工業(yè)上生產富馬酸主要采用化學法，發(fā)酵法生產富馬酸并未實現(xiàn)工業(yè)化，其主要原因是原料費占富馬酸生產的很大一部分，降低原材料成本成為生物法制備富馬酸的唯一出路，目前生產富馬酸的菌主要是米根霉，為了降低原料成本，考慮利用淀粉質原料生產富馬酸，但是需要將淀粉質原料通過液化和糖化轉化成葡萄糖后再利用，此工藝復雜，而且液化和糖化同樣增加了成本，目前，已有文獻報道，直接利用米根霉液化液進行同步糖化發(fā)酵富馬酸，雖然取得了好的效果，但是發(fā)酵過程中后期糖耗低，終點殘?zhí)呛扛?，從而導致發(fā)酵能耗高、成本高，設備利用率低等。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明提供了一種發(fā)酵制備富馬酸的工藝，利用低濃度的淀粉液化液分批發(fā)酵，在中后期再向發(fā)酵系統(tǒng)中補加一定的淀粉液化液和糖化酶，既避免了高初糖濃度對富馬酸發(fā)酵的抑制，又可解決后期因菌自身糖化酶活力降低導致糖耗低的問題，同時提高了菌種的利用率，糖酸轉化率和設備利用率，降低了生產成本。
[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明采用的技術方案是這樣的:一種發(fā)酵制備富馬酸的工藝，包括以下步驟:
1)將淀粉液化液加入種子罐中，同時添加尿素和無機鹽，調整pH至2.5-3.5，滅菌后接入米根霉孢子懸浮液，進行種子液培養(yǎng)；
2)將淀粉液化液加入發(fā)酵罐中，滅菌后接入經步驟I)培養(yǎng)好的種子液，并向其中加入分消的碳酸鈣；
3)待發(fā)酵32-38h，將淀粉糖化液和糖化酶作為流加液以20-25mL/h的流加速度向發(fā)酵罐內流加，流加液的總加入體積為初始發(fā)酵體積的10%-15%，其中，流加液中淀粉糖化液的總糖濃度為60-80g/L，糖化酶的酶活力為4.5 X 15 6.7 X 15 U/mL。
[0006]初糖總糖過高則抑制菌體生長，初糖總糖過低則菌體生長旺盛，抑制磷酸果糖激酶的活性，降低菌體發(fā)酵前期產酸速率，因而所述的發(fā)酵罐中淀粉液化液的初始總糖濃度優(yōu)選為40-60g/L。
[0007]優(yōu)選地，所述的淀粉液化液的具體制備過程:淀粉質原料與水以8-12% (w/v)的比例混合成糊狀后，加熱到70-80°C，加入耐高溫淀粉酶，加酶量為800?1000 U/g干淀粉質原料，保溫10 -20min后繼續(xù)加熱到90_95°C，碘檢不變色后繼續(xù)加熱到100°C煮沸5?10min，然后趁熱經過3-4層紗布過濾，濾液冷卻后加水調整糖度。
[0008]優(yōu)選地，所述的淀粉糖化液的具體制備過程為:將淀粉液化液加熱至50— 60°C，加入糖化酶，保溫4-5h，無水酒精檢驗無糊精存在后，繼續(xù)加熱至70-80°C，保溫10-30min，冷卻后加水調整糖度。
[0009]富馬酸的發(fā)酵需要的低氮的條件下進行，為了控制淀粉質原料中的氮含量，所述的淀粉質原料優(yōu)選自可溶性淀粉、玉米粉、脫胚玉米粉、木薯粉之中的一種或2種的組合。
[0010]優(yōu)選地，種子罐中淀粉液化液的總糖濃度為25_25g/L。
[0011]優(yōu)選地，尿素的添加量為2-2.5g/L。
[0012]優(yōu)選地，所述的無機鹽為KH2P04，MgSO4.7H20，ZnSO4和FeSO4.7H20，濃度分別為 0.5-0.6 g/L,0.4-0.55 g/L，0.08-0.15 g/L，0.08-0.09 g/L。
[0013]優(yōu)選地，種子液接種于發(fā)酵罐的接種量為10-15%。
[0014]通過研究發(fā)現(xiàn)，生產富馬酸的米根霉，其自身具有糖化酶，可直接利用淀粉質原料的液化液來生產富馬酸，但是，由于米根霉自身的具備的糖化酶活力不高，在發(fā)酵中后期受到發(fā)酵產物的抑制，活力進一步下降，因而其利用淀粉質原料液化液來生產富馬酸時，容易造成后期糖耗低，終點殘?zhí)呛扛摺?br>[0015]有益效果:
1、本發(fā)明分批發(fā)酵中采用低濃度的淀粉液化液作為碳源，在發(fā)酵過程中后期(32-38h)，此時耗糖速率下降，糖化酶的活力降低，通過流加技術，補加一定的淀粉糖化液和糖化酶，除能快速補充能夠利用的碳源外，勻速流加的商品糖化酶可以不斷將未反應的淀粉液化液糖化為可利用的葡糖糖，此工藝既避免了高初糖濃度對富馬酸發(fā)酵的抑制，提高了富馬酸的產量，又解決了發(fā)酵終點殘?zhí)菨舛冗^高的問題，從而保證富馬酸發(fā)酵持續(xù)高效進行，提高菌種的利用率，糖酸轉化率與設備利用率，從而降低發(fā)酵成本。
[0016]2、本發(fā)明流加液中淀粉糖化液的總糖選擇為40_60g/L，糖化酶的酶活選擇為4.5 X 15 6.7 X 15 U/mL，流加速度選擇為20_25mL/h，這樣既為發(fā)酵及時提供了碳源，同時因淀粉糖化液中含有一些生長因子如氨基酸、維生素和生物素等，也使其得到了補充，如果太高，反而會導致后期菌體瘋長，不利于產酸和轉化率的提高，而且還增加了成本；如果太低，起不到作用。
【具體實施方式】
[0017]為了加深對本發(fā)明的理解，下面將結合實施例對本發(fā)明作進一步詳述，這些實施例僅用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明保護范圍的限定。
[0018]實施例1
一種發(fā)酵制備富馬酸的工藝，其特征在于，包括以下步驟，
O將總糖含量為25g/L的脫胚玉米粉液化液加入種子罐中，同時添加2.5g/L尿素，
0.6 g/L KH2PO4，0.55 g/L MgSO4.7Η20，0.15 g/L ZnSO4 和 0.09g/L FeSO4.7H20，調整 pH至2.5，滅菌后接入米根霉孢子懸浮液，進行種子液培養(yǎng)；
2)將3L總糖含量為40g/L脫胚玉米粉液化液加入5L發(fā)酵罐中，滅菌后按10%的接種量接入經步驟I)培養(yǎng)好的種子液，并向其中加入分消的碳酸鈣40g/L ; 3)于35°C，1 vvm的通氣比率、400 rpm的攪拌轉速下進行發(fā)酵，待發(fā)酵32h，將玉米粉糖化液和糖化酶作為流加液，以25mL/h的流加速度向發(fā)酵罐內流加，流加液的總加入體積為450mL，其中，流加液中玉米糖化液的總糖濃度為40g/L，糖化酶的酶活為4.5X 15 U/mL。
[0019]其中，所述的脫胚玉米粉液化液的具體制備過程:脫胚玉米粉與水以8% (w/v)的比例混合成糊狀后，加熱到70-80°C，加入耐高溫淀粉酶，加酶量為800?1000 U/g干淀粉質原料，保溫10 -20min后繼續(xù)加熱到90_95°C，碘檢不變色后繼續(xù)加熱到100°C煮沸5?10 min，然后趁熱經過3-4層紗布過濾，濾液冷卻后加水調整總糖濃度為40g/L和25g/L。
[0020]脫胚玉米粉糖化液的具體制備過程為:將脫胚玉米粉液化液加熱至50— 60°C，加入糖化酶，保溫4-5h，無水酒精檢驗無糊精存在后，繼續(xù)加熱至70-80°C，保溫10-30min，冷卻后加水調整總糖濃度為40g/L。
[0021]在此條件下，發(fā)酵55 h，產酸為39 g/L，殘?zhí)菫?.5g/L。
[0022]實施例2
一種發(fā)酵制備富馬酸的工藝，包括以下步驟，
1)將總糖含量為20g/L的木薯粉液化液加入種子罐中，同時添加2g/L尿素，0.5 g/LKH2PO4，0.4 g/L MgSO4.7Η20，0.08 g/L ZnSO4