專利名稱：一種檢測(cè)西尼羅病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉 及一種檢測(cè)西尼羅病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
西尼羅病毒感染導(dǎo)致的西尼羅熱是蚊媒傳播的人畜共患病。多數(shù)患者呈亞臨床癥狀，約20%感染者會(huì)在3-14d后出現(xiàn)西尼羅熱。其病癥可能包括發(fā)燒、頭痛、身體疼痛、淋巴腺腫脹，有時(shí)有出疹癥狀。病癥通常持續(xù)約一周。西尼羅病毒感染可導(dǎo)致病毒性腦炎，引起高燒、頭痛、神志錯(cuò)亂、虛弱無力，有時(shí)亦會(huì)出現(xiàn)麻痹，偶然會(huì)導(dǎo)致死亡。西尼羅病毒1999年以前主要在非洲、中東、西亞和歐洲流行。1996年羅馬尼亞暴發(fā)歐洲首次西尼羅熱大流行。流行集中在多瑙河流域的14個(gè)地區(qū)，病毒感染率約為1214/10萬。1999年俄羅斯南部也暴發(fā)大范圍西尼羅腦炎流行，約有1000病例，至少40人死亡。1999年美國首次爆發(fā)西尼羅熱流行，這是西半球首次西尼羅熱流行。自此，美國歷年均暴發(fā)西尼羅熱/西尼羅腦炎流行，且西尼羅病毒分布已從1999年4個(gè)州蔓延到2004年近50個(gè)州，并傳播到加拿大中南部和加勒比海地區(qū)。時(shí)至今日，西尼羅病毒感染已成為全球性嚴(yán)重的公共衛(wèi)生健康問題。西尼羅腦炎診斷主要依賴檢測(cè)病毒及其抗體，由于病毒血癥時(shí)病毒載量低，且恢復(fù)期病毒已被清除，因此從血液或者腦脊液中分離病毒較為困難。新的診斷技術(shù)包括用ELISA方法測(cè)抗原、或者用PCR和實(shí)時(shí)PCR測(cè)定西尼羅病毒核酸。其中實(shí)時(shí)PCR是這些診斷技術(shù)方法中最為敏感的，但仍不能檢測(cè)出所有的西尼羅腦炎患者。傳統(tǒng)的這些方法等常需要花費(fèi)較長時(shí)間或者需要特定的儀器，難以滿足暴發(fā)疫情快速診斷的需要。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)法具有在等溫條件下即可高速、快速、高特異、高靈敏的擴(kuò)增靶序列的特點(diǎn)。核酸大量合成時(shí)，dNTP會(huì)析出大量的焦磷酸根離子，焦磷酸根離子與LAMP體系中的Mg2+(或Mn2+)結(jié)合，產(chǎn)生焦磷酸鎂或焦磷酸錳沉淀，從而引起反應(yīng)液的濁度變化，非常易于判斷。此外，利用一些熒光燃料，如SYBR green I染料或者與鈣黃綠素指示LAMP反應(yīng)。SYBRgreen I染料可與雙鏈DNA產(chǎn)物結(jié)合，當(dāng)有產(chǎn)物大量擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)體系呈現(xiàn)顯著的熒光信號(hào)變化。鈣黃綠素在反應(yīng)初始時(shí)與Mn2+結(jié)合，反應(yīng)液顯示透明的橙色，當(dāng)有核酸產(chǎn)物大量合成時(shí)，會(huì)生成副產(chǎn)物焦磷酸根，使Mg2+游離出來，與鈣黃綠素結(jié)合，最終使反應(yīng)液顯示微濁的黃綠色。由于LAMP方法試驗(yàn)要求條件低，結(jié)果易于判斷，非常適宜基層病毒的排查，開展及時(shí)的動(dòng)物衛(wèi)生防控工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)西尼羅病毒的專用引物。本發(fā)明提供的專用引物，包括引物I、引物2、引物3和引物4，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。
所述專用引物還包括引物5，所述引物5的核苷酸序列為序列表的序列5。所述專用引物由所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5組成；所述西尼羅病毒具體為西尼羅病毒Chin-Ol毒株。所述專用引物中，F(xiàn)3、B3、FIP、BIP、LB的5’端和/或3’端還可根據(jù)靶序列進(jìn)行延長；所述專用引物中，F(xiàn)3、B3、FIP、BIP、LB還可進(jìn)行堿基的替換和/或取代，保持3’末端序列6個(gè)堿基100%的同源性即可。FIP和BIP中TTTT(下劃線者)為連接序列，其長度一般為4個(gè)，數(shù)目可相應(yīng)縮短和延長。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種檢測(cè)西尼羅病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)試劑。本發(fā)明提供的試劑，包括RNA逆轉(zhuǎn)錄酶、Bst DNA聚合酶、2X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖 液、所述的專用引物。所述擴(kuò)增試劑還包括鈣黃綠素；所述擴(kuò)增試劑由RNA逆轉(zhuǎn)錄酶、Bst DNA聚合酶、2X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液、所述的專用引物和鈣黃綠素組成；所述的專用引物中的引物I和引物2在對(duì)應(yīng)的所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度均為5pmol/L ;所述的專用引物中的引物3和引物4在對(duì)應(yīng)的所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度均為40pmol/L ;所述的專用引物中的引物5在對(duì)應(yīng)的所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度均為20pmol/L ；所述的引物5可與莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合啟動(dòng)鏈置換合成，提高擴(kuò)增效率。擴(kuò)增的最后產(chǎn)物是具有不同個(gè)數(shù)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長度DNA的混合物，其產(chǎn)量可達(dá)10 yg以上，是普通PCR反應(yīng)DNA產(chǎn)率的至少50倍。所述RNA逆轉(zhuǎn)錄酶在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的濃度為O. 004U/ μ L ；所述RNA逆轉(zhuǎn)錄酶具體為AMV逆轉(zhuǎn)錄酶；所述Bst DNA聚合酶在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的濃度為O. 32U/ μ L ；所述鈣黃綠素在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的濃度為50 μ mol/L ；所述2X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液按照如下方法制備將氯化鉀(KCl)、硫酸鎂(MgSO4)、硫酸銨((NH4)2SO4)、吐溫 20 (Tween-20)、甜菜堿(Betaine)、氯化錳(MnCl2)和dNTPs (脫氧核苷三磷酸混合物dATP、dCTP、dGTP和dTTP)溶于濃度為40mmol/L、PH值為
8.8的Tris鹽酸鹽緩沖液得到；在所述2 X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液中，所述氯化鉀的濃度為20mmol/L，所述硫酸鎂的濃度為16mmol/L，所述硫酸銨的濃度為20mmol/L，所述吐溫20的濃度為O. 2% (質(zhì)量百分含量)，所述甜菜堿的濃度為1.6mol/L，所述氯化錳的濃度為lmmol/L，每種所述脫氧核苷三磷酸的濃度均為2. 8mmol/Lo所述西尼羅病毒具體為西尼羅病毒Chin-Ol毒株。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種檢測(cè)西尼羅病毒的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑；所述西尼羅病毒具體為西尼羅病毒Chin-Ol毒株。所述專用引物或所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或所述的試劑盒在鑒定和/或輔助鑒定西尼羅病毒中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述西尼羅病毒具體為西尼羅病毒Chin-Ol毒株。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種鑒定和/或輔助鑒定待測(cè)樣品中西尼羅病毒的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟用所述專用引物或所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或所述的試劑盒中的所述專用引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物；所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增中，以待測(cè)樣品的RNA為模板；所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為先60°C _65°C反應(yīng)35-60min，然后75°C 2min終止反應(yīng)。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為先63°C反應(yīng)45min或60min,然后75°C 2min終止反應(yīng)；所述待測(cè)樣本為小鼠的腦。本發(fā)明的檢測(cè)對(duì)象不局限于小鼠腦組織樣本，還可涉及蚊蟲樣本、動(dòng)物或人的血清、腦脊液、尸解腦組織或臟器組織等；所述西尼羅病毒為西尼羅病毒Chin-Ol毒株。所述檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的方法為如下I) _4)中的至少一種I)觀察所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，若所述產(chǎn)物在自然光下為黃綠色，且在紫外光下有亮黃色熒光，則待測(cè)樣本中含有或者候選含有西尼羅病毒；若所述產(chǎn)物在自然光下為橙黃色，且在紫外光下無熒光，則待測(cè)樣本中不含有或者候選不含有西尼羅病毒；2)用實(shí)時(shí)濁度儀檢測(cè)所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，若有特異擴(kuò)增曲線，則待測(cè)樣本中含有或者候選含有西尼羅病毒；若無特異擴(kuò)增曲線，則待測(cè)樣本中不含有或者候選不含有西尼羅病毒；3)電泳檢測(cè)所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，得到梯度樣條帶的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，則待測(cè)樣本中含有或者候選含有西尼羅病毒；若環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物不為梯度樣條帶，則待測(cè)樣本中不含有或者候選不含有西尼羅病毒；所述梯度樣條帶的大小為200bp_2000bp，所述梯度樣條帶的大小主要分布在200bp-2000bp 間；4)用Sca I酶切所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，電泳檢測(cè)所述酶切產(chǎn)物，若所述酶切產(chǎn)物為244bp產(chǎn)物和164bp產(chǎn)物，則待測(cè)樣本中含有或者候選含有西尼羅病毒；若所述酶切產(chǎn)物不為244bp產(chǎn)物和164bp產(chǎn)物，則待測(cè)樣本中不含有或者候選不含有西尼羅病毒。所述檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物采用肉眼觀察濁度變化、肉眼觀察熒光染料變化或?qū)崟r(shí)濁度儀檢測(cè)，具體如下I)肉眼觀察濁度若肉眼觀察濁度增大，則環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)為陽性，表明樣本中含有或者候選含有西尼羅病毒；反之為陰性。具體為核酸大量合成時(shí)，dNTP會(huì)析出大量的焦磷酸根離子，焦磷酸根離子與LAMP體系中的Mg2+(或Mn2+)結(jié)合，產(chǎn)生焦磷酸鎂或焦磷酸錳沉淀，從而引起反應(yīng)液的濁度變化；基于該原理，可以直接肉眼觀測(cè)，根據(jù)反應(yīng)液的濁度變化判斷是否有特異性擴(kuò)增發(fā)生和特異核酸大量合成，從而判斷模板是否為靶序列。2)肉眼觀察熒光染料變化當(dāng)采用鈣黃綠素?zé)晒馊玖线M(jìn)行反應(yīng)時(shí)，若LAMP反應(yīng)產(chǎn)物在自然光下由開始的橙色變?yōu)辄S綠色且在紫外光下顯熒光，則LAMP反應(yīng)陽性，即表明待測(cè)樣本含有或候選含有西尼羅病毒。具體為應(yīng)用熒光染料顏色變化進(jìn)行判定時(shí)，可采用SYBR green I染料或鈣黃綠素。SYBR green I染料可與雙鏈DNA結(jié)合，但反應(yīng)中有大量產(chǎn)物產(chǎn)生時(shí)，反應(yīng)體 系顏色變?yōu)辄S綠色。核酸大量合成時(shí)，會(huì)生成副產(chǎn)物焦磷酸根，焦磷酸根離子的存在，使得Mg2+游離出來，鈣黃綠素和Mg2+結(jié)合，反應(yīng)液呈現(xiàn)微濁的黃綠色?；谠撛恚梢愿鶕?jù)反應(yīng)液的顏色變化判斷是否有核酸大量合成，從而判斷模板是否為靶序列。也可根據(jù)反應(yīng)原理，選擇本領(lǐng)域其他熒光染料進(jìn)行LAMP反應(yīng)的判定。3)實(shí)時(shí)濁度儀檢測(cè)采用實(shí)時(shí)濁度儀及其配套程序軟件實(shí)時(shí)檢測(cè)反應(yīng)液的濁度變化，若實(shí)時(shí)濁度儀上觀察到典型的擴(kuò)增曲線，則LAMP反應(yīng)陽性，即表明待測(cè)樣本含有或候選含有西尼羅病毒。還可以用如下方法進(jìn)行檢測(cè)4)電泳將LAMP反應(yīng)產(chǎn)物用Sca I酶切，得到酶切產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)LAMP反應(yīng)產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物；若LAMP反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)梯狀帶型(200 2000bp)，且酶切產(chǎn)物為244bp和164bp的雙帶，則LAMP反應(yīng)陽性，即表明待測(cè)樣本含有或候選含有西尼羅病毒。5)當(dāng)采用SYBR green I染料時(shí)，可通過實(shí)時(shí)PCR儀及其配套程序軟件實(shí)時(shí)檢測(cè)反應(yīng)液的熒光進(jìn)行判定，當(dāng)檢測(cè)到熒光信號(hào)時(shí)，表明LAMP反應(yīng)為陽性。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的專用引物和方法，適用于對(duì)西尼羅病毒(WNV)進(jìn)行特異性檢測(cè)和定量分析，其優(yōu)點(diǎn)如下(I)只需在恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊設(shè)備;(2)特異性高；(3)快速高效，擴(kuò)增反應(yīng)在35分鐘內(nèi)即可完成；(4)靈敏度高；(5)鑒定方便簡單。本發(fā)明特別適用于臨床標(biāo)本的快速檢測(cè)。


圖I為在自然光(A)和紫外燈⑶下各個(gè)樣本LAMP結(jié)果圖2為LAMP反應(yīng)產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖3為實(shí)時(shí)濁度儀擴(kuò)增曲線圖4為病毒特異性檢測(cè)的實(shí)時(shí)濁度儀擴(kuò)增曲線圖5為樣本的實(shí)時(shí)濁度儀擴(kuò)增曲線圖6為RT-PCR檢測(cè)樣本結(jié)果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。所用無機(jī)化學(xué)試劑和有機(jī)試劑均符合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。引物由上海英駿技術(shù)公司合成AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Avian Myeloblastosis VirusReverse Transcriptase):普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司(Promega), cat. No. M5101。脫氧核糖核苷磷酸鹽混合物(dNTPs):普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司(Promega)，cat. No. U1515。BstDNA 聚合酶NEB (北京)有限公司，cat. No. M0275。RNA 提取試劑盒RNeasy Mini Kit, QIAgen 公司產(chǎn)品，Cat No. 74014。RNA 酶抑制劑(Ribonucleaseinhibitor):大連寶生物(TAKARA)公司產(chǎn)品，cat. No. D2310。Tris 鹽酸鹽(Tris-HCl)ρΗ8· 8 :Sigma 公司，cat. No. T9443。氯化鉀(KCl) :Sigma 公司，cat. No. P9514。硫酸鎂(MgSO4) :Sigma 公司，cat. No. M3409、硫酸銨((NH4)2SO4) :Sigma 公司，cat. No. A4418。吐溫20 (Tween20) :Sigma 公司，cat. No. P9416。甜菜喊(Betaine) :Sigma 公司，cat. No. B0300。氯化錳(MnCl2) :Sigma 公司，cat. No. M3634。鈣黃綠素Sigma 公司，cat. No. 17783。DMEM培養(yǎng)基上海英駿生物技術(shù)有限公司，Cat No.C11885。LA-320C實(shí)時(shí)濁度儀，日本榮研公司產(chǎn)品。下述實(shí)施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。西尼羅病毒Chin-Ol毒株記載在姜濤，鄧永強(qiáng)，范寶昌，等。西尼羅病毒Chin -Ol株基因組編碼區(qū)序列測(cè)定及分析。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊。2003.27(6) :401-403，公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲得，該所保證，可在符合國家和軍隊(duì)有關(guān)生物安全管理規(guī)定下，且經(jīng)相關(guān)部門批準(zhǔn)后向有資質(zhì)從事第二類病毒病原體以上的單位提供。實(shí)施例I、LAMP反應(yīng)鑒定西尼羅病毒 一、專用弓丨物的設(shè)計(jì)以及各個(gè)專用引物的制備根據(jù)西尼羅病毒病毒基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物序列如下，人工合成F3 (序列 I，引物 I) CTGTGACAGCAGCTAGTGC ；B3 (序列 2，引物 2) TTTTCACGCTCTGGTTGGTA ；FIP (序列 3，引物 3) TCTTCATTCGTGTGCCCCCCTTTTACGTGGACGCATCGGTAG ；BIP (序列 4，引物 4) GACTCGAACTTCGCCCATTGGATTTTAATTGAGCGATCAGTCCGTT ；LB (序列 5，引物 5) CTGAGGCACGAATCATGCTGGA ；二、病毒樣本的制備I、病毒樣本的制備西尼羅病毒Chin-Ol毒株的病毒液，通過蝕斑試驗(yàn)計(jì)算蝕斑滴度(蝕斑形成單位/毫升，PFU/ml)。使用DMEM培養(yǎng)基將病毒液進(jìn)行梯度稀釋，得到7種不同濃度的病毒液(濃度分別為 1000PFU/ml、1000PFU/ml、100PFU/ml、10PFU/ml、lPFU/ml、0. lPFU/ml 和 O. OlPFU/ml) ο2、病毒基因組RNA的提取(采用RNA提取試劑盒)將210 μ I病毒樣本加入I. 5ml離心管中，補(bǔ)加700 μ I RLT溶液和7 μ I β _巰基乙醇，振蕩混勻后加入490μ I無水乙醇，劇烈振蕩后分兩次加至硅膠柱中，進(jìn)行硅膠柱過濾。硅膠柱過濾將加樣后的硅膠柱10，OOOg離心15s ；加700 μ I Rffl緩沖液，10，OOOg離心15s ;用500 μ I RPE緩沖液離心洗硅膠柱兩次；將硅膠柱轉(zhuǎn)至新的離心管中，10，00(^離心21^11 ;將硅膠柱轉(zhuǎn)至新的離心管中，加入50 μ I無核酸酶水，室溫靜置2min，然后10，OOOg離心2min，收集洗脫液；在洗脫液中加入I μ I RNA酶抑制劑，即為待測(cè)RNA，-80°C保存。
將得到的7種病毒RNA作為7個(gè)樣本，用于下述檢測(cè)。樣本I :自濃度為10000PFU/ml的Chin-Ol病毒液提取的RNA。樣本2 自濃度為1000PFU/ml的Chin-Ol病毒液提取的RNA。樣本3 自濃度為100PFU/ml的Chin-Ol病毒液提取的RNA。樣本4 自濃度為10PFU/ml的Chin-Ol病毒液提取的RNA。樣本5 自濃度為lPFU/ml的Chin-Ol病毒液提取的RNA。樣本6 自濃度為O. lPFU/ml的的Chin-Ol病毒液提取的RNA。
樣本7 自濃度為0. 01PFU/ml的Chin-ΟΙ病毒液提取的RNA。三、專用引物應(yīng)用于西尼羅病毒的檢測(cè)用步驟一得到的專用引物甲檢測(cè)步驟二得到的待測(cè)樣品，分別在7個(gè)0. 2ml反應(yīng)管中進(jìn)行LAMP反應(yīng)。LAMP反應(yīng)體系25 μ I :F3和B3的濃度均為5pmol/L，BIP和FIP的濃度均為40pmol/L, LB 的濃度為 20pmol/L, AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 0. 004U/ μ L, Bst DNA 聚合酶 0. 32U/ μ L,鈣黃綠素50 μ mol/L, 12. 5ul的2X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液，2. 5 μ I待測(cè)RNA，無核酸酶和脫氧核酶的去離子水補(bǔ)足25 μ I ;以上濃度均為體系中的終濃度。2 X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液按照如下方法制備將氯化鉀(KCl)、硫酸鎂(MgSO4)、硫酸銨((NH4) 2S04)、吐溫20 (Tween-20)、甜菜堿(Betaine)、氯化錳(MnCl2)和脫氧核苷三磷酸混合物(dNTPs :dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP)溶于濃度為 40mmol/L、PH 值為 8. 8 的 Tris鹽酸鹽緩沖液得到；在所述2 X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液中，所述氯化鉀的濃度為20mmol/L，所述硫酸鎂的濃度為16mmol/L，所述硫酸銨的濃度為20mmol/L，所述吐溫20的濃度為0. 2% (質(zhì)量百分含量)，所述甜菜堿的濃度為1.6mol/L，所述氯化錳的濃度為lmmol/L，每種所述脫氧核苷三磷酸的濃度均為2. 8mmol/LoLAMP反應(yīng)體系在63°C反應(yīng)35min。恒溫反應(yīng)可按本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行，例如LA320C實(shí)時(shí)濁度儀，普通PCR儀、可控溫度水浴鍋等，終止反應(yīng)后，自然光下反應(yīng)管的照片見圖1A，I至7依次為樣本I至樣本7，陽性為黃綠色，陰性為橙黃色；可以看出，管I至管5 (即樣品I至樣品5)為陽性(黃綠色)，管6至管7 (即樣品6至樣品7)為陰性(橙黃色)。終止反應(yīng)后紫外燈照射下反應(yīng)管的照片見圖1B，I至7依次為樣本I至樣本7，陽性為黃綠色熒光，陰性無熒光；可以看出，管I至管5(即樣品I至樣品5)為陽性(黃綠色熒光)，管6至管7(即樣品6至樣品7)為陰性(無熒光)。采用肉眼觀察，自然光下或紫外光下檢測(cè)方法的靈敏度為lPFU/ml。待測(cè)RNA中病毒 RNA 的濃度=(lPFU/mlX200y I)/50 μ I = 0. 004PFU/ μ I。每個(gè) LAMP 反應(yīng)體系中病毒RNA 的含量=0. 004PFU/ μ 1X2. 5μ I = 0. 01PFU。即靈敏度為 0. 01PFU/ 反應(yīng)體系。采用紫外燈照射下觀察，檢測(cè)方法的靈敏度為0. 01PFU/反應(yīng)體系。四、專用引物應(yīng)用于西尼羅病毒的檢測(cè)(瓊脂糖電泳觀察)用步驟一得到的專業(yè)引物檢測(cè)步驟二得到的樣品I和樣品7待測(cè)RNA。LAMP反應(yīng)體系中可不加入鈣黃綠素，其它同步驟三的LAMP反應(yīng)體系。LAMP反應(yīng)體系在63°C反應(yīng)35min，然后75°C 2min終止反應(yīng)。
終止反應(yīng)后，取產(chǎn)物5μ I以Sca I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。取LAMP反應(yīng)產(chǎn)物
O.5μ I和酶切產(chǎn)物5μ I進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠濃度為2. 5%，電泳緩沖液為IXTris-硼酸(TBE)緩沖液，100V電泳40分鐘，紫外光源下觀察電泳結(jié)果。結(jié)果見圖2，泳道3和泳道4分別為樣品I的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物及其酶切產(chǎn)物，為陽性，LAMP產(chǎn)物可見典型梯度樣的條帶帶型(200bp-2000bp),經(jīng)酶切后僅可見2條條帶(244bp和164bp);泳道I和2分別為樣品7的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物及其酶切產(chǎn)物，為陰性，無典型梯度樣帶型。五、專用引物應(yīng)用于西尼羅病毒檢測(cè)(實(shí)時(shí)濁度儀)LAMP反應(yīng)體系同步驟三的LAMP反應(yīng)體系。將LAMP反應(yīng)體系置于LA320C實(shí)時(shí)濁度儀，63°C反應(yīng)35min，然后75°C 2min終止反應(yīng)。反應(yīng)體系中可不加入鈣黃綠素。
實(shí)時(shí)濁度儀擴(kuò)增曲線見圖3 (從上到下的曲線依次為樣本1-7)，樣本I至樣本5有特異的擴(kuò)增曲線，為陽性，樣本6和樣本7為陰性。濁度儀觀察的靈敏度為O. OlPFU/反應(yīng)體系。六、LAMP反應(yīng)特異性檢測(cè)用步驟一得到的專用引物檢測(cè)步驟二得到的樣本I (西尼羅病毒Chin-Ol毒株)RNA,以登革病毒2型43株,黃熱病毒17D株,蝶傳腦炎病毒(或稱森林腦炎病毒)Senzhang株，日本腦炎病毒(或稱流行性乙型腦炎病毒)SA14-14-2株為對(duì)照。上述病毒(均為100000PFU/ml)提取RNA后，采用本發(fā)明所述引物進(jìn)行LAMP反應(yīng)(方法與步驟四相同)，結(jié)果為圖4，僅西尼羅病毒Chin-Ol毒株反應(yīng)有擴(kuò)增曲線，結(jié)果呈陽性，其他病毒反應(yīng)均無明顯擴(kuò)增曲線為陰性，表明本發(fā)明所述引物均有良好的特異性。登革病毒2型43株記載在尉雁，姜濤，李曉峰，等?；诘歉?型病毒PrM基因的新型脫氧核酶對(duì)病毒RNA降解作用的初步觀察.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊.2007. 31 (I) =16-19,23 ;核酸數(shù)據(jù)庫登陸號(hào)AF204178。黃熱病毒17D 株記載在 Co MD, Kilpatrick ED, Rothman AL. Dynamics ofthe CD8T_cell response following yellow fever virus 17D immunization.Immunology. 2009. 128 (ISuppl) :e718_27 ;核酸數(shù)據(jù)庫登陸號(hào) X03700。蜱傳腦炎病毒Senzhang株記載在馬新英，司炳銀，高軒，等。我國森林腦炎病毒森張株編碼區(qū)序列測(cè)定。中國病毒學(xué)。2003.18(4) :322-325 ;核酸數(shù)據(jù)庫登陸號(hào)AY182009。日本腦炎病毒SA14-14-2株記載在李玉華，李海玲，吳永林，等。流行性乙型腦炎病毒活疫苗株SA14-14-2基因穩(wěn)定性研究。中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志。2003.23(11):858-861 ;核酸數(shù)據(jù)庫登陸號(hào)AF315119。上述病毒公眾均可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲得。該所保證，可在符合國家和軍隊(duì)有關(guān)生物安全管理規(guī)定且經(jīng)相關(guān)部門批準(zhǔn)后向有資質(zhì)從事第二類病毒病原體以上的單位提供。上述病毒均屬黃病毒屬，與西尼羅病毒為同科屬成員。實(shí)施例2、待檢樣品LAMP反應(yīng)檢測(cè)我國目前尚無西尼羅熱病例。本發(fā)明以小鼠感染模擬樣本代替，病毒感染方法記載在鄧永強(qiáng)，姜濤，等，實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)西尼羅病毒。中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志。2005.25(6) :519-522。具體方法為在動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室中，取4 6周齡雌性BALB/c小鼠(SPF級(jí)，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)18只，經(jīng)腹腔途徑注射西尼羅病毒Chin-Ol毒株100 μ I (105PFU/ml)，于感染后第6天取小鼠腦組織樣本，保存在_70°C備
用。 采用由實(shí)施例I步驟一獲得的專用引物分別對(duì)采集自編號(hào)1-18的感染西尼羅病毒Chin-Ol毒株的小鼠腦組織樣本進(jìn)行檢測(cè)，以實(shí)施例I步驟二的樣本2為陽性對(duì)照(+)，以樣本7為陰性對(duì)照(_)。分別將離體的感染西尼羅病毒Chin-Ol毒株小鼠腦組織樣本充分研磨后，用ImlDMEM培養(yǎng)基重懸，5000g離心10分鐘，取上清210 μ I，提取上清液的RNA (提取方法同實(shí)施例I的步驟二)，環(huán)等溫?cái)U(kuò)增方法同實(shí)施例I的步驟三。檢測(cè)結(jié)果見圖5，#1至#18為鼠腦樣本I至樣本18。可以看出，#12，#18和陽性對(duì)照有特異擴(kuò)增曲線，而其余樣本和陰性對(duì)照，無特異擴(kuò)增曲線為陰性。采用文獻(xiàn)(鄧永強(qiáng)，姜濤，等。實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)西尼羅病毒。中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志。2005. 25(6) 519-522)實(shí)時(shí) RT-PCR方法(上游引物為TGATCCATGTAAGCCCTCAGAA，下游引物為ACATTGGGCTTTGAAGTTACAACA，探針為5’ FAM-CGTCTCGGAAGGAGGACCCCA-3’ BHQ1，退火溫度為60°C )對(duì)#1至#18樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見圖6 (有明顯擴(kuò)增曲線的三條從上到下依次為陽性對(duì)照、#18、#12)，可以看出，#12,#18和陽性對(duì)照有特異擴(kuò)增曲線，為陽性。其余樣本和陰性對(duì)照無特異擴(kuò)增曲線，為陰性。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)西尼羅病毒的專用引物，包括引物I、引物2、引物3和引物4，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。
2.如權(quán)利要求I所述的專用引物，其特征在于所述專用引物還包括引物5，所述引物5的核苷酸序列為序列表的序列5。
3.如權(quán)利要求I或2所述的專用引物，其特征在于所述專用引物由所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5組成； 所述西尼羅病毒具體為西尼羅病毒Chin-Ol毒株。
4.一種檢測(cè)西尼羅病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑，包括RNA逆轉(zhuǎn)錄酶、Bst DNA聚合酶、2X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液、權(quán)利要求1-3所述的專用引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑，其特征在于 所述擴(kuò)增試劑還包括鈣黃綠素； 所述擴(kuò)增試劑由RNA逆轉(zhuǎn)錄酶、Bst DNA聚合酶、2X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液、權(quán)利要求1-3所述的專用引物和鈣黃綠素組成； 所述的專用引物中的引物I和引物2在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為5pmol/L ;所述的專用引物中的引物3和引物4在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為40pmo I/L ;所述的專用引物中的引物5在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為20pmol/L ； 所述RNA逆轉(zhuǎn)錄酶在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的濃度為O. 004U/y L ； 所述RNA逆轉(zhuǎn)錄酶具體為AMV逆轉(zhuǎn)錄酶； 所述Bst DNA聚合酶在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的濃度為O. 32U/ μ L ； 所述鈣黃綠素在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的濃度為50 μ mol/L ； 所述2X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液按照如下方法制備將將氯化鉀、硫酸鎂、硫酸銨、吐溫20、甜菜堿、氯化錳和dNTPs溶于濃度為40mmol/L、PH值為8. 8的Tris鹽酸鹽緩沖液得到； 在所述2X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液中，所述氯化鉀的濃度為20mmol/L，所述硫酸鎂的濃度為16mmol/L，所述硫酸銨的濃度為20mmol/L，所述吐溫20的濃度為O. 2% (質(zhì)量百分含量)，所述甜菜堿的濃度為I. 6mol/L，所述氯化錳的濃度為lmmol/L，每種所述dNTP的濃度均為 2. 8mmol/L0 所述西尼羅病毒具體為西尼羅病毒Chin-Ol毒株。
6.一種檢測(cè)西尼羅病毒的試劑盒，包括權(quán)利要求4或5所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑； 所述西尼羅病毒具體為西尼羅病毒Chin-Ol毒株。
7.權(quán)利要求1-3中任一所述專用引物或權(quán)利要求4或5所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或權(quán)利要求6所述的試劑盒在鑒定和/或輔助鑒定西尼羅病毒中的應(yīng)用； 所述西尼羅病毒具體為西尼羅病毒Chin-Ol毒株。
8.一種鑒定和/或輔助鑒定待測(cè)樣品中西尼羅病毒的方法，包括如下步驟 用權(quán)利要求1-3中任一所述專用引物或權(quán)利要求4或5所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或權(quán)利要求6所述的試劑盒中的所述專用引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物； 所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增中，以待測(cè)樣品的RNA為模板；所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為先60°C _65°C反應(yīng)35-60min，然后75°C 2min終止反應(yīng)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于 所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為先63°C反應(yīng)35min，然后75°C 2min終止反應(yīng)； 所述待測(cè)樣本為小鼠腦； 所述西尼羅病毒為西尼羅病毒Chin-Ol毒株。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于 所述檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的方法為如下I) _4)中的至少一種 1)觀察所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，若所述產(chǎn)物在自然光下為黃綠色，且在紫外光下有亮黃色熒光，則待測(cè)樣本中含有或者候選含有西尼羅病毒；若所述產(chǎn)物在自然光下為橙黃色，且在紫外光下無熒光，則待測(cè)樣本中不含有或者候選不含有西尼羅病毒； 2)用實(shí)時(shí)濁度儀檢測(cè)所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，若有特異擴(kuò)增曲線，則待測(cè)樣本中含有或者候選含有西尼羅病毒；若無特異擴(kuò)增曲線，則待測(cè)樣本中不含有或者候選不含有西尼羅病毒； 3)電泳檢測(cè)所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，得到梯度樣條帶的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，則待測(cè)樣本中含有或者候選含有西尼羅病毒；若環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物不為梯度樣條帶，則待測(cè)樣本中不含有或者候選不含有西尼羅病毒； 所述梯度樣條帶的大小為100bp-2000bp ； 4)用ScaI酶切所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，電泳檢測(cè)所述酶切產(chǎn)物，若所述酶切產(chǎn)物為，則待測(cè)樣本中含有或者候選含有西尼羅病毒；若所述酶切產(chǎn)物不為244bp和164bp的雙帶，則待測(cè)樣本中不含有或者候選不含有西尼羅病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)西尼羅病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的專用引物，包括引物1、引物2、引物3，引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的專用引物適用于對(duì)西尼羅病毒進(jìn)行特異性檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)只需在恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊設(shè)備；(2)特異性高；(3)快速高效，擴(kuò)增反應(yīng)在35分鐘內(nèi)即可完成；(4)靈敏度高；(5)鑒定方便簡單。本發(fā)明特別適用于臨床標(biāo)本和野外現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本的快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102952892SQ20111024123
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2011年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月22日
發(fā)明者秦成峰, 姜濤, 劉娟, 李曉峰, 鄧永強(qiáng), 秦鄂德 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所