專利名稱：聚乙二醇-聚乳酸-聚-l-賴氨酸共聚物、制備方法及作為基因或藥物載體的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腫瘤靶向遞送與緩釋給藥系統(tǒng)納米藥物制劑技術(shù)領(lǐng)域。具體是聚乙二醇-聚乳酸-聚-L-賴氨酸(PEG-PLA-PLL)陽離子聚合物、制備方法及作為基因或藥物載體在醫(yī)藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
臨床上應(yīng)用化療藥物治療惡性腫瘤在許多情況下獲得了一定的成功，但是，同時(shí)也存在著一些嚴(yán)重的問題。一個(gè)主要的問題是化療藥物普遍缺乏選擇性，導(dǎo)致嚴(yán)重的劑量依賴性毒副作用的產(chǎn)生，極大地限制了化療藥物的臨床治療效果。另一個(gè)問題是腫瘤細(xì)胞抗藥性的快速出現(xiàn)。因此，對于能特異性靶向腫瘤細(xì)胞并造成正常細(xì)胞最小損傷的治療方法的開發(fā)，具有非常重要的意義和廣闊的應(yīng)用前景。近幾十年來，靶向遞送載體由于其獨(dú)特的優(yōu)勢，能有效的提高治療效果，而備受國內(nèi)外關(guān)注。尤其以可生物降解的聚合物為載體的遞送系統(tǒng)得到的迅速的發(fā)展，靶向遞送載體可以有效的降低藥物的毒副作用，延遲藥物在體內(nèi)的代謝，改善治療效果。許多像聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸等生物降解材料已經(jīng)廣泛的被用做藥物、基因和成像試劑的遞送載體，取得了一定的效果。段友容等人發(fā)明了 “聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(簡稱 mPEG-PLGA-PLL)納米遞送系統(tǒng)、制備方法及其應(yīng)用”(CN 200910247576. 7) 0該專利公開了 mPEG-PLGA-PLL陽離子聚合物納米粒遞送系統(tǒng)的制備和其應(yīng)用，聚合物制備的載體納米?？捎糜谪?fù)載有機(jī)藥物、水溶性藥物、水不溶性抗癌藥物或用于診斷用的顯影劑等。多數(shù)納米載體在體內(nèi)未到達(dá)靶目標(biāo)前即被巨噬細(xì)胞識別吞噬，而達(dá)不到治療效果；由此國內(nèi)外許多學(xué)者，將聚乙二醇單甲醚(mPEG)附著在載體的表面，mPEG的長鏈能使納米載體有效的逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，從而達(dá)到長循環(huán)的目的，并且取得了較好的治療效果。可降解聚合物聚乳酸(PLA)，在體內(nèi)可以緩慢降解，可以使藥物隨材料的降解被緩慢釋放出來，從而達(dá)到較長時(shí)間的治療效果。陽離子多聚物聚左旋賴氨酸PLL，生物相容性好，降解產(chǎn)物為人體所必需的氨基酸。多聚左旋賴氨酸復(fù)合物仍帶正電荷，其結(jié)構(gòu)靈活、穩(wěn)定、易調(diào)整其分子量，可以通過引入側(cè)鏈和特異靶向性基團(tuán)來修飾多聚物骨架，進(jìn)而調(diào)整和改善載體的性能，達(dá)到緩釋藥物的目的。將PLA和PLL結(jié)合可以發(fā)揮兩者的優(yōu)點(diǎn)。因此以聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-聚-L-賴氨酸(mPEG-PLA-PLL)陽離子聚合物為骨架的納米給藥系統(tǒng)是一種非常優(yōu)異的緩釋藥物載體。給藥系統(tǒng)的靶向能力是將活性物質(zhì)準(zhǔn)確遞送至靶點(diǎn)的關(guān)鍵，以聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-聚-L-賴氨酸(mPEG-PLA-PLL)陽離子聚合物為骨架的納米給藥系統(tǒng)可以很好的解決這個(gè)問題。研制的納米載體系統(tǒng)直徑可保持在Inm-lOOOOnm。因?yàn)檎＝M織周圍的血管沒有縫隙，而腫瘤組織周圍的血管有IOOnm左右的縫隙，所以納米粒子就會從這些縫隙中滲透出來，并利用增強(qiáng)的滲透保留效應(yīng)聚集于腫瘤部位，然后攻擊癌細(xì)胞，但不會損害正常細(xì)胞，從而達(dá)到被動(dòng)靶向的效果。將納米粒采用靶向基團(tuán)修飾后，靶向基團(tuán)可以與靶點(diǎn)特異性結(jié)合，具有受體介導(dǎo)的靶向給藥系統(tǒng)形成的主動(dòng)靶向效應(yīng)，使抗腫瘤藥物比較準(zhǔn)確送到腫瘤細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤的靶向治療。采用本發(fā)明所設(shè)計(jì)的以聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-聚-L-賴氨酸(mPEG-PLA-PLL)陽離子聚合物為骨架的納米給藥系統(tǒng)，可以同時(shí)連接靶向基團(tuán)和包裹兩種以上的活性物質(zhì)從而達(dá)到靶向遞送、多重治療方式結(jié)合的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種聚乙二醇-聚乳酸-聚-L-賴氨酸(PEG-PLA-PLL)陽離子聚合物，是以聚乙二醇-聚乳酸-聚-L-賴氨酸(PEG-PLA-PLL)陽離子聚合物為骨架的納米給藥載體系統(tǒng)。PEG有長循環(huán)功效，聚乳酸PLA可生物降解有緩控釋功效，聚左旋賴氨酸 PLL帶正電荷可以介導(dǎo)與負(fù)電荷的基因結(jié)合。通過控制載體粒徑大小可使載體具有被動(dòng)靶向的功能。通過引入側(cè)鏈和特異靶向性基團(tuán)來修飾多聚物骨架，進(jìn)而調(diào)整和改善載體的性能，可使載體具有主動(dòng)靶向的功能。這種載體材料還具有運(yùn)送活性物質(zhì)、腫瘤治療與診斷、 超聲顯影、逆轉(zhuǎn)或降低耐藥等功能。本發(fā)明的目的還提供一種上述聚乙二醇-聚乳酸-聚-L-賴氨酸(PEG-PLA-PLL) 陽離子聚合物的制備方法。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供上述聚乙二醇-聚乳酸-聚-L-賴氨酸 (PEG-PLA-PLL)陽離子聚合物的應(yīng)用。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于合成合適的載體，使不同的靶向基團(tuán)能有效地嫁接在載體上，并且包載活性物質(zhì)，從而有效的將活性物質(zhì)靶向遞送到靶點(diǎn)。本發(fā)明所述的陽離子聚合物mPEG-PLA-PLL為一系列不同分子量、不同單體比例的材料，其mPEG-PLA-PLL聚合物分子量為1. 2 X IO3-IO. 0 X IO8道爾頓，優(yōu)選的分子量范圍為2. OX IO3-S. OX IO8;所述的聚乙二醇，聚乳酸和聚-L-賴氨酸的摩爾比為 0.1-50 0.1-100 1-100，優(yōu)化的比例為 5-20 10-45 15-65。本發(fā)明所述的聚乙二醇和聚乳酸的摩爾比為1-50 1-100，優(yōu)化的比例為 5-25 15-60 ；所述的聚乙二醇-聚乳酸和聚-L-賴氨酸的摩爾比為1-50 1_100，優(yōu)化的比例為5-25 60-15。本發(fā)明所述的聚合物材料mPEG-PLA-PLL的合成方法是采用開環(huán)聚合法。合成所用的催化劑包括辛酸亞錫、乳酸鋅、氯化亞錫或?qū)妆交撬岬取１景l(fā)明所述的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-聚-L-賴氨酸(mPEG-PLA-PLL)的合成方法具有如下5個(gè)步驟。(1)聚乙二醇單甲醚-聚乳酸的制備在真空的玻璃管中、100 250°C和催化劑存在下，聚乙二醇單甲醚和丙交酯反應(yīng) 2 100小時(shí)，聚乙二醇單甲醚占原料總量質(zhì)量百分比為 50%，所述的聚乙二醇單甲醚分子量為100 20000，催化劑占原料總質(zhì)量的百分比為0. 0001 催化劑，所述的催化劑是辛酸亞錫、乳酸鋅、氯化亞錫或?qū)妆交撬帷?2)聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-[(N-叔丁氧羰基)-L_苯丙氨酸]的制備在有機(jī)溶劑中、氮?dú)獗Ｗo(hù)和室溫下，步驟⑴的產(chǎn)物、叔丁氧基羰基-L-苯丙氨酸、 N，N-二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶反應(yīng)0.5 5天；所述的步驟(1)的產(chǎn)物、N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸、N，N-二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶的摩爾比為1 0.01 30 0. 01 30 0. 01 30。(3)聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-L-苯丙氨酸的制備在有機(jī)溶劑中、氮?dú)獗Ｗo(hù)和-20°C 40°C溫度下，步驟( 的產(chǎn)物和三氟乙酸反應(yīng) 0. 1 M小時(shí)，所述的步驟O)的產(chǎn)物和三氟乙酸的摩爾比為1 0. 01 30。(4)聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-[(N-芐氧羧基)_聚-L-賴氨酸]的制備有機(jī)溶劑中、氮?dú)獗Ｗo(hù)和室溫下，步驟的產(chǎn)物和氨基酸環(huán)內(nèi)酸酐反應(yīng)1 6 天，所述的驟的產(chǎn)物和氨基酸環(huán)內(nèi)酸酐的摩爾比為1 0.01 100。(5)聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-聚(L-賴氨酸)的制備步驟的產(chǎn)物和定量33%的氫溴酸-冰乙酸溶液在0°C反應(yīng)0. l-24h ；所述的步驟⑷的產(chǎn)物、33%的氫溴酸-冰乙酸溶液的摩爾比為1 0.01 100。本發(fā)明所述的聚合物mPEG-PLA-PLL是一種優(yōu)良的基因或藥物載體，可以用于制備抗腫瘤藥物制劑。利用這種材料包裹基因或藥物，在機(jī)械攪拌、超聲、高壓乳勻機(jī)作用下制備緩釋納米粒，粒徑在Inm-IO μ m以下可控(優(yōu)選為IOnm-IOOOnm)，表面光滑，均勻度好， 顆粒規(guī)則無粘連，再分散性好，載藥量和包封率高，可用于制備靜脈或肌肉注射或口服給藥的緩釋納米粒。制備的納米粒可以分散在固體、半固體或溶液中。優(yōu)選的是制成注射給藥的藥物制劑形式，尤其是供靜脈注射用。本發(fā)明所述的與可以與聚合物mPEG-PLA-PLL連接的靶向基團(tuán)，包括腫瘤血管生成抑制肽；抗腫瘤血管生成的因子如成纖維生長因子(FGFs)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)； 以及多肽、葉酸、抗體、轉(zhuǎn)鐵蛋白、糖、聚山梨酯等活性基團(tuán)，甘草酸、甘草次酸、膽酸、低密度脂蛋白(LDL)、激素、核酸等所有具有可用于修飾的適宜官能團(tuán)的靶向基團(tuán)及其衍生物。所用的RGD肽是含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的任何直鏈或環(huán)狀多肽片段，包括含RGD 序列的三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽和十肽，或含R⑶類似物(RGDm)的直鏈或環(huán)狀多肽片段；所用的抗體包括表皮生長因子受體(EGFR)、人表皮生長因子(hrEGF)等多種抗體；糖類包括半乳糖、殼聚糖、甘露聚糖、膠淀粉、支鏈淀粉和葡萄聚糖等；靶向基團(tuán)的接枝率為 0. 0001% -50% O本發(fā)明所述的包載的活性物質(zhì)包括藥物、基因、診斷用顯影劑、微泡內(nèi)容性氣體、 探針。藥物包括任何適合制成納米粒給藥系統(tǒng)的抗腫瘤藥物，可為有機(jī)藥物、水溶性藥物或水不溶性藥物抗癌藥，如抗葉酸類(如甲氨蝶呤)、抗嘌呤類(如巰嘌呤)、抗嘧啶類(如氟尿嘧啶、替加氟)、核苷酸還原酶抑制藥(如羥基脲)、脫氧核糖核苷酸多聚酶抑制藥(如環(huán)胞苷)、直接影響和破壞DNA結(jié)構(gòu)及其功能的藥物(如氮芥、環(huán)磷酰胺、氮甲、順鉬、絲裂霉素、喜樹堿)、抑制蛋白質(zhì)合成的藥(如阿霉素、L-門冬酰胺酶、柔紅霉素、光輝霉素)、影響微管蛋白質(zhì)組裝和紡錘絲形成的藥物(長春新堿、依托泊苷)和用于核磁成像、超聲或CT 等成像儀器所用的顯影劑活性藥物或診斷試劑，診斷試劑分為用于超聲、核磁共振、CT和 PET的診斷試劑。基因包括siRNA、microRNA、自殺基因、抑癌基因、反義核酸等用于治療的基因；微泡內(nèi)容性氣體包括空氣、氟碳?xì)怏w、六氟化硫等用于超聲微泡顯影劑。本發(fā)明所述的聚合物載體包載微泡內(nèi)容性氣體后可用于超聲顯影，實(shí)體腫瘤定位并且通過超聲空化效應(yīng)輔助腫瘤治療。本發(fā)明所述的以聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-聚-L-賴氨酸(mPEG-PLA-PLL)聚合物為骨架的納米給藥系統(tǒng)，可以同時(shí)連接至少一種或一種以上的不同靶向基團(tuán)修飾或/和載至少一種或一種以上的不同的活性物質(zhì)從而達(dá)到靶向遞送、藥物和基因的共治療、多重治療方式結(jié)合的目的。本發(fā)明所述的PEG-PLA-PLL聚合物為骨架的載基因或藥物微納米粒系統(tǒng)，可以通過以下制備方法制備采用復(fù)乳法制備，取^ig材料mPEG-PLA-PLL溶于200 μ L 二氯甲烷或乙酸乙酯或二氯甲烷和丙酮的混合溶劑中，加入0. 2mg藥物溶液，超聲乳化，再加入2. 2mL濃度為的普朗尼克F68水分散介質(zhì)中，再次超聲乳化。然后室溫下攪拌0. 5-5h除去有機(jī)相，即得納米粒溶液。采用薄膜乳化法制備，取^ig材料mPEG-PLA-PLL和0. 2mg藥物溶于400 μ L三氯甲烷或丙酮溶劑中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，隨后加入4mL的水溶液，室溫下攪拌0. 5-6h，即得納米粒溶液。采用透析法制備，取^ig材料mPEG-PLA-PLL溶于200 μ L 二甲亞砜溶劑中，加入 0. 4mg藥物，將攪拌均勻的溶液在攪拌的條件下滴入2mL水中，之后將溶液裝入透析袋(截留分子量為7000)中透析3-72小時(shí)，除去有機(jī)溶劑，即得納米粒溶液。采用乳化蒸發(fā)法制備，取^ig材料mPEG-PLA-PLL和0. 2mg藥物溶于400 μ L三氯甲烷或丙酮和二氯甲烷的混合溶劑中，加入2. 2mL濃度為2%的含聚乙烯醇(PVA)的水分散介質(zhì)中，超聲或高壓乳勻乳化，乳液在室溫下攪拌2-4h，揮盡有機(jī)溶劑，即得納米粒溶液。采用界面沉淀法制備，取^ig材料mPEG-PLA-PLL和0. 2mg藥物溶于400 μ L丙酮溶劑中，在不斷的攪拌條件下，將上述溶液注入2. 2mL的濃度為2 %的PVA水分散介質(zhì)中，加壓揮發(fā)去除丙酮，即得納米粒溶液。采用自組裝法制備，取^ig材料mPEG-PLA-PLL溶于200 μ L水或乙醇溶液中，加入 0. 4mg藥物，將攪拌均勻的溶液在攪拌的條件下滴入2mL水中，之后將溶液裝入透析袋(截留分子量為7000)中透析3-72小時(shí)，除去有機(jī)溶劑；即得納米粒溶液。同時(shí)還可將包載不同藥物的納米遞送載體制備成不同類型的膠囊劑、片制劑、丸劑、散劑、顆粒劑、滴丸劑和膜劑等。本發(fā)明所述的PEG-PLA-PLL納米給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于所用的材料是 PEG-PLA-PLL，其摩爾濃度為 0. 001-10000Mo本發(fā)明所述的PEG-PLA-PLL納米給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于所包裹的藥物是基因或抗腫瘤化療藥物，其摩爾濃度為0. 001-10000 μ Μ。本發(fā)明所述的PEG-PLA-PLL納米給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于所用的超聲強(qiáng)度，其范圍為10-1000W。本發(fā)明所述的PEG-PLA-PLL納米給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于所用的透析袋截留分子量，其范圍為100-10000。本發(fā)明所述的PEG-PLA-PLL納米給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于所述的水分散介質(zhì)為右旋糖苷40，右旋糖苷70、普朗尼克F68或聚乙烯醇PVA等各種適合于制備納米粒的表面活性劑，分散介質(zhì)濃度為0. 01-20% (w/v)。本發(fā)明所述的PEG-PLA-PLL納米給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑包括乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙醇、二甲亞砜和二甲基甲酰胺等各種適合于制備納米粒的有機(jī)溶劑。
本發(fā)明所述的PEG-PLA-PLL納米遞送系統(tǒng)的制備方法，其特征在于可以制備成凍干劑保存和應(yīng)用，凍干支架劑包括海藻糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、右旋糖苷、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇等，支架劑含量為0.01-20% (w/v) 0本發(fā)明制備方法簡便，適于大規(guī)模生產(chǎn)，特別適應(yīng)于制備具有長循環(huán)、可生物降解、緩控釋、被動(dòng)靶向、主動(dòng)靶向、運(yùn)送活性物質(zhì)和抗腫瘤的藥物。采用本發(fā)明的方法獲得的抗腫瘤的藥物適合于靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、口服或經(jīng)皮給藥等方式。


圖ImPEG-PLA-PLL材料的凝膠滲透色譜(GPC)測試2粒徑分布圖siRNA_mPEG_PLA_PLL 納米粒(A)、microRNA_mPEG_PLA_PLL 納米粒(B)、DNA-mPEG-PLA-PLL-La 納米粒(C)、siRNA+DHAQ-mPEG-PLA-PLL-Fa (D)、 ADM-mPEG-PLA-PLL-G1u(E)、 DHAQ-mPEG-PLA-PLL 納米粒(F)、 I^aclitaxel-mPEG-PLA-PLL-EGFRab 纟內(nèi)米粒(G)、Cisplatin mPEG-PLA-PLL-hrEGF 納米粒(H)、Bufalin-mPEG-PLA-PLL-cRGD(I)、5Fu-mPEG-PLA-PLL-cRGD 纟內(nèi)米粒(J)、 CyS-siRNA-mPEG-PLA-PLL-I^rf納米粒(K)粒徑分布圖和圖A-K的柱狀圖(L)。圖3對不同腫瘤細(xì)胞的基因干擾圖siRNA-mPEG-PLA-PLL 納米粒(A)對 U937 白血病細(xì)胞、 ADM+siRNA-mPEG-PLA-PLL-La 納米粒(B) X^t 7721 肝癌細(xì)胞、siRNA-mPEG-PLA-PLL-EGFRab 納米粒(C)對MCF-7乳腺癌細(xì)胞和microRNA-mPEG-PLA-PLL-PSAab納米粒(D)對PC-3前列腺癌細(xì)胞的基因干擾圖。圖4對荷A549肺癌裸鼠的靶向測試分析實(shí)驗(yàn)注射 Cy 5-mi croRNA-mPEG-PLA-PLL-cRGD 納米粒(A)、 Cy5-microRNA-mPEG-PLA-PLL-EGFRab 納米粒(B)和 Cy5-microRNA-mPEG-PLA-PLL_Fa 納米粒(C) 24h時(shí)對荷A549肺癌裸鼠的靶向測試分析圖片。圖5Cy5-siRNA+DHAQ-mPEG-PLA-PLL在荷SW620腸癌裸鼠體內(nèi)靶向測試分析實(shí)驗(yàn)。圖6Cy5-siRNA-mPEG-PLA-PLL-La在荷PLC肝癌裸鼠體內(nèi)靶向測試分析實(shí)驗(yàn)。圖7Cy5-DNA-mPEG-PLA-PLL/Cap在荷MDA-MB-231乳腺癌裸鼠體內(nèi)靶向測試分析實(shí)驗(yàn)。圖 8siRNA-mPEG-PLA-PLL-Fa 納米粒(A)對荷 AM9 肺癌裸鼠、 DHAQ+siRNA-mPEG-PLA-PLL-EGFRab 纟內(nèi)米粒(B)對荷 MDA-MB-231 乳腺癌裸鼠、 microRNA-mPEG-PLA-PLL-RGD 納米粒(C)對荷 U937 白血病裸鼠、5Fu-mPEG-PLA-PLL_Trf 納米粒(D)對荷PLC肝癌裸鼠、ADM-mPEG-PLA-PLL-La納米粒(E)對荷H印G2肝癌裸鼠、 siRNA-mPEG-PLA-PLL-cRGD 納米粒(F)對荷 PC-3 前列腺癌裸鼠和 siRNA-mPEG-PLA-PLL-La 納米粒(G)對荷HepG2肝癌裸鼠的腫瘤生長曲線圖。符號說明圖1中CPC代表凝膠滲透色譜，Mv代表粘均分子量，Mz代表Z均分子量，Mn代表數(shù)均分子量，Mw代表重均分子量；圖2中Diam代表粒徑，NPs代表納米粒(nanoparticles)，DHAQ代表藥物米托蒽醌，ADM(Doxorubicin)代表阿霉素，Paclitaxel代表紫杉醇，Cisplatin代表順鉬，5Fu代表5-氟尿嘧啶，Rb代表羅丹明B，F(xiàn)a代表葉酸，Glu代表半乳糖，EGFRab代表表皮生長因子受體抗體，La代表乳糖酸，Glu代表半乳糖，cRGD(RGD)代表精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸環(huán)肽。 圖3中PSAab代表前列腺特異性抗原抗體圖4中a. U.代表任意單位(Arbitrary Unit)，Cy5_siRNA代表熒光染料Cy5標(biāo)記的siRNA，24h代表24小時(shí)。圖7中Cy5_DNA代表熒光染料Cy5標(biāo)記的DNA，CaP代表磷酸鈣。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明描述了用于藥物/基因遞送載體以及制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明并不限于本文所公開的具體的構(gòu)型、方法步驟和物質(zhì)，因?yàn)檫@樣的構(gòu)型、方法和物質(zhì)可以多少發(fā)生變化。本文所使用的術(shù)語僅僅是用于描述具體實(shí)施方案的目的并且并不打算進(jìn)行限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將僅僅受到所附權(quán)利要求及其等同內(nèi)容的限制。說明書和所附權(quán)利要求書，除非上下文另外清楚地加以描述，單數(shù)形式的“一種” 和“所述”均包括復(fù)數(shù)的相應(yīng)內(nèi)容。下面以實(shí)施例對本發(fā)明加以進(jìn)一步的說明，但是不限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1、 聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-聚-L-賴氨酸(mPEG-PLA-PLL)的合成(1)聚乙二醇單甲醚-聚乳酸的制備抽真空加熱干燥耐熱玻璃管，先加入17. 28g 丙交酯，隨后加入占原料總量質(zhì)量百分比為10%、分子量為I的mPEG，再加入乳酸鋅催化劑，通氮?dú)?，加熱溶解抽真空，冷卻固化抽真空2小時(shí)后封管，150°C反應(yīng)40小時(shí)。抽真空加熱干燥耐熱玻璃管，先加入30. 24g丙交酯，隨后加入占原料總量質(zhì)量百分比為20%、分子量為^iWmPEG,再加入乳酸鋅催化劑，通氮?dú)猓訜崛芙獬檎婵眨鋮s固化抽真空2小時(shí)后封管，120°C反應(yīng)5天。(2)聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸的制備取6g mPEG-PLA溶于干燥有機(jī)溶劑，攪拌加入1. 06g叔丁氧羰基_L_苯丙氨酸、 0. 83g 1，3-二環(huán)己基碳二亞胺，0.08g 4-二甲氨基吡啶，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫?cái)嚢?天，過濾，飽和碳酸氫鈉溶液和水各洗滌3次，收集有機(jī)相，無水硫酸鎂干燥，濃縮，加冰乙醚沉淀出產(chǎn)物，過濾，真空干燥。(3)聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-叔丁氧氨基-L-苯丙氨酸的制備取2.6g上述⑵產(chǎn)物溶于干燥有機(jī)溶劑中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，0°C攪拌滴加5.2ml干燥的三氟乙酸，滴加30分鐘，繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，旋蒸去除溶劑與未反應(yīng)三氟乙酸，殘?jiān)苡谟袡C(jī)溶劑，飽和碳酸氫鈉溶液和水各洗滌3次，收集有機(jī)相，無水硫酸鎂干燥，濃縮，冰乙醚沉淀，過濾，真空干燥。(4)聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-帶保護(hù)基的聚-L-賴氨酸的制備取2g上述C3)產(chǎn)物溶于干燥有機(jī)溶劑中，加入1. 6g氨基酸環(huán)內(nèi)酸酐(NCA)，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫反應(yīng)3天，濃縮，冰乙醚沉淀，過濾，真空干燥。(5)聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-聚-L-賴氨酸(mPEG-PLA-PLL)的制備取Ig上述的產(chǎn)物溶于3ml三氟乙酸中，加入5ml體積分?jǐn)?shù)為33%的氫溴酸(HBr)醋酸溶液，0°C反應(yīng)1小時(shí)，冰乙醚沉淀，過濾，真空干燥。(凝膠滲透色譜(GPC)測試見圖1)(6)含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGD)環(huán)肽的接枝取400mg mPEG-PLA-PLL 溶于二甲亞砜中，隨后加入 46mg cRGD 和 27mg N，N"-羰基二咪唑(CDI)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后將溶液置于透析袋中透析 24小時(shí)得mPEG-PLA-PLL-cRGD，隨后凍干保存。(7)葉酸(Fa)的接枝取1 溶于二甲亞砜中，加入0. Ig共聚物mPEG-PLA-PLL，再加入30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)4小時(shí)。去離子水透析，凍干得到mPEG-PLA-PLL-Fa，密封、備用。(8)表皮生長因子受體抗體(EGFRab)的接枝將5mgEGFRab溶于二甲基甲酰胺中，加入20mg⑶I攪拌，然后加入0. Ig 共聚物mPEG-PLA-PLL，氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)4小時(shí)，之后透析，然后凍干得到 HiPEG-PLA-PLL-EGFRab，密封、備用。(9)前列腺特異性抗原抗體(PSAab)將5mgPSAab溶于二甲亞砜中，加入20mg EDC和20mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)攪拌，然后加入0. 5g共聚物mPEG-PLA-PLL，氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)M小時(shí)，之后透析，然后凍干得到 HiPEG-PLA-PLL-PSAab，密封、備用。(10)人表皮生長因子(hrEGF)將!3mg hrEGF溶于二甲基甲酰胺中，加入20mg EDC和20mg N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)攪拌，然后加入0. 5g共聚物mPEG-PLA-PLL，氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)M小時(shí)，之后透析， 然后凍干得到mPEG-PLA-PLL-hrEGF，密封、備用。(11)鐵蛋白(Trf)的接枝將aiigTrf溶于二甲亞砜或二甲基甲酰胺中，加入IOmg EDC和IOmg N-羥基琥珀酰亞胺(MB)攪拌，然后加入共聚物0. Ig mPEG-PLA-PLL，氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)4小時(shí)，之后透析，然后凍干得到mPEG-PLA-PLL-Trf，密封、備用。(12)半乳糖(Glu)的接枝將^ig Glu溶于二氯甲烷和甲醇的混合液中，加入18mg⑶I攪拌，然后加入共聚物0. 3g mPEG-PLA-PLL,氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)M小時(shí)，冰乙醚沉淀，然后凍干沉淀物得到 mPEG-PLA-PLL-Glu,密封、備用。(13)乳糖酸(La)的接枝將％^ La溶于二氯甲烷和丙酮中，加入18mg EDC和IOmg N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)或CDI攪拌，然后加入共聚物0. 3g mPEG-PLA-PLL,氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)M小時(shí)，之后透析，然后凍干得到mPEG-PLA-PLL-La，密封、備用。或?qū)ig La溶于二甲亞砜中，加入 20mg N, N"-羰基二咪唑(⑶I)，攪拌，然后加入共聚物0.3gmPEG-PLA-PLL，氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)M小時(shí)，之后透析，然后凍干得到mPEG-PLA-PLL-La，密封、備用。實(shí)施例2、包載siRNA的mPEG-PLA-PLL納米粒的制備采用復(fù)乳法制備，取4mg或20mg材料mPEG-PLA-PLL溶于200 μ L或1000 μ L 二氯甲烷或乙酸乙酯或二氯甲烷和丙酮的混合溶劑中，加入0. 2nmoL或4nmoL siRNA溶液，超聲乳化(300W或500W, IOs X 4)，再加入2. 2mL或6mL濃度為0. 5 %或2 %的普朗尼克F68水分散介質(zhì)中，再次超聲乳化(300W或500W，IOs X 4)。然后室溫下攪拌0. 5-5h除去有機(jī)相，即得粒徑為I-IOOOOnm的納米粒溶液。采用薄膜乳化法制備，取4mg或20mg材料mPEG-PLA-PLL和0. 2nmoL或4nmoLsiRNA 溶于400 μ L或2000 μ L丙酮或乙醇溶劑中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，隨后加入4mL或12mL的水溶液， 室溫下攪拌0. 5-6h，即得粒徑為I-IOOOOnm的納米粒溶液(圖2-A)。采用透析法制備，取4mg或20mg材料mPEG-PLA-PLL溶于200 μ L 二甲亞砜或二甲基甲酰胺溶劑中，加入0. 4nmoL或者6nmoL siRNA，將攪拌均勻的溶液在攪拌的條件下滴入 2mL或IOmL水中，之后將溶液裝入透析袋(截留分子量為7000)中透析3_72小時(shí)，除去有機(jī)溶劑，即得粒徑為I-IOOOOnm的納米粒溶液。采用乳化蒸發(fā)法制備，取^ig或20mg材料mPEG-PLA-PLL和0. 2nmoL或4nmoL siRNA溶于400 μ L或2000 μ L三氯甲烷或丙酮和二氯甲烷的混合溶劑中，加入2. 2mL或 44mL濃度為0.5%或2%的含聚乙烯醇(PVA)的水分散介質(zhì)中，超聲或高壓乳勻乳化，乳液在室溫下攪拌2或4h，揮盡有機(jī)溶劑，即得粒徑為I-IOOOOnm的納米粒溶液。采用界面沉淀法制備，取^ig或20mg材料mPEG-PLA-PLL和0. 2nmoL或4nmoL siRNA溶于400 μ L或2000 μ L丙酮溶劑中，在不斷的攪拌條件下，將上述溶液注入2. 2mL 或44mL的濃度為0. 5 %或2 %的PVA水分散介質(zhì)中，加壓揮發(fā)去除丙酮，即得粒徑為 I-IOOOOnm的納米粒溶液液。采用自組裝法制備，取4mg或20mg材料mPEG-PLA-PLL溶于200 μ L或1000 μ L水或乙醇溶液中，加入0. 4nmoL或8nmoL siRNA，將攪拌均勻的溶液在攪拌的條件下滴入2mL 或者IOmL水中，之后將溶液裝入透析袋(截留分子量為3000或7000)中透析3或72小時(shí)， 除去有機(jī)溶劑；即得粒徑為I-IOOOOnm的納米粒溶液。同時(shí)還可將包載siRNA的納米遞送載體制備成不同類型的膠囊劑、片制劑、丸劑、 散劑、顆粒劑、滴丸劑和膜劑等。實(shí)施例3、包載microRNA的mPEG-PLA-PLL納米粒的制備采用復(fù)乳法制備，取4mg或20mg材料mPEG-PLA-PLL溶于200 μ L或1000 μ L 二氯甲烷或乙酸乙酯或二氯甲烷和丙酮的混合溶劑中，加入0. 2nmoL或4nmoL siRNA溶液，超聲乳化(300W或500W, IOs X 4)，再加入2. 2mL或6mL濃度為0. 5 %或2 %的普朗尼克F68水分散介質(zhì)中，再次超聲乳化(300W或500W，IOs X 4)。然后室溫下攪拌0. 5-5h除去有機(jī)相，即得粒徑為I-IOOOOnm的納米粒溶液。采用薄膜乳化法制備，取^ig或20mg材料mPEG-PLA-PLL和0. 2nmoL或4nmoL siRNA溶于400 μ L或2000 μ L丙酮或乙酸乙酯溶劑中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，隨后加入4mL或12mL 的水溶液，室溫下攪拌0. 5-6h，即得粒徑為I-IOOOOnm的納米粒溶液。采用透析法制備，取^ig或2011^材料mPEG-PLA-PLL溶于200 μ L二甲亞砜溶劑中， 加入0. 4nmoL或者6nmoL siRNA,將攪拌均勻的溶液在攪拌的條件下滴入2mL或IOmL水中， 之后將溶液裝入透析袋(截留分子量為7000)中透析3-72小時(shí)，除去有機(jī)溶劑，即得粒徑為I-IOOOOnm的納米粒溶液(圖2-B)。采用乳化蒸發(fā)法制備，取^ig或20mg材料mPEG-PLA-PLL和0. 2nmoL或4nmoL siRNA溶于400 μ L或2000 μ L三氯甲烷或丙酮和二氯甲烷的混合溶劑中，加入2. 2mL或44mL濃度為0.5%或2%的含聚乙烯醇(PVA)的水分散介質(zhì)中，超聲或高壓乳勻乳化，乳液在室溫下攪拌2或4h，揮盡有機(jī)溶劑，即得粒徑為I-IOOOOnm的納米粒溶液。采用界面沉淀法制備，取^ig或20mg材料mPEG-PLA_PLL和0. 2nmoL或4nmoL siRNA溶于400 μ L或2000 μ L丙酮溶劑中，在不斷的攪拌條件下，將上述溶液注入2. 2mL 或44mL的濃度為0. 5 %或2 %的PVA水分散介質(zhì)中，加壓揮發(fā)去除丙酮，即得粒徑為
1-IOOOOnm的納米粒溶液液。采用自組裝法制備，取^ig或20mg材料mPEG-PLA_PLL溶于200 μ L或1000 μ L 水或乙醇溶液中，加入0. 4nmoL或8nmoL siRNA,將攪拌均勻的溶液在攪拌的條件下滴入2mL或者IOmL水中，之后將溶液裝入透析袋(截留分子量為3000或7000)中透析3 或72小時(shí)，除去有機(jī)溶劑；即得粒徑為I-IOOOOnm的納米粒溶液。實(shí)施例4、包載DNA的 mPEG-PLA-PLL-La納米粒的制備采用乳化蒸發(fā)法制備取8mg mPEG-PLA-PLL-La溶于400 yL 二氯甲烷或乙酸乙酯中，加入4.4mL的F68水溶液中超聲。然后室溫下攪拌3小時(shí)除去有機(jī)相，得mPEG-PLA-PLL納米粒溶液。將適量的mPEG-PLA-PLL-La納米粒溶液在充分?jǐn)嚢柘轮鸬渭尤氲润w積的質(zhì)粒DNA溶液中，低溫孵育30min，即得到載DNA基因的納米粒 (DNA-mPEG-PLA-PLL-La)。復(fù)乳-液中干燥法亦稱溶劑揮發(fā)法，即將基因溶解于水作為內(nèi)水相， 8mgmPEG-PLA-PLL-La溶解于400 μ L三氯甲烷作為油相，兩者超聲后，形成油包水(W/0)的初乳，然后倒入4mL濃度為2wt%聚乙烯醇水溶液，再次乳化成水包油包水的復(fù)乳(W/0/W)， 攪拌蒸去有機(jī)溶劑固化微球，離心洗滌，真空干燥后以60Co輻照滅菌(圖2-C)。實(shí)施例5、包載SiRNA和DHAQ的mPEG-PLA-PLL_Fa納米粒的制備采用乳化蒸發(fā)法制備取8mg mPEG-PLA-PLL- 溶于400μL二氯甲烷或三氯甲烷溶劑中，加入40μ L濃度為lOmg/mL的鹽酸米托蒽醌(DHAQ)的水溶液，超聲乳化后，再加入 4. 4mL 的F68水溶液中，再次超聲。然后室溫下攪拌3小時(shí)，除去有機(jī)相，即得納米?；鞈乙骸⑦m量的mPEG-PLA-PLL納米粒溶液在充分?jǐn)嚢柘轮鸬渭尤氲润w積的siRNA溶液中，低溫孵育30分鐘，即得到載基因和藥物的納米粒(siRNA+DHAQ-mPEG-PLA-PLL-Fa)(圖
2-D)。實(shí)施例6、包載阿霉素(ADM)的mPEG-PLA-PLL-Glu納米粒的制備采用乳化蒸發(fā)法制備取8mg mPEG-PLA-PLL-Glu溶于400 yL 二氯甲烷或乙酸乙酯中，加入40yL濃度為lOmg/mL的阿霉素(ADM)水溶液，超聲乳化后，再加入 4. 4mLlwt%的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超聲。然后室溫下攪拌池除去有機(jī)相，即得ADM-mPEG-PLA-PLL-Glu納米?；鞈乙?。上述制得的納米粒粒徑控制在l-10000nm。采用薄膜乳化法制備取^g mPEG-PLA-PLL-Glu和0. 4mg阿霉素(ADM)溶于400μ L丙酮溶劑中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，隨后加入4mL水溶液，室溫下攪拌3h，即得 ADM-mPEG-PLA-PLL-Glu納米?；鞈乙?。上述制得的納米粒粒徑控制在l-10000nm。采用透析法制備取ang mPEG-PLA-PLL-Glu溶于3mL 二甲亞砜或二甲基甲酰胺溶劑中，加入0. ^ig阿霉素(ADM)溶液，攪拌均勻；隨后將有機(jī)溶液在攪拌的條件下滴入水中， 之后將溶液裝入透析袋中透析48小時(shí)，除去有機(jī)溶劑；即得ADM-mPEG-PLA-PLL-Glu納米?；鞈乙骸Ｉ鲜鲋频玫募{米粒粒徑控制在1-lOOOOnm。
采用界面沉淀法制備取8mg mPEG-PLA-PLL-Glu和0. ^ig阿霉素(ADM)溶于 400 μ L丙酮溶劑中，在一定攪拌速度下，將上述溶液注入4mL濃度為2wt%聚乙烯醇(PVA) 溶液，加壓揮發(fā)去除丙酮，即得ADM-mPEG-PLA-PLL-Glu納米?；鞈乙?。上述制得的納米粒粒徑控制在I-IOOOOnm (圖2-E)。實(shí)施例7、包載鹽酸米托蒽醌(DHAQ)藥物的mPEG-PLA_PLL納米粒的制備采用乳化蒸發(fā)法制備取8mg mPEG-PLA-PLL溶于400 μ L 二氯甲烷或三氯甲烷或乙酸乙酯溶劑中，加入40μ L濃度為lOmg/mL的鹽酸米托蒽醌(DHAQ)水溶液，超聲乳化后， 再加入4.4mL 的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超聲。然后室溫下攪拌池除去有機(jī)相， 即得納米粒混懸液。上述制得的納米粒粒徑控制在1-lOOOOnm。采用薄膜乳化法制備取8mg mPEG-PLA-PLL和0. 4mg鹽酸米托蒽醌(DHAQ)溶于 400 μ L丙酮溶劑中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，隨后加入4mL水溶液，室溫下攪拌3h，即得納米粒混懸液。上述制得的納米粒粒徑控制在1-lOOOOnm。采用透析法制備取ang mPEG-PLA-PLL溶于3mL 二甲亞砜溶劑中，加入0. 4mg鹽酸米托蒽醌(DHAQ)，攪拌均勻；隨后將有機(jī)溶液在攪拌的條件下滴入水中，之后將溶液裝入透析袋中透析48小時(shí)，除去有機(jī)溶劑；即得納米?；鞈乙骸Ｉ鲜鲋频玫募{米粒粒徑控制在 I-IOOOOnm 之間。采用界面沉淀法制備取8mg mPEG-PLA-PLL和0. 4mg鹽酸米托蒽醌(DHAQ)溶于400 μ L丙酮或乙醇溶劑中，在一定攪拌速度下，將上述溶液注入4mL濃度為2wt%聚乙烯醇(PVA)溶液，加壓揮發(fā)去除丙酮，即得納米?；鞈乙骸Ｉ鲜鲋频玫募{米粒粒徑控制在
1-lOOOOnm(圖2-F)。實(shí)施例8、包載紫杉醇(Paclitaxel)的mPEG-PLA-PLL-EGFRab納米粒的制備采用乳化蒸發(fā)法制備取ang mPEG-PLA-PLL-EGFRab溶于400 μ L三氯甲烷，加入 0. ^ig的紫杉醇O^aclitaxel)，超聲乳化后，再加入4. 4mL 2wt%的泊洛沙姆F68水溶液中， 再次超聲。然后室溫下攪拌池除去有機(jī)相，即得納米?；鞈乙骸Ｉ鲜鲋频玫募{米粒粒徑控制在 1-lOOOOnm (圖 2-G)。采用薄膜乳化法制備取15mg mPEG-PLA-PLL-EGFRab和0. 4mg紫杉醇 (Paclitaxel)溶于400 μ L丙酮溶劑中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，隨后加入4mL水溶液，室溫下攪拌 5h，即得納米粒混懸液。上述制得的納米粒粒徑控制在1-lOOOOnm。采用透析法制備取6mg mPEG-PLA-PLL-EGFRab溶于3mL 二甲亞砜溶劑或二甲基甲酰胺溶劑中，加入40 μ L濃度為20mg/mL的紫杉醇(Paclitaxel) 二甲亞砜溶液中，攪拌均勻；隨后將有機(jī)溶液在攪拌的條件下滴入水中，之后將溶液裝入透析袋中透析48小時(shí)， 除去有機(jī)溶劑；即得納米?；鞈乙?。上述制得的納米粒粒徑控制在1-lOOOOnm。實(shí)施例9、包載順鉬(Cisplatin)的mPEG-PLA-PLL_hrEGF納米粒的制備采用乳化蒸發(fā)法制備取IOmg mPEG-PLA-PLL溶于400 μ L三氯甲烷，加入0. 6mg 的順鉬(Cisplatin)溶液，超聲乳化后，再加入4. 4mL 2wt%的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超聲。然后室溫下攪拌池除去有機(jī)相，即得納米粒混懸液。隨后加EDC和NHS加入納米粒溶液中，再加入l.ang/ml的hrEGF水溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)下磁力攪拌4h，隨后超濾離心得到Cisplatin-mPEG-PLA-PLL-hrEGF納米粒。上述制得的納米粒粒徑控制在l_10000nm(圖
2-H)。
采用薄膜乳化法制備取Hmg mPEG-PLA-PLL-hrEGF 和 0. 4mg 順鉬(Cisplatin) 溶于400 μ L丙酮溶劑中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，隨后加入4mL水溶液，室溫下攪拌5h，即得納米?；鞈乙?。上述制得的納米粒粒徑控制在1-lOOOOnm。采用透析法制備取^ig mPEG-PLA-PLL-hrEGF溶于3mL 二甲亞砜溶劑或二甲基甲酰胺溶劑中，加入40 μ L濃度為20mg/mL的順鉬(Cisplatin) 二甲亞砜溶液中，攪拌均勻； 隨后將有機(jī)溶液在攪拌的條件下滴入水中，之后將溶液裝入透析袋中透析48小時(shí)，除去有機(jī)溶劑；即得納米?；鞈乙?。上述制得的納米粒粒徑控制在1-lOOOOnm。實(shí)施例10、包載蟾蜍靈(Bufalin)的mPEG-PLA-PLL-cRGD納米粒的制備采用乳化蒸發(fā)法制備取8mg mPEG-PLA-PLL-cRGD溶于400μL三氯甲烷，加入 40 μ L濃度為20mg/mL的蟾蜍靈(Bufalin)溶液，超聲乳化后，再加入4. 4mL 2wt %的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超聲。然后室溫下攪拌池除去有機(jī)相，即得納米?；鞈乙?。上述制得的納米粒粒徑控制在1-lOOOOnm (圖2_1)。實(shí)施例11、包載5-氟尿嘧啶(5Fu)的mPEG-PLA-PLL_cRGD納米粒的制備采用乳化蒸發(fā)法制備取8mg mPEG-PLA-PLL-cRGD溶于400 μ L乙酸乙酯溶劑中， 加入40 μ L濃度為20mg/mL的5-氟尿嘧啶(5Fu)溶液，超聲乳化后，再加入4. 4mL 2wt% 的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超聲。然后室溫下攪拌池除去有機(jī)相，即得納米粒混懸液。 上述制得的納米粒粒徑控制在1-lOOOOnm (圖2-J)。實(shí)施例12、包載微泡內(nèi)容性氣體的mPEG-PLA-PLL納米粒的制備采用雙乳化法，將12mg mPEG-PLA-PLL溶于ImL三氯甲烷溶劑中，充分?jǐn)嚢柚疗渫耆芙?作連續(xù)相)，然后在其中加入200 μ L雙蒸水(為分散相)，超聲后，成乳白色乳化液(W/0微球)，將乳化液(分散相)倒入4mL 2wt% PVA溶液中(連續(xù)相)，均質(zhì)機(jī)均質(zhì)(W/0/W微球)。然后加入4mL異丙醇溶液中，高溫下攪拌，使微球表面固化、二氯甲烷盡量自然揮發(fā)，再經(jīng)多次雙蒸水與正己烷洗滌、離心(去除二氯甲烷)，收集微球，待其室溫干燥后加入適量雙蒸水混勻，置_45°C真空冷凍干燥機(jī)中真空冷凍干燥48小時(shí)，然后停止抽氣，將全氟丙烷氣體緩慢充入冷凍干燥室內(nèi)至大氣壓，關(guān)閉冷凍干燥機(jī)氣閥并保持他即得 mPEG-PLA-PLL微泡超聲造影劑。實(shí)施例13、轉(zhuǎn)鐵蛋白(iTrf)修飾mPEG-PLA-PLL包載 Cy5 標(biāo)記的 siRNA (Cy5_siRNA) 的納米粒的制備取ang mPEG-PLA-PLL-Trf 溶于 400 μ L 三氯甲烷中，加入 40 μ L 濃度為 10mg/mL 的Cy5-siRNA水溶液，超聲乳化后，再加入4.4mL Iwt %的F68水溶液中，再次超聲。然后室溫下攪拌3h除去有機(jī)相，即得Cy5-siRNA-mPEG-PLA-PLL-Trf納米?；鞈乙?圖2-K)。實(shí)施例14、載基因的納米粒對不同細(xì)胞干擾效果實(shí)驗(yàn)圖3 (A)可知，與siRNA相比，siRNA-mPEG-PLA-PLL納米粒能顯著的降低U937白血病細(xì)胞基因的表達(dá)，具有較好的干擾效果。這也證實(shí)該載體能夠有效的荷載siRNA，并能被細(xì)胞有效地吞噬，進(jìn)而來干擾U937白血病細(xì)胞基因的表達(dá)。圖3 (B)可知，與siRNA相比，ADM+siRNA-mPEG-PLA-PLL-La納米粒能有效地抑制 7721肝癌細(xì)胞的基因表達(dá)，表明該載體能同時(shí)荷載基因和藥物，從而有效的干擾基因表達(dá)。圖3 (C)可知，與siRNA相比，siRNA-mPEG-PLA-PLL_EGFRab納米粒能顯著地抑制 MCF-7乳腺癌細(xì)胞的基因表達(dá)，表明接有靶向基團(tuán)的siRNA-mPEG-PLA-PLL-EGFRab納米粒對MCF-7乳腺癌細(xì)胞具有較好的干擾效果。圖 3 (D)可知，與 siRNA 相比，microRNA-mPEG-PLA-PLL-PSAab 納米粒能有效地干擾PC-3前列腺癌細(xì)胞的基因表達(dá)，表明該載體能夠有效的荷載microRNA，并將其遞送到細(xì)胞內(nèi)，從而有效的干擾PC-3前列腺癌細(xì)胞基因的表達(dá)。實(shí)施例15、mPEG-PLA-PLL 載 Cy5 標(biāo)記的 microRNA (Cy5_microRNA)納米粒的靴向測試分析實(shí)驗(yàn)分另Ij用 Cy5-microRNA-mPEG-PLA-PLL-cRGD 納米粒(A)、 Cy5-microRNA-mPEG-PLA-PLL-EGFRab 納米粒(B)和 Cy5-microRNA-mPEG-PLGA-PLL_Fa 納米粒(C) 24h時(shí)用小動(dòng)物活體熒光儀對荷A549肺癌裸鼠進(jìn)行納米粒的腫瘤靶向測試分析。結(jié)果表明，納米粒在24h能有效地靶向集中于腫瘤部位(圖4)。實(shí)施例16、mPEG-PLA-PLL載cy5-siRNA+DHAQ納米粒在荷瘤動(dòng)物體內(nèi)的靶向測試分析實(shí)驗(yàn)分別靜脈注射載有Cy5-siRNA+DHAQ 的 mPEG-PLA-PLL (Cy5-siRNA+DHAQ-mPEG_PLA -PLL)納米粒，每只荷SW620腸癌裸鼠給予0. lnmol，在M和4 時(shí)用小動(dòng)物活體熒光儀測試分析納米粒在體內(nèi)的靶向分布情況。結(jié)果表明Cy5-siRNA+DHAQ-mPEG-PLA-PLL納米粒能較好的靶向于鼠的肝部，具有較好的肝靶向效果(圖5)。實(shí)施例17、mPEG-PLA-PLL-Fa載cy5_siRNA納米粒在荷瘤動(dòng)物體內(nèi)的靶向測試分析實(shí)驗(yàn)分別靜脈注射載有Cy5-siRNA 的 mPEG-PLA-PLL-Fa (Cy5-siRNA-mPEG-PLA-PLL_F a)納米粒，每只荷PLC肝癌裸鼠給予0. lnmol, 48h時(shí)用小動(dòng)物活體熒光儀測試分析納米粒在體內(nèi)的靶向情況。結(jié)果表明載有Cy5-siRNA-mPEG-PLA-PLL-Fa納米粒在4 能較好的靶向于鼠腎臟，有效地靶向于腎臟(圖6)。實(shí)施例18、復(fù)合磷酸鈣(Cap)的mPEG-PLA-PLL載Cy5_DNA納米粒 (Cy5-DNA-mPEG-PLA-PLL/Cap)在荷瘤動(dòng)物體內(nèi)的靶向測試分析實(shí)驗(yàn)分別靜脈注射載有Cy5-DNA-mPEG-PLA-PLL/Cap納米粒，每只荷MDA-MB-231乳腺癌裸鼠給予0. lnmol, 24,48和7 時(shí)用小動(dòng)物活體熒光儀測試分析納米粒在體內(nèi)組織的靶向分布情況。結(jié)果表明載有Cy5-DNA-mPEG-PLA-PLL/Cap納米粒在裸鼠體內(nèi)主要分布在動(dòng)物的腎臟，而且隨著時(shí)間的延長，納米粒仍能夠有效地靶向于鼠的腎部(圖7)。實(shí)施列19、載基因或藥物納米粒對不同荷瘤裸鼠的治療實(shí)驗(yàn)從圖8(A)可以看出，隨著治療時(shí)間延長，與&iline或siRNA相比， siRNA-mPEG-PLA-PLL納米?；騭iRNA-mPEG-PLA-PLL-Fa納米粒都能有效地降低荷AM9肺癌裸鼠的腫瘤體積，且siRNA-mPEG-PLA-PLL-Fa納米粒的抑制腫瘤生長效果更明顯，這表明該載體能很好荷載siRNA，在動(dòng)物體內(nèi)治療能有效地控制腫瘤生長。從圖8(B)可以看出，DHAQ+siRNA-mPEG-PLA-PLL-EGFRab納米粒能夠有效地降低荷MDA-MB-231乳腺癌裸鼠的腫瘤生長速度，表明該載體能夠有效的荷載藥物和基因達(dá)到理想的治療效果。
從圖8 (C)可以看出，隨著治療時(shí)間的延長，與^tline或microRNA相比， microRNA-mPEG-PLA-PLL-RGD 納米?；?microRNA-mPEG-PLA-PLL-RGD 納米粒能有效地控制荷U937白血病裸鼠的腫瘤生長，且嫁接靶向基團(tuán)的microRNA-mPEG-PLA-PLL-RGD納米粒的抑瘤效果更顯著，這證實(shí)該載體可以有效的將microRNA遞送到腫瘤組織，從而有效地抑制腫瘤的生長。從圖8(D)可以看出，隨著治療時(shí)間的延長，與Mline或5Fu相比， 5Fu-mPEG-PLA-PLL或5Fu-mPEG-PLA-PLL_Trf納米粒都能有效地抑制荷PLC肝癌裸鼠的腫瘤生長，同樣，5Fu-mPEG-PLA-PLL-Trf納米粒的抑瘤效果更明顯，表明該載體也可以有效地將藥物遞送到腫瘤部位，從而起到有效的治療。從圖8(E)可以看出，隨著治療時(shí)間的延長，與Mline或ADM相比， ADM-mPEG-PLA-PLL或ADM-mPEG-PLA-PLL-La納米粒都能有效地抑制荷H印G2肝癌裸鼠的腫瘤生長。ADM-mPEG-PLA-PLL-La納米粒能更有效的抑制腫瘤的生長，表明該載體也可以有效地將藥物遞送到腫瘤部位，從而抑制腫瘤的生長。從圖8(F)可以看出，隨著治療時(shí)間的延長，與Mline或siRNA相比， siRNA-mPEG-PLA-PLL或siRNA-mPEG-PLA-PLL-cRGD納米粒都能有效地抑制荷PC-3前列腺癌裸鼠的腫瘤生長。siRNA-mPEG-PLA-PLL-cRGD納米粒能夠提高siRNA的治療效果，有效地制前列腺腫瘤的生長。從圖8(G)可以看出，隨著治療時(shí)間的延長，與Mline或siRNA相比， siRNA-mPEG-PLA-PLL 或 siRNA-mPEG-PLA-PLL-La 納米粒都能有效地增強(qiáng) siRNA 對荷 H印G2 肝癌裸鼠腫瘤生長的抑制效果。且siRNA-mPEG-PLA-PLL-La納米粒能更有效的抑制肝癌腫瘤的生長。
權(quán)利要求
1.一種聚乙二醇-聚乳酸-聚-L-賴氨酸陽離子聚合物，其特征在于所述的聚乙二醇-聚乳酸-聚-L-賴氨酸陽離子聚合物的分子量為1. 2 X IO3-IO. 0 X IO8道爾頓；所述的聚乙二醇、聚乳酸和聚-L-賴氨酸摩爾比為0.1-50 0.1-100 1-100。
2.如權(quán)利要求1或2所述的聚乙二醇-聚乳酸-聚-L-賴氨酸陽離子聚合物，其特征在于所述的聚乙二醇和聚乳酸摩爾比為1-50 1-100 ；所述的聚乙二醇-聚乳酸和聚-L-賴氨酸摩爾比為1-50 1-100。
3.如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇-聚乳酸-聚-L-賴氨酸陽離子聚合物，其特征在于所述的聚乙二醇為一端羥基甲基化的聚乙二醇mPEG，其分子量為0. 1K-20K道爾頓；所述的聚乳酸的分子量為1K-100K道爾頓；所述的聚-L-賴氨酸分子量為0. 5K-100K道爾頓。
4.一種如權(quán)利要求1或3所述的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-聚-L-賴氨酸陽離子聚合物的合成方法，其特征在于通過如下步驟獲得(1)聚乙二醇單甲醚-聚乳酸的制備在抽真封管中、100 250°C和催化劑存在下，聚乙二醇單甲醚和丙交酯反應(yīng)2 100 小時(shí)；所述的聚乙二醇單甲醚和丙交酯的摩爾比為1 99 99 1，聚乙二醇單甲醚占原料總量質(zhì)量百分比為 50%，所述的聚乙二醇單甲醚分子量為100 20000道爾頓，催化劑占原料總質(zhì)量的百分比為0. 0001 催化劑，所述的催化劑是辛酸亞錫、乳酸鋅、氯化亞錫或?qū)妆交撬幔?2)聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-[(N-叔丁氧羰基)-L-苯丙氨酸]的制備在有機(jī)溶劑中和室溫條件下，步驟(1)的產(chǎn)物、叔丁氧基羰基-L-苯丙氨酸、N，N-二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶反應(yīng)0.5 5天；所述的步驟(1)的產(chǎn)物、N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸、N，N-二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶的摩爾比為1 0.01 30 0. 01 30 0. 01 30 ；(3)聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-L-苯丙氨酸的制備在有機(jī)溶劑中和_20°C 40°C溫度下，步驟(2)的產(chǎn)物和三氟乙酸反應(yīng)0. 1 M小時(shí)， 所述的步驟O)的產(chǎn)物和三氟乙酸的摩爾比為1 0. 01 30 ；(4)聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-[(N-芐氧羧基)-聚-L-賴氨酸]的制備有機(jī)溶劑中和室溫和氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，步驟⑷的產(chǎn)物和氨基酸環(huán)內(nèi)酸酐反應(yīng)1 6 天，所述的驟⑷的產(chǎn)物和氨基酸環(huán)內(nèi)酸酐的摩爾比為1 0.01 100 ；(5)聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-聚(L-賴氨酸)的制備步驟的產(chǎn)物和定量33%的氫溴酸-冰乙酸溶液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，0°C反應(yīng)0. I-M小時(shí)；所述的步驟的產(chǎn)物、33%的氫溴酸-冰乙酸溶液的摩爾比為1 0.01 100。
5.一種如權(quán)利要求1所述的以聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-聚-L-賴氨酸陽離子聚合物的應(yīng)用，其特征在于在制備基因或藥物載體在醫(yī)藥中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的基因載體是可以被組織、細(xì)胞膜受體識別的靶向基團(tuán)、腫瘤血管生成抑制肽、成纖維生長因子或血管內(nèi)皮生長因子的抗腫瘤血管生成的因子、以及葉酸、抗體、轉(zhuǎn)鐵蛋白、糖、聚山梨酯、多肽、甘草酸、甘草次酸、膽酸、低密度脂蛋白、激素或核酸修飾的基因載體。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的載體是載至少一種或一種以上的不同的活性物質(zhì)來制備微納米粒給藥系統(tǒng)。
8.如權(quán)利6要求所述的應(yīng)用，其特征在于可通過乳化蒸發(fā)法、界面沉淀法、透析法、 薄膜乳化法、冷凍干燥法、超聲分散法或逆向蒸發(fā)法等方法來制備聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-聚-L-賴氨酸為載體的微納米粒給藥系統(tǒng)；所制備的微納米粒給藥系統(tǒng)的粒徑為 5nm-10000nm。
9.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的活性物質(zhì)是基因、藥物、診斷用顯影劑、診斷試劑或微泡內(nèi)容氣體。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征是所述的基因是DNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染試劑、腫瘤治療用的基因治療藥物制劑、用于反義核酸和siRNA轉(zhuǎn)染試劑、制備反義核酸、siRNA或 microRNA治療用的藥物制劑；所述的藥物是能夠注射、口服或粘膜給藥的抗腫瘤化療藥物、抗腫瘤藥物靶向制劑、逆轉(zhuǎn)或降低腫瘤耐藥制劑或腫瘤診斷顯影的試劑。所述的微泡內(nèi)容氣體是空氣、氟碳?xì)怏w或六氟化硫。
全文摘要
本發(fā)明公開了聚乙二醇-聚乳酸-聚-L-賴氨酸陽離子聚合物、制備方法及作為基因或藥物載體在醫(yī)藥中的應(yīng)用。通過控制載體粒徑大小使其有被動(dòng)靶向功能。通過用靶向性基團(tuán)修飾多聚物，使其有主動(dòng)靶向功能。此載體還有運(yùn)送活性物質(zhì)、腫瘤治療與診斷、超聲顯影、逆轉(zhuǎn)或降低耐藥等功能。能應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物靶向制劑；制備逆轉(zhuǎn)或降低腫瘤耐藥制劑；制備腫瘤診斷顯影試劑；制備脫氧核糖核酸質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染試劑；制備腫瘤治療用的基因治療藥物制劑；制備用于反義核酸、小干擾核糖核酸(siRNA)轉(zhuǎn)染試劑；制備反義核酸、siRNA、microRNA(微小RNA)治療用的藥物制劑。
文檔編號C12N15/63GK102321242SQ20111024108
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月22日
發(fā)明者劉培峰, 孫彥明, 孫穎, 朱明潔, 段友容, 王炳武, 覃劉彬 申請人:上海市腫瘤研究所