專利名稱：抗β-干擾素單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，尤其涉及一種抗β-干擾素單克隆抗體，該抗體能與β-干擾素功能域結(jié)合，對(duì)β-干擾素具有中和作用，及其在純化和體外檢測(cè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
β -干擾素(interferon-β , IFN-β )是一種分子量為 20，5OODalton 的 I 型膜糖蛋白，含有166個(gè)氨基酸。經(jīng)基因工程重組制備的IFN-β的等電點(diǎn)為ρΗ8.9。IFN-β對(duì)蛋白酶敏感，在ΡΗ2條件下即使用56°C處理IOmin仍能保持穩(wěn)定。IFN-β不僅作為一種廣譜的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)劑，還具有抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用。其在抗病毒方面的廣譜性主要體現(xiàn)在如抗DNA病毒、痘病毒、皰疫病毒、人乳頭瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、腺病毒、RNA病毒、正粘病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒等等。在免疫調(diào)節(jié)方面，其可以調(diào)節(jié)THl與TH2平衡，促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，誘導(dǎo)MHC I類分子和MHC II分子的表達(dá)以及增強(qiáng)巨噬細(xì)胞Fe受體的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)·胞和NK細(xì)胞的殺傷能力。IFN-β還能抑制Daudi、WISH和K562等多種腫瘤來(lái)源的細(xì)胞增殖。機(jī)體內(nèi)的IFN-β主要由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。臨床治療所用的IFN-β主要是通過(guò)基因工程經(jīng)由大腸桿菌(E. coli)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)以及酵母細(xì)胞表達(dá)獲得。臨床上，重組IFN-β (rIFN-β)主要用于自身免疫性疾病的治療，如經(jīng)FDA批準(zhǔn)的，在多發(fā)性硬化癥(MS)的治療方面取得了公認(rèn)的治療效果。IFN-β治療MS是基于它的免疫調(diào)節(jié)作用，包括IFN-β對(duì)IFN-Y合成的抑制作用。IFN-β正嘗試用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、牛皮廯、糖尿病、病毒感染以及腫瘤治療等領(lǐng)域，并初步顯示其具有良好的應(yīng)用前景。對(duì)基因工程表達(dá)產(chǎn)生的IFN-β常規(guī)純化方法是先經(jīng)超濾濃縮和硫酸鹽鹽析，再經(jīng)羧甲基交聯(lián)葡聚糖(BioGel Ρ150)層析精制,也可采用快流藍(lán)層析柱(Blue Sepharose6Fast flow column)進(jìn)行快速高效純化。但是這些方法制得產(chǎn)品的純度仍不高，在IFN-β治療中會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生抗IFN-β抗體，這些IFN-β抗體對(duì)IFN-β具有中和作用，會(huì)導(dǎo)致IFN-β治療效果降低，進(jìn)而需要不斷增加劑量。幾乎所有的生物藥物，尤其是細(xì)胞因子類藥物均產(chǎn)生同樣的問題，這給生物制藥蒙上一層陰影。事實(shí)上，蛋白質(zhì)類型的生物藥物使用以后所產(chǎn)生的抗體是結(jié)合抗體，這種結(jié)合抗體可以影響生物藥物的藥效，也可以沒有影響或影響不大，而當(dāng)結(jié)合抗體具有與生物藥物的功能部位結(jié)合效能時(shí)，則稱為中和抗體，一旦中和抗體產(chǎn)生將極大影響生物藥物的藥效，所以制備具有中和作用的單克隆抗體，組成競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法用于檢測(cè)患者體內(nèi)的中和抗體對(duì)評(píng)判蛋白質(zhì)類基因藥物在體內(nèi)的藥效有實(shí)際意義，但目前并沒有存在此種單克隆抗體。目前市場(chǎng)上也尚未見有針對(duì)IFN-β功能域的ELISA檢測(cè)試劑盒，所見不多的ELISA檢測(cè)試劑盒中所用的抗體通常是針對(duì)整個(gè)IFN-β分子。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述缺陷，本發(fā)明的提供了一種抗干擾素單克隆抗體，該抗體能與干擾素功能域結(jié)合，對(duì)β-干擾素具有中和作用。其可用于評(píng)價(jià)β-干擾素治療效果和體外檢測(cè)。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種抗干擾素單克隆抗體在干擾素體外檢測(cè)中的應(yīng)用，從而監(jiān)測(cè)IFN-β在用藥期間針對(duì)IFN-β的中和抗體的產(chǎn)生狀況，定量測(cè)定IFN-β在機(jī)體內(nèi)的濃度變化和評(píng)判IFN-β治療過(guò)程中的免疫反應(yīng)及其治療效果。本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種抗干擾素單克隆抗體在干擾素 分離純化中的應(yīng)用，該抗體能與β_干擾素功能域結(jié)合，能顯著提高對(duì)β_干擾素的分離效率。IFN-β由166個(gè)氨基酸組成，其N-末端的15個(gè)氨基酸被認(rèn)為是功能域，序列見SEQ ID NoI。本發(fā)明所述的抗干擾素單克隆抗體，其能與SEQ ID No I專一性結(jié)合，對(duì)IFN-β具有中和作用(見表3)。本發(fā)明的一實(shí)施方式為保藏號(hào)為CCTCC NO C201121的雜交瘤細(xì)胞株制得的腹水型干擾素單克隆抗體的效價(jià)可達(dá)5X 10_6以上。本發(fā)明的另一實(shí)施方式,單克隆抗體為屬于IgG2、IgG1或IgG3亞型。單克隆抗體輕鏈均為K型。本發(fā)明的另一實(shí)施方式，單克隆抗體用于β_干擾素的親和層析。本發(fā)明的另一方面，一種干擾素的ELISA檢測(cè)方法，包括抗干擾素單克隆抗體。本發(fā)明的另一實(shí)施方式，抗β_干擾素單克隆抗體結(jié)合或固定于酶標(biāo)板。本發(fā)明的另一實(shí)施方式，抗干擾素單克隆抗體上結(jié)合有標(biāo)記物，所述的標(biāo)記物選自于酶標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光、同位素和突光標(biāo)記物之一。本發(fā)明的另一方面，抗β -干擾素單克隆抗體在制備IFN-β藥物中作為純化試劑的應(yīng)用。本發(fā)明的另一方面，抗干擾素單克隆抗體在制備IFN-β ELISA試劑盒中的應(yīng)用。雜交瘤技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員制備單克隆抗體所熟知，將具有分泌抗體能力的致敏B細(xì)胞和具有無(wú)限繁殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合為B細(xì)胞雜交瘤，使得融合細(xì)胞具有兩種親本細(xì)胞的特性，即成為能夠分泌抗體并能在體外長(zhǎng)期繁殖的雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)克隆化后成為單個(gè)細(xì)胞克隆，分泌的抗體即為單克隆抗體。該技術(shù)一般包括三個(gè)步驟(一)細(xì)胞融合和篩選；(二)培養(yǎng)基培養(yǎng)和篩選，以及(三)細(xì)胞克隆和培養(yǎng)。本發(fā)明使用常用的雜交瘤技術(shù)制備抗β_干擾素單克隆抗體，包括按照常規(guī)免疫方法(如腹腔、皮下和靜脈)，在皮內(nèi)注射蛋白抗原(如人源β_干擾素)免疫哺乳動(dòng)物，將免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞與同種系來(lái)源的骨髓瘤細(xì)胞融合。本發(fā)明中，使用Balb/c小鼠為免疫動(dòng)物，Balb/c小鼠的SP2/0細(xì)胞為骨髓瘤細(xì)胞，然后將免疫鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合后，經(jīng)過(guò)HAT選擇性培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)和經(jīng)過(guò)3次以上反復(fù)克隆有限稀釋、間接ELISA交叉性篩選以及病毒中和試驗(yàn)，獲得4株可穩(wěn)定分泌抗IFN-β功能域單抗的雜交瘤細(xì)胞株，分別為 Ab-BIUIFN- β -6F8C6C7F10)、Ab-B12 (IFN- β -6F8D6G7H2)、Ab-BI3 (IFN- β -6F8C11G7B9)和 AbBI4 (IFN-β-8H2C7B7C5A5)，其亞型分別為 IgG2' IgG2'IgGJP IgG3，輕鏈均為K型，保藏于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所，其中細(xì)胞株Ab-BIl保藏于位于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，相應(yīng)的保藏號(hào)為CCTCC NO :C201121。本發(fā)明的抗原來(lái)源( 一)Rebif (Betaseron 產(chǎn)品，Lot :NA3711A):系經(jīng)基因工程由 Ε· coli 表達(dá)產(chǎn)物，IFN-β含量為30μ g/ml，其中含有15mg BSA作為穩(wěn)定劑。( 二)AV0NEX (Biogen Inc產(chǎn)品，Lot P0091U):系經(jīng)基因工程由中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物，IFN-β含量為30μ g/ml，其中含有15mg BSA作為穩(wěn)定劑。(三)IFN-β功能域抗原(BestInter):采用核酸抽提試劑盒從人成纖維細(xì)胞中抽提RNA，使用生命技術(shù)公司提供的第一鏈cDNA合成試劑中的逆轉(zhuǎn)錄酶，以純化的總RNA或mRNA作模板,運(yùn)用試劑盒提供的寡聚核苷酸dT引物合成cDNA。采用由Gene Bank DNA文件中查到的IFN-β功能域基因序列，以標(biāo)準(zhǔn)PCR方法從cDNA中擴(kuò)增IFN-β功能域基因，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染酵母菌，并通過(guò)抗菌培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)染酵母菌進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)。表達(dá)得到的IFN-β功能域抗原(Best Inter)經(jīng)親和層析純化、經(jīng)特異性鑒定以后備用。 一種本發(fā)明所述抗β -干擾素單克隆抗體雜交瘤制備方法，包括如下步驟(一 )動(dòng)物免疫與ELISA篩選I.動(dòng)物免疫10周齡健康雌性Balb/c小鼠2只(由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，取商品化抗原(IFN-β，AV0NEX )300yg(0. 3ml)，加入等量弗氏完全佐劑乳化后于小鼠腹腔、背部皮下部位免疫，每鼠每次免疫抗原總量為100 μ g，間隔4周加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫3-4次，再次免疫增加腹股溝腫大的淋巴結(jié)部位。融合前4天以50 μ g抗原溶液經(jīng)無(wú)菌處理以后自尾靜脈再次加強(qiáng)免疫。經(jīng)ELISA檢測(cè)抗體陽(yáng)性之后處死小鼠，取脾細(xì)胞作融合用。2. ELISA 篩選以pH 9. 5,0. 05mol/L 碳酸鹽緩沖液將 IFN- β (AV0NEX )濃度調(diào)為 400ng/ml，每孔 οομ I加入于酶標(biāo)板反應(yīng)孔內(nèi)，置于4°C包被過(guò)夜，次日甩去包被上清液，用洗滌液將包被好的酶標(biāo)板洗滌3次，每次5min，然后每孔加200 μ I含I % BSA的PBS封閉液，放置室溫封閉2h。傾去封閉液，同上洗滌后用透明塑封帶封貼，經(jīng)鑒定后放_(tái)30°C備用。以400ng/mlBSA (Sigma公司產(chǎn)品)與前述相同方法包被酶標(biāo)板，經(jīng)鑒定后放_(tái)30°C備用。同時(shí)以AV0NEX 公司和Betaseron公司出品的IFN- β以及Sigma公司和上海市生物制品研究所出品的BSA分別包被酶聯(lián)板，用于檢測(cè)IFN-β陽(yáng)性抗體的鑒定。( 二)細(xì)胞融合和篩選I.細(xì)胞準(zhǔn)備骨髓瘤細(xì)胞制備選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0(上海市免疫學(xué)研究所保種)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞，洗滌細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為4-5 X 105/ml，細(xì)胞懸浮于無(wú)血清1640培養(yǎng)液中備用。飼養(yǎng)細(xì)胞制備融合前I天取正常Balb/c小鼠，頸椎脫臼致死以后用5ml0. 5%HAT-20 % FCS-1640培養(yǎng)液注入小鼠腹腔內(nèi)，輕輕擠摟腹腔以后，剖開腹膜，抽出腹腔液，離心計(jì)數(shù)腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)量。用20% FCS(小牛血清)-1640調(diào)整細(xì)胞濃度至lX105/ml，立即種到96孔培養(yǎng)板內(nèi)，IX 104/0. Iml/孔。脾細(xì)胞制備在最后一次加強(qiáng)免疫后第3天，眼底靜脈叢放血以后處死小鼠，取小鼠脾臟，置于無(wú)血清1640培養(yǎng)液中，用注射器內(nèi)栓將脾臟攆碎，經(jīng)尼龍網(wǎng)過(guò)濾制成細(xì)胞懸液。IOOOrpm離心5min,棄上清后重懸于5ml無(wú)血清1640培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度。
2.細(xì)胞融合將IO8個(gè)脾細(xì)胞懸液與IO7個(gè)SP2/0細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)比10 I)混合于50ml尖底離心管中，1，OOOrpm離心5min，傾去上清，輕彈沉降下來(lái)的細(xì)胞團(tuán)塊，使之完全松散。以Iml移液管吸取37°C 50% PEGlml在Imin內(nèi)邊攪拌邊加入，加完后靜置90s使細(xì)胞融合，之后以37°C IOml無(wú)血清1640培養(yǎng)液終止融合，開始時(shí)緩慢加入(lml/min)，而后逐漸加快，邊加邊攪。I，OOOrpm離心7min，去除上清，沉淀細(xì)胞重懸于IOOml O. 5% HAT-20 % FCS-1640培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)入預(yù)種有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加融合細(xì)胞O. 1ml，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。(三)陽(yáng)性克隆的篩選I. HAT培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)
融合后的細(xì)胞在O. 5% HAT-20% FCS-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)1_2周，定時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。一周后，在倒置顯微鏡下觀察克隆生長(zhǎng)情況并記錄每孔克隆數(shù)。當(dāng)有克隆出現(xiàn)后及時(shí)把培養(yǎng)液體系換成HT培養(yǎng)液。當(dāng)克隆細(xì)胞生長(zhǎng)至占培養(yǎng)孔底1/3面積時(shí)即可吸取培養(yǎng)液上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。2. ELISA 檢測(cè)以包被有IFN- β抗原ELISA檢測(cè)試劑盒和包被有BSA的ELISA檢測(cè)試劑盒分別對(duì)上述細(xì)胞上清液進(jìn)行測(cè)定。每孔加入100 μ I待檢雜交瘤細(xì)胞上清，于37°C孵育I. 5h。傾去未結(jié)合樣品，洗滌后每孔加入I : 1000(體積比)稀釋的羊抗鼠IgG-HRP結(jié)合物100 μ 1，于37°C孵育I小時(shí)。將多余的酶結(jié)合物洗去，同上洗滌。每孔加入100 μ I的酶底物反應(yīng)液(0卩0-!1202)，室溫顯色10-301^11后，每孔加入5(^1的終止液(2mol/L H2SO4)終止。用酶標(biāo)儀495nm測(cè)OD值，IFN- β包被孔A值大于陰性孔2倍以上且BSA包被孔陰性者作為陽(yáng)性，及時(shí)進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。(四)雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞克隆化。I.克隆當(dāng)天制備飼養(yǎng)細(xì)胞，接種96孔板內(nèi)，O. Iml/孔(2Χ104/孔)。2.陽(yáng)性細(xì)胞從培養(yǎng)板內(nèi)輕輕沖洗下，計(jì)數(shù)。3.用培養(yǎng)液連續(xù)稀釋細(xì)胞懸液成10個(gè)細(xì)胞/ml和3個(gè)細(xì)胞/ml，分別接種到加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi)，O. Iml/孔。4. 10天左右，雜交瘤細(xì)胞集落長(zhǎng)至孔底1/3面積時(shí)，開始測(cè)定上清中抗體活性。5.測(cè)得有抗體活性的陽(yáng)性細(xì)胞孔時(shí)，同上再克隆，共進(jìn)行3次。經(jīng)上述重復(fù)進(jìn)行ELISA篩選及亞克隆，最后篩選出4株能穩(wěn)定分泌抗IFN- β的雜交瘤細(xì)胞株，分別為Ab-BIl、Ab-BI2、Ab-BI3和Ab_BI4，詳見表I。表I.細(xì)胞單克隆率以及單克隆抗體陽(yáng)性率
權(quán)利要求
1.一種抗β-干擾素單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體與β-干擾素SEQ ID NoI特異結(jié)合。
2.一種抗干擾素單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體由保藏號(hào)為CCTCC NOC201121的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗β-干擾素單克隆抗體，其特征在于由保藏號(hào)為CCTCC NO C201121的雜交瘤細(xì)胞株制得的腹水型干擾素單克隆抗體的效價(jià)可達(dá)5X 10_6以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的抗β-干擾素單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體為屬于IgG2、IgG1或IgG3亞型。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的抗β-干擾素單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體輕鏈均為K型。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的抗β-干擾素單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體用于干擾素的親和層析。
7.—種干擾素的ELISA檢測(cè)方法，包括權(quán)利要求I或2所述的抗β-干擾素單克 隆抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的β-干擾素的ELISA檢測(cè)方法，其特征在于所述的抗β-干擾素單克隆抗體結(jié)合或固定于酶標(biāo)板。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的β-干擾素的ELISA檢測(cè)方法，其特征在于所述的抗β-干擾素單克隆抗體上結(jié)合有標(biāo)記物，所述的標(biāo)記物選自于酶標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光、同位素和熒光標(biāo) 記物之一。
10.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的抗β-干擾素單克隆抗體在制備IFN-β ELISA試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
一種抗β-干擾素單克隆抗體，由由保藏號(hào)為CCTCC NOC201121的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。與β-干擾素SEQ ID No 1特異結(jié)合后，對(duì)β-干擾素具有中和作用。該抗β-干擾素單克隆抗體可用于對(duì)β-干擾素親和層析純化和ELISA檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12R1/91GK102898521SQ20111020988
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月26日
發(fā)明者余奇文, 張冬青, 張繼英, 李寧麗, 馬安倫, 席波, 聶紅, 沈伯華, 沈天偉, 柏峻, 王利 申請(qǐng)人:上海市免疫學(xué)研究所