專利名稱:一種大豆gdp-d-甘露糖焦磷酸化酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域,涉及一種大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù):
維生素C又叫抗壞血酸(L-ascorbic acid, AsA),是植物和大多數(shù)動(dòng)物體內(nèi)合成的一類己糖內(nèi)酯化合物。維生素C在生物體中不僅具有抗氧化作用而且具有重要的代謝功能。研究發(fā)現(xiàn),植物中,維生素C與植物的抗逆性表現(xiàn)為正相關(guān)性,提高植物細(xì)胞內(nèi)的維生素C的含量,能使植物耐炎熱、寒冷和鹽堿等逆境的能力得到增強(qiáng)。維生素C是人類和動(dòng)物維持生長(zhǎng)、繁殖和保證健康所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。植物、微生物和大多數(shù)動(dòng)物體內(nèi)可自行合成維生素C,但是人類、猿猴、天竺鼠等自身已經(jīng)喪失了合成能力,必須從食物中攝取,而新鮮蔬菜和水果是維生素C最好的來(lái)源。因此維生素C含量已成為衡量農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)。⑶P-D-甘露糖焦磷酸化酶(GMPase)是植物中維生素C合成途徑L-半乳糖途徑中第一步反應(yīng)所需要的酶,催化D-甘露糖-I-P生成⑶P-D-甘露糖。目前已經(jīng)從煙草 (AB066279)、土豆(AF022716)、擬南芥(AF076484)、金虎尾(DQ2^168)、番茄(AY605668)等多個(gè)物種中獲得了編碼GMPase的基因。大豆中GMPase基因的序列還未見(jiàn)報(bào)道。提高菜用大豆維生素C含量,提高菜用大豆的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì),對(duì)提高農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益和改善人類生活質(zhì)量具有積極而深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足,提供一種大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶。本發(fā)明的另一目的是提供該大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶的編碼基因。本發(fā)明的又一目的是提供該基因的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所提供的大豆⑶P-D-甘露糖焦磷酸化酶,名稱為GmGMPl,來(lái)源于大豆屬大豆[Glycine max(L.)],具有SEQ ID NO. 2所述的氨基酸序列。上述大豆⑶P-D-甘露糖焦磷酸化酶的編碼基因GmGMPl,其CDNA基因具有SEQ ID NO. 1所示的DNA序列,該序列為GmGMPl基因的讀碼框,編碼具有SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶。含有編碼大豆⑶P-D-甘露糖焦磷酸化酶的基因的表達(dá)載體。所述的表達(dá)載體優(yōu)選以pBI121為出發(fā)載體,將編碼所述的大豆⑶P-D-甘露糖焦磷酸化酶的基因GmGMPl插入到pBI121質(zhì)粒的)(ba I和BamH I酶切位點(diǎn)間得到的植物過(guò)量表達(dá)載體pBI-GmGMP 1。含有所述的編碼大豆⑶P-D-甘露糖焦磷酸化酶的基因的工程菌。該工程菌優(yōu)選利用基因工程手段將GmGMPl基因轉(zhuǎn)入的根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105所得。本發(fā)明所述的大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶在培育高維生素C含量的植物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶編碼基因在培育高維生素C含量的植物中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明首次從大豆中克隆出了 GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因,通過(guò)構(gòu)建植物過(guò)量表達(dá)載體pBI-GmGMPl,對(duì)該基因進(jìn)行過(guò)量表達(dá),發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)GmGMPl的擬南芥與野生型擬南芥相比,其維生素C (抗壞血酸)含量顯著提高,說(shuō)明GmGMPl基因在提高植物維生素 C (抗壞血酸)含量方面起著重要作用。本發(fā)明大豆⑶P-D-甘露糖焦磷酸化酶(GmGMPl)及其編碼基因GmGMPl對(duì)培育高維生素C (抗壞血酸)農(nóng)作物,提高農(nóng)作物營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響特別是對(duì)菜用大豆?fàn)I養(yǎng)品質(zhì)的影響具有重要意義。
圖1為大豆GMPl與其他物種的GMPase的氨基酸序列多重比較。圖2為含有GmGMPl的植物表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3ASA標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中縱坐標(biāo)為OD對(duì)照-OD反應(yīng)后,橫坐標(biāo)為ASA含量,單位為 0. 01mg/ml。圖4DHA標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中縱坐標(biāo)為OD5^-ODfiisjs,橫坐標(biāo)為DHA含量,單位為 0. Olmg/ml。圖5為轉(zhuǎn)GmGMPl擬南芥株系與野生型擬南芥的葉片中總維生素C含量示意圖,其中縱坐標(biāo)單位為mg/100g。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明,均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。實(shí)施例IGmGMPl基因的分離與克隆用已發(fā)表的擬南芥⑶P-甘露糖焦磷酸化酶序列(AtGMP,AF076484)為探針,搜索 GenBank (http//www. ncbi.nlm. nih. gov. blast)禾口 Gene Index(http://compbio. dfci. harvard, edu/tgi/)數(shù)據(jù)庫(kù),得到了匹配的大豆EST序列,進(jìn)行EST片段拼接,得到了一個(gè)GMPase基因片段,該GMPase基因片段的⑶S序列在大豆基因組上的位置為 Glymal4g07150,設(shè)計(jì) PCR 擴(kuò)增引物,正向引物 F :5 ‘-ATGAAGGCATTGATTCTGG-3,(SEQ IDN0. 3);反向引物 R 5 ‘-CATGACAATCTCCGGCTTC-3,(SEQ ID N0. 4)。以大豆品種波高(來(lái)自國(guó)家大豆改良中心種子庫(kù))的總cDNA為模板,進(jìn)行PCR獲得GmGMPl讀碼框序列,PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為1μ 1大豆cDNA(0. 05yg)、ly 1引物對(duì)(10μΜ)、2. 5μ 1 10XPCR緩沖液、2. 5 μ 1 Mg2\4y 1 dNTP (IOmM)和 1. 25U LA Taq DNA 聚合酶,用超純水補(bǔ)足 25 μ 1。反應(yīng)在 BI0-RADPTC-200 型 PCR 儀上進(jìn)行,其程序?yàn)?95°C變性 5min;再 94°C 30s, 58 °C 30s, 72°C 2min,共30個(gè)循環(huán);然后72°C延伸IOmin ;4°C保存。PCR產(chǎn)物回收后經(jīng)鏈接PMD19-T 載體(TaKaRa)、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci、藍(lán)白斑篩選、搖菌、測(cè)序、序列分析,結(jié)果表明PCR產(chǎn)物具有序列表中SEQ ID NO. 1的核苷酸序列,命名為GmGMPl基因。實(shí)施例2GmGMPl基因植物表達(dá)載體pBI_GmGMPl的構(gòu)建和鑒定將pBI121質(zhì)粒(購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)分別經(jīng)過(guò)^Cba I、BamH I 單酶切,用核酸共沉劑DNAmate沉淀回收酶切后的pBI121線性質(zhì)粒。將測(cè)序正確的含有 GmGMPl基因的大腸桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增(上游引物F含有)(baI的酶切位點(diǎn)5’ -GCTCTAGACACATCACAATGAAGGCATTG-3’ (SEQ ID NO. 5),下游引物 R 含有 BamHI 的酶切位點(diǎn)5,-CGGGATCCTGACCTCACTCACATGACAAT-3,(SEQ ID NO. 6),對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后進(jìn)行)(ba I、BamH I雙酶切得到含)(ba I/BamH I酶切位點(diǎn)的GmGMPl,將酶切產(chǎn)物含)(ba I、BamH I酶切位點(diǎn)的GmGMPl與酶切后的pBI121線性質(zhì)粒連接,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。 藍(lán)白斑篩選及PCR檢測(cè)得到陽(yáng)性克隆,命名為pBI-GmGMPl。用限制性內(nèi)切酶)(ba I/BamH I 雙酶切PBI-GmGMPl得到1,IOObp左右的條帶,與預(yù)期的值相符,所以確認(rèn)所構(gòu)建的載體是正確的,即得到了由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GmGMPl基因的表達(dá)載體pBI-GmGMPl,載體構(gòu)造如圖2所示。實(shí)施例3轉(zhuǎn)GmGMPl基因擬南芥陽(yáng)性植株的獲得以及功能驗(yàn)證用凍融法將pBI-GmGMPl轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105中。pBI-GmGMPl通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥,PCR檢測(cè)Tl代結(jié)果表明獲得陽(yáng)性植株。將轉(zhuǎn)基因擬南芥植株和野生型擬南芥植株種植于同等環(huán)境條件下(人工氣候箱,白22°C,IOh/夜19°C,14h)。30d后取葉片用以下方法進(jìn)行維生素C含量測(cè)試(方法參照秦誠(chéng)擬南芥NH4+超敏突變體hsnl分子機(jī)制的相關(guān)研究[D].浙江大學(xué),2008,(12))1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作試劑配置維生素C(L-ascorbic acid,AsA)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司脫氫抗壞血酸(DHA)購(gòu)自Sigma公司i^M C fi^SI (ascorbate oxidase, AO) ^ 自 Sigma ^W]二硫蘇糖醇(DTT)購(gòu)自南京基天生物技術(shù)公司其他藥劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司6%偏磷酸6g偏磷酸溶解于水定容至100ml,加^il IOOmM EDTA-Na2,10%檸檬酸鈉10g檸檬酸鈉溶解于水中定容至100ml,磷酸鉀緩沖液lmol/LK2HPO4 lmol/L KH2PO4 = 8. 5 91. 5 (ν v) ,PH = 5. 8,混合液6 %偏磷酸10 %檸檬酸鈉磷酸緩沖液= 75.6 50.4 14(ν ν ν),IOOmg AsA 溶于混合液中,定容至 100ml (含 AsA lmg, /ml),IOOmg DHA 溶于混合液中,定容至 100ml (含 DHA lmg/ml),IOml 的 lmg/ml ASA 溶于混合液中,定容到 100ml (含 AsA 0. lmg/ml),IOml 的 lmg/ml DHA 溶于混合液中,定容到 IOOrnl (含 DHA 0. lmg/ml),稀釋至各個(gè)濃度(0mg/ml 0. lmg/ml),酶標(biāo)儀板加樣體積150ul/每孔,另每份樣品3個(gè)一組,共三組,分別加入20ul的ddH20、250U/10ml AO溶液以及IOOmM的DTT溶液反應(yīng)30min 45min,在265nm波長(zhǎng)處檢測(cè),并繪制ASA和DHA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。ASA標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見(jiàn)圖3,DHA標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見(jiàn)圖4。
2.樣品中維生素C含量的測(cè)定1)稱空管的質(zhì)量Ml;2)大約0. 1克樣品(葉片)在液氮中碾磨,加入6%偏磷酸鈉Iml (質(zhì)量為M0),稱重M2,冰浴30分鐘;3) M2-M1-M0為樣品的凈重;4) 4"C,12000rpm, 15 分鐘,離心;5)取750 μ 1上清,加入500 μ 1的10%檸檬酸鈉,中和;6)取900 μ 1中和液加入100 μ 1磷酸鉀緩沖液(pH = 5. 8);7)測(cè)OD265 (ODl)(準(zhǔn)備兩份樣品,一份加入DTT后,再重復(fù)7-8)步驟;8)加入維生素 C 氧化酶(ascorbate oxidase,AO,Sigma) 1 μ 1,室溫反應(yīng) 45 分鐘;9)測(cè) OD265 (0D2);10) 0D1-0D2絕對(duì)值,根據(jù)AsA標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)計(jì)算ASA的含量;11)加DTT的樣品,室溫45min后,測(cè)0D265 (0D3),0D1-0D3,根據(jù)DHA標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖 4)計(jì)算DHA的含量??偩S生素C含量=ASA含量+DHA含量結(jié)果如圖5所示部分轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片的總維生素C含量顯著高于野生型擬南芥葉片,說(shuō)明轉(zhuǎn)基因株系與野生型相比總維生素C含量顯著提高,過(guò)量表達(dá)GmGMPl基因能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的總維生素C含量。
權(quán)利要求
1.一種大豆⑶P-D-甘露糖焦磷酸化酶,其特征在于具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述的大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶的基因GmGMPl。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因GmGMPl,其特征在于具有SEQID NO. 1所示的DNA序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述的編碼大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶的基因的表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體,其特征在于所述的表達(dá)載體是以pBI121為出發(fā)載體,將編碼所述的大豆⑶P-D-甘露糖焦磷酸化酶的基因GMGMPl插入到pBI121質(zhì)粒的)(ba I和BamH I酶切位點(diǎn)間得到的植物過(guò)量表達(dá)載體pBI-GmGMPl。
6.含有權(quán)利要求2或3所述的編碼大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶的基因的工程菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的工程菌,其特征在于該工程菌是利用基因工程手段將GMGMPl 基因轉(zhuǎn)入的根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105所得。
8.權(quán)利要求1所述的大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶在培育高維生素C含量的植物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求2或3所述的大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶編碼基因在培育高維生素C 含量的植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域,公開了一種大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶及其編碼基因與應(yīng)用。該大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶,具有SEQ ID NO.2所述氨基酸序列,其編碼基因GmGMP1具有SEQ ID NO.1所示的DNA序列。轉(zhuǎn)GmGMP1基因擬南芥和野生型擬南芥相比,轉(zhuǎn)基因植株葉片中總維生素C含量明顯高于野生型擬南芥??梢?jiàn)本發(fā)明大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶及其編碼基因可用于培育高維生素C含量的植物品種特別是大豆品種。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102321593SQ201110190640
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月8日
發(fā)明者徐筋燕, 王燦, 薛晨晨, 趙晉銘, 邢邯, 郭娜 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)