專利名稱：環(huán)介導等溫擴增超級細菌ndm-1基因的引物及檢測超級細菌ndm-1基因的試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于細菌基因檢測技術領域，特別涉及環(huán)介導等溫擴增超級細菌基因的引物，還涉及一種用環(huán)介導等溫擴增方法檢測超級細菌基因的試劑盒，還涉及用環(huán)介導等溫擴增方法檢測超級細菌MW-7基因的檢測方法。
背景技術：
超級細菌，是一類耐藥細菌的統(tǒng)稱，包括耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌MRSA、耐萬古霉素的糞腸球菌VRE、碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌，碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌，碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌，碳青霉烯耐藥其它腸桿菌科細菌等。最近引起世界關注的超級病菌NDM-I是一種新型的超級細菌(全稱為New Delhi metallo-^-lactamase-l,即新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶1)可以抵御幾乎所有抗生素，NDM-I 編碼一種新的耐藥酶，稱為NDM-I金屬β-內(nèi)酰胺酶。含MW-I基因的腸桿菌科細菌已威脅人類的健康，并對各種抗生素不敏感，給臨床治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。對于攜帶MW-7基因的超級細菌的實驗室診斷主要基于PCR技術進行基因確證。 如申請?zhí)枮?010105Μ690. 7，名稱為“一種抗生素耐藥似W-7基因的熒光檢測試劑盒及檢測方法”的中國發(fā)明專利申請，設計了一個熒光探針引物，降低了 PCR擴增的假陽性率，但假陽性仍然存在，并且檢測成本高，操作比較復雜，檢測時間長，一般需要2-3小時，都影響到臨床攜帶基因的超級細菌的檢測結果。環(huán)介導等溫擴增方法(LAMP)是近幾年新興的一種基因擴增方法，對儀器設備要求不高，只需要恒溫水浴鍋或金屬浴即可，成本低，且臨床上容易做到，檢測時間較短，不超過 1個小時，為快速、準確診斷基因的一種新方法。環(huán)介導等溫擴增方法已經(jīng)廣泛應用于檢測細菌領域，并有很多相關專利獲得授權。目前國內(nèi)外均未見使用LAMP方法檢測新型超級細徹DM-I基因的報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決PCR擴增易出現(xiàn)假陽性、檢測成本高、操作復雜、檢測時間長的問題，填補使用LAMP檢測新型超級細菌MW-7基因的空白，本發(fā)明提供了用環(huán)介導等溫擴增超級細菌 NDM-I基因的引物。本發(fā)明建立了一種新型超級細菌MW-7基因LAMP檢測方法，根據(jù)MW-7 基因保守區(qū)的6段序列設計了一對特異性內(nèi)引物，一對特異性外引物和一對環(huán)引物。本發(fā)明還提供了檢測超級細菌MW-7基因的試劑盒。本發(fā)明還提供了檢測超級細菌MW-7基因的檢測方法。本發(fā)明是通過以下措施實現(xiàn)的
一種環(huán)介導等溫擴增超級細菌MW-7基因的引物，由一對外引物，一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物組成，其核苷酸序列分別如下
夕卜弓I物 F3 :5，-GGCCACACCAGTGACAAT-3，， 夕卜弓I物 B3 :5，-GCGGAATGGTCATCACGAT-3，，內(nèi)引物 FIP :5’ -ACTTGGCCTTGCTGTCCTTGATGTTGGGATCGACGGCAC-3，， 內(nèi)引物 BIP :5’ -CGCTCGGCAATCTCGGTGATGCTGGCCTTGGGGAACGC-3，， 環(huán)引物 LF :5，-GCTGTAGCGAAAACCACCG-3，， 環(huán)引物 LB :5，-ACACTGAGCACTACGCCG-3，，
其中，外引物與內(nèi)引物的摩爾比為1:8，外引物與環(huán)引物的摩爾比為1:4。一種檢測超級細菌MW-7基因的試劑盒，包括若干個裝有反應液的LAMP反應管， 其中，每25 μ L反應液中含有12. 5 μ L 2X等溫反應緩沖液、1.0 μ L Bst DNA聚合
酶、40 pmol 內(nèi)引物 FIP、40 pmol 內(nèi)引物 BIP、5 pmol 外引物 F3、5 pmol 夕卜引物 B3、20 pmol 環(huán)引物LF、20 pmol環(huán)引物LB，余量為滅菌雙蒸水； 其中，Bst DNA聚合酶的活性單位為8U/ μ L ；
2Χ 等溫反應緩沖液中含有 40 mM ρΗ 為 8. 8 的 iTris-HCUO mM KCl,16 mM MgSO4,20 mM (NH4)2S04、0. 2wt% Tween20、1.6 M 甜菜堿、2· 8 mM dNTP。所述的試劑盒，還包括1 μ L鈣黃綠素。一種檢測超級細菌MW-7基因的檢測方法，包括以下步驟
(1)提取待檢細菌基因組總DNA；
(2)使用所述的試劑盒進行檢測，具體操作為將待檢細菌基因組DNA加入LAMP反應管的反應液內(nèi)，混勻，同時設陰性對照和陽性對照，陽性對照中加入反應液內(nèi)的為含有基因的基因組DNA，陰性對照中加入反應液內(nèi)的為滅菌雙蒸水，將LAMP反應管置水浴鍋中進行擴增，擴增條件為65°C水浴恒溫反應35 min0步驟(2)中待檢細菌基因組DNA為含DNA的濃度為0.003-300 ng/μ L的DNA溶液。所述的檢測方法，LAMP反應管中出現(xiàn)白色沉淀為陽性結果，不出現(xiàn)白色沉淀為陰性結果。所述的檢測方法，其特征是在擴增反應前的反應管中加入1 μ L鈣黃綠素，反應結束后擴增產(chǎn)物變?yōu)榫G色的為陽性結果，橙色的是陰性結果。步驟(1)中提取待檢細菌基因組DNA包括以下步驟將待檢的細菌菌株過夜培養(yǎng)后，取1 mL的菌液12000 rpm離心2 min，徹底棄上清，取沉淀用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組總DNA，最后溶于50 μ L滅菌雙蒸水中，測定DNA濃度為300 ng/μ L左右，-20 °C保存?zhèn)溆?。本發(fā)明的有益效果
1、采用LAMP技術，特異性強，比PCR檢測方法靈敏度更高，不需要昂貴的PCR儀器，只需要普通的金屬浴或水浴鍋即可，且結果不必用凝膠電泳方法來觀察，通過肉眼觀察白色沉淀產(chǎn)生或使用熒光染料顯色肉眼直接觀察即可判定結果，時間大大縮短，從普通PCR儀的2 3小時縮短到35 min左右，簡單而快速，可廣泛用于獸醫(yī)及人醫(yī)領域包括實驗室及臨床基層對攜帶基因的超級細菌的快速檢測；
2、解決了現(xiàn)有技術時間長、工作量大、交叉污染、操作復雜等缺陷；
3、具有特異性強、靈敏度高、快速且成本低、操作方法更簡單，適于現(xiàn)場快速檢測的優(yōu)
點ο


圖1為實施例2擴增得到的產(chǎn)物通過肉眼直接觀察白色沉淀的檢測結果，其中，1 號管為陰性對照，2號管為陽性對照，3號管為檢測管；
圖2為實施例3中LAMP方法檢測超級細菌基因靈敏度肉眼直接觀察白色沉淀的檢測結果，其中1-7號管中加入的為倍比稀釋的含超級細菌基因的洛菲不動桿菌基因組DNA，8號管為陰性對照；
圖3為實施例3中普通PCR方法檢測超級細菌MW-7基因靈敏度檢測結果，其中1-7號 PCR反應模板為倍比稀釋的含超級細菌MW-7基因的洛菲不動桿菌基因組DNA，8號為陰性對照；
圖4為實施例4中LAMP方法檢測超級細菌MW-7基因特異性檢測結果，其中，1-4號管中加入的模板分別為大腸桿菌，沙門氏菌，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的基因組DNA，5 號管為陰性對照，6號管為陽性對照；
圖5為實施例4中普通PCR方法檢測超級細菌MW-7基因特異性檢測結果，其中，1-4號 PCR反應模板分別為大腸桿菌，沙門氏菌，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的基因組DNA，5 號為陰性對照，6號為陽性對照。
具體實施例方式為了更好的理解本發(fā)明，下面結合具體實施例來進一步說明。實施例1 制備檢測超級細菌MW-7基因的試劑盒
設置檢測超級細菌MW-7基因的試劑盒，該試劑盒包括裝有反應液的LAMP反應管， 反應液以25 μ L計，含有12. 5 μ L 2X等溫反應緩沖液、1.0 μ L Bst DNA聚合酶、40 pmol內(nèi)引物FIP、40 pmol內(nèi)引物BIP、5 pmol外引物F3、5 pmol外引物B3、20 pmol環(huán)引物LF、20 pmol環(huán)引物LB、余量為滅菌雙蒸水； 其中，Bst DNA聚合酶的活性單位為8U/ μ L ；
2Χ 等溫反應緩沖液中含有 40 mM pH 為 8. 8 的 iTris-HCUO mM KCl,16 mM MgSO4, 20 mM (NH4)2S04、0. 2wt% Tween20、1.6 M 甜菜堿、2· 8 mM dNTP。外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、環(huán)引物LF、環(huán)引物LB的核苷酸序列如下
夕卜弓I物 F3 :5，-GGCCACACCAGTGACAAT-3，， 夕卜弓I物 B3 :5，-GCGGAATGGTCATCACGAT-3，，
內(nèi)引物 FIP :5’ -ACTTGGCCTTGCTGTCCTTGATGTTGGGATCGACGGCAC-3，， 內(nèi)引物 BIP :5’ -CGCTCGGCAATCTCGGTGATGCTGGCCTTGGGGAACGC-3，， 環(huán)引物 LF :5，-GCTGTAGCGAAAACCACCG-3，， 環(huán)引物 LB :5，-ACACTGAGCACTACGCCG-3，，
其中，外引物與內(nèi)引物的摩爾比為1:8，外引物與環(huán)引物的摩爾比為1:4。為了設置對照組，每個試劑盒中最少設置三個LAMP反應管，此試劑盒設置六個 LAMP反應管。擴增產(chǎn)物的副產(chǎn)物焦磷酸離子與Mg2+反應會產(chǎn)生焦磷酸鎂(白色沉淀)的衍生物， 此衍生物與生成的擴增產(chǎn)物成正比，由于LAMP法能產(chǎn)生大量的擴增產(chǎn)物，衍生物產(chǎn)量也會大增，于是可以呈現(xiàn)出肉眼可見的白色沉淀，可驗證是否有靶基因的存在。為了更明顯的觀察擴增結果，試劑盒中設置有熒光染料鈣黃綠素(螯合劑)，與試劑中的錳離子(Mn2+)結合處于淬滅狀態(tài)，擴增產(chǎn)物的副產(chǎn)物焦磷酸離子與Mn2+結合釋放鈣黃綠素，淬滅狀態(tài)解除，發(fā)出黃綠色熒光。因此便于根據(jù)擴增產(chǎn)物顏色變化來判斷擴增結^ ο實施例2 用環(huán)介導等溫擴增方法檢測超級細菌MW-7基因的檢測方法
(1)提取待檢臨床菌株的基因組總DNA:將待檢的臨床菌株過夜培養(yǎng)后，取1 mL的菌液 12000 rpm離心2 min，徹底棄上清，取沉淀用細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)提取細菌基因組總DNA，最后溶于50 μ L滅菌雙蒸水中，測定DNA濃度為300 ng/uL,-20 °C保存?zhèn)溆谩?2) LAMP擴增使用實施例1中的試劑盒，設置兩套反應體系，其中一套加入熒光染料，另一套不加入。每套體系中都設置一個檢測管、一個陽性對照管和一個陰性對照管。 在檢測管內(nèi)加入2 μ L待檢DNA樣本，陽性對照管中加入2 PL含MW-7基因的洛菲不動桿菌基因組DNA (DNA濃度也為300 ng/ μ L)，陰性對照管中加入2 μ L滅菌雙蒸水。加完后混勻，稍離心，使沾在管壁上的樣品也溶解在反應液中。將反應管置水浴鍋中進行擴增， 擴增條件為65°C水浴恒溫反應35 min.(3)結果分析
①在加入熒光染料反應體系的反應管中觀察反應后的混合液顏色，陽性對照管變?yōu)榫G色，陰性對照管中為橙色，檢測管中為綠色，說明待檢細菌中含有超級細菌基因，因圖片處理成黑白之后，顏色對比完全看不出來，所以相應的圖沒有附上；
②在不加熒光染料的反應體系中，陽性對照管中出現(xiàn)白色沉淀，陰性對照管中未出現(xiàn)白色沉淀，檢測管中出現(xiàn)白色沉淀，說明待檢細菌中含有超級細菌基因，如圖1所示。實施例3 超級細菌MW-7基因LAMP檢測方法與普通PCR方法檢測靈敏度比較取含MW-7基因的超級細菌洛菲不動桿菌基因組DNA(濃度為300 ng/ μ L)，按10倍比
稀釋，分別為原液的1，10、10_2，10_3，10_4，10_5，10_6，分別取1 μ L作為LAMP反應和PCR反應的模板，以滅菌雙蒸水為陰性對照。在7個LAMP反應管和7個PCR反應管中分別加入以上倍比稀釋的含MW-I基因的細菌基因組DNA 1 μ L，第8管中分別加入滅菌雙蒸水1 μ L。其中LAMP反應管置于65°C恒溫水浴鍋中反應35 min,反應結束后直接用肉眼觀察白色沉淀產(chǎn)生與否。PCR反應中所用引物為根據(jù)NCBI上已知的NDM-1基因保守序列用I^rimer5. 0軟件設計，按以下堿基序列經(jīng)DNA合成儀合成。上游引物為N-1-up :5，-GGCGGAATGGCTCATCACGA-3，， 下游引物為 N-1-down :5，- CGCAACACAGCCTGACTTTC-3，，
擴增目的片段大小為觀7 bp。PCR反應體系設置為總體積25 yL，其中10XPCR緩沖液 2.5 μ L, dNTP 0.5 μ LUO μΜ 上游引物 N-l-up 0.5 μ LUO μ M 下游引物 N-l-down 0.5 μ L, Taq DNA聚合酶0.25 μ L、模板1 μ L、滅菌雙蒸水補齊25 μ L0 PCR產(chǎn)應條件為95°C 10 min，然后進行；35個循環(huán)，循環(huán)條件為95°C 1 min,60°C 45 s,72°C 45 s，最后 72°C延伸10 min, 4°C forever，反應時間是2. 5小時。反應結束后取PCR產(chǎn)物進行1. 5% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
LAMP結果顯示，不加熒光染料鈣黃綠素的反應管廣6管內(nèi)均出現(xiàn)白色沉淀，7、管內(nèi)無白色沉淀產(chǎn)生，如圖2所示。加入熒光染料鈣黃綠素的反應管內(nèi)的液體顏色，Γ6管內(nèi)顏色均為明顯的綠色，7、管內(nèi)顏色均為橙色。說明原液稀釋10_5還可以檢測到超級細菌 NDM-I基因。因圖片處理成黑白之后，顏色對比完全看不出來，所以相應的圖沒有附上。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測顯示反應管廣4均出現(xiàn)目的條帶，且條帶越來越淡，而5、 未出現(xiàn)目的條帶。說明原液稀釋10_3可以檢測到超級細菌MW-7基因，如圖3所示。綜合LAMP和PCR反應結果可以得出，LAMP反應靈敏度比PCR反應要高2個數(shù)量級(至少100倍)，且反應時間比PCR縮短1.5 2個小時，不需要用凝膠電泳檢測，直接通過肉眼觀察白色沉淀或加入染料顯色即可判定結果。實施例4 超級細菌MW-7基因LAMP檢測方法和普通PCR方法特異性比較選擇大腸桿菌(ATCC 25922)，沙門氏菌(ATCC 50035)，金黃色葡萄球菌(ATCC
四213)，銅綠假單胞菌(ATCC 27853)作為試驗菌株，分別提取基因組DNA，按照實施例2中所建立的超級細菌MW-7基因環(huán)介導等溫擴增檢測方法進行檢測；同時以大腸桿菌(ATCC 25922)，沙門氏菌(ATCC 50035)，金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)，銅綠假單胞菌(ATCC 27853)的基因組DNA為模板按照實施例3的PCR反應體系和檢測程序進行PCR擴增；都以洛菲不動桿菌(含MW-7基因)基因組DNA作為陽性對照，滅菌雙蒸水作為陰性對照，驗證本發(fā)明所建立的LAMP方法的特異性。LAMP結果只有陽性對照管出現(xiàn)白色沉淀，如圖4所示，PCR結果也顯示只有陽性對照管經(jīng)電泳檢測有基因特異性目的條帶，如圖5所示，其余試驗菌株均為陰性結果。 說明本發(fā)明所建立的LAMP方法檢測超級細菌基因特異性好，與PCR方法一致性達 100%，由于LAMP方法更加直觀簡便，且耗時短，因此更加適合臨床快速檢測的需要。
權利要求
1.一種環(huán)介導等溫擴增超級細菌MW-7基因的引物，其特征是由一對外引物，一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物組成，其核苷酸序列分別如下外引物 F3 :5，-GGCCACACCAGTGACAAT-3，， 夕卜弓I物 B3 :5，-GCGGAATGGTCATCACGAT-3，，內(nèi)引物 FIP :5’ -ACTTGGCCTTGCTGTCCTTGATGTTGGGATCGACGGCAC-3，， 內(nèi)引物 BIP :5’ -CGCTCGGCAATCTCGGTGATGCTGGCCTTGGGGAACGC-3，， 環(huán)引物 LF :5，-GCTGTAGCGAAAACCACCG-3，， 環(huán)引物 LB :5，-ACACTGAGCACTACGCCG-3，，其中，外引物與內(nèi)引物的摩爾比為1:8，外引物與環(huán)引物的摩爾比為1:4。
2.一種檢測超級細菌MW-7基因的試劑盒，其特征是包括若干個裝有反應液的LAMP反應管，其中，每25 μ L反應液中含有12. 5 μ L 2 X等溫反應緩沖液、1.0 μ L Bst DNA聚合酶、40 pmol 內(nèi)引物 FIP、40 pmol 內(nèi)引物 BIP、5 pmol 外引物 F3、5 pmol 外引物 B3、20 pmol 環(huán)引物LF、20 pmol環(huán)引物LB，余量為滅菌雙蒸水； 其中，Bst DNA聚合酶的活性單位為8U/ μ L ；2Χ 等溫反應緩沖液中含有 40 mM pH 為 8. 8 的 iTris-HCUO mM KCl,16 mM MgSO4, 20 mM (NH4)2S04、0. 2wt% Tween20、1.6 M 甜菜堿、2· 8 mM dNTP。
3.根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于還包括1μ L鈣黃綠素。
4.一種檢測超級細菌MW-7基因的檢測方法，其特征是包括以下步驟(1)提取待檢細菌基因組總DNA；(2)使用權利要求2或3所述的試劑盒進行檢測，具體操作為將待檢細菌基因組DNA 加入LAMP反應管的反應液內(nèi)，混勻，同時設陰性對照和陽性對照，陽性對照中加入反應液內(nèi)的為含有基因的基因組DNA，陰性對照中加入反應液內(nèi)的為滅菌雙蒸水，將LAMP反應管置水浴鍋中進行擴增，擴增條件為65°C水浴恒溫反應35 min0
5.根據(jù)權利要求4所述的檢測方法，其特征是步驟(2)中待檢細菌基因組DNA為含DNA 的濃度為0. 003-300 ng/ μ L的DNA溶液。
6.根據(jù)權利要求4所述的檢測方法，其特征是LAMP反應管中出現(xiàn)白色沉淀為陽性結果，不出現(xiàn)白色沉淀為陰性結果。
7.根據(jù)權利要求4所述的檢測方法，其特征是在擴增反應前的反應管中加入1μ L鈣黃綠素，反應結束后擴增產(chǎn)物變?yōu)榫G色的為陽性結果，橙色的是陰性結果。
全文摘要
本發(fā)明屬于細菌基因檢測技術領域環(huán)介導等溫擴增超級細菌NDM-1基因的引物，由一對外引物，一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物組成，外引物與內(nèi)引物的摩爾比為1:8，外引物與環(huán)引物的摩爾比為1:4。檢測超級細菌NDM-1基因的試劑盒，包括若干個裝有反應液的LAMP反應管，反應液中含有2×等溫反應緩沖液、BstDNA聚合酶、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、外引物F3、外引物B3、環(huán)引物LF、環(huán)引物LB，滅菌雙蒸水。用試劑盒檢測超級細菌NDM-1基因的檢測方法。解決了現(xiàn)有技術時間長、工作量大、交叉污染、操作復雜等缺陷；具有特異性強、靈敏度高、快速且成本低、操作方法更簡單，適于現(xiàn)場快速檢測的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/04GK102242210SQ20111019046
公開日2011年11月16日 申請日期2011年7月8日 優(yōu)先權日2011年7月8日
發(fā)明者劉玉慶, 張秀美, 朱曉玲, 杜以軍, 白華, 胡新新, 胡明, 駱延波, 齊靜 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所