專利名稱：一種高效誘導表達型啟動子及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及ー種高效誘導表達型啟動子及應用。
背景技術(shù)：
植物啟動子是一段能與RNA聚合酶及其轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合、決定基因轉(zhuǎn)錄起始的DNA序列。啟動子作為ー種基因表達的重要順式作用元件，從1983年第一株轉(zhuǎn)基因植物問世以來，一直是基因工程中的研究熱點，在基因表達調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，很大程度上決定目的基因的時空表達特性。目前植物基因工程中廣泛應用的是組成型啟動子，驅(qū)動目的基因在植物生長發(fā)育時期的各個組織均有表達，造成物質(zhì)和能量的浪費，増加植物代謝負擔，一定程度上影響植物的發(fā)育，甚至引起植物形態(tài)的改變。
因此采用特異性啟動子取代組成型啟動子，實現(xiàn)對基因表達的預想調(diào)控，從而實現(xiàn)基因的組織器官特異性、發(fā)育階段特異性、外部環(huán)境內(nèi)部激素誘導特異性的準確調(diào)控表達，并嘗試依此作為研究順式作用元件和反式作用因子相互作用的方法。大豆是植物發(fā)育生物學和分子生物學研究的模式植物，大豆基因組測序工作的完成，為大豆基因功能的研究提供了便利條件，但目前關(guān)于大豆高效誘導表達啟動子分離的工作研究甚少。因此，利用逆境誘導型啟動子驅(qū)動抗逆基因在改良作物的抗性中成為目前研究的熱點。然而，目前能應用于轉(zhuǎn)基因研究的誘導型啟動子仍然很少。因此，對于新的抗逆相關(guān)啟動子的克隆、順式作用元件具體序列的確定、各元件之間的相互作用，以及與這些元件互作的轉(zhuǎn)錄因子的研究仍然是啟動子研究的重點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種高效誘導表達型啟動子及應用。本發(fā)明提供的DNA片段,來源于大豆(Glycine max (L. )Merrill.),為如下I) _8)中任一所述的DNA片段I)序列表的序列I所示的DNA分子；2)序列表的序列I自5’末端第8-1501位核苷酸；3)序列表中序列I自5'末端起第457-1501位核苷酸；4)序列表中序列I自5'末端起第655-1489位核苷酸；5)序列表中序列I自5'末端起第768-1487位核苷酸；6)序列表中序列I自5'末端起第1305-1501位核苷酸；7)在嚴格條件下與1)_6)中任一所述DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA片段；8)與I) -7)中任一所述DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA片段。上述序列I由1512個核苷酸組成。上述嚴格條件可為在6XSSC，O. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC，0. 1% SDS和1XSSC，0. 1% SDS各洗膜一次。含有以上任一所述DNA片段的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組載體為將上述編碼基因插入PBI 121的HindIII和Bam HI識別位點間獲得的重組載體。擴增以上任一所述DNA片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。
所述引物對為如下任一 1)-5)所示的引物對1)、所述引物對中的一條引物為序列2所示的核苷酸，另一條引物為序列3所示的核苷酸；2):所述引物對中的一條引物為序列4所示的核苷酸，另一條引物為序列5所示的核苷酸；3):所述引物對中的一條引物為序列6所示的核苷酸，另一條引物的序列為序列7所示的核苷酸；4):所述引物對中的一條引物為序列8所示的核苷酸，另一條引物為序列9所示的核苷酸；5):所述引物對中的一條引物為序列10所示的核苷酸，另一條引物為序列11所示的核苷酸。上述DNA片段使目的基因在植物組織中表達的應用也是本發(fā)明保護的范圍。上述應用中，所述植物組織為根、莖、葉、花或種子。上述應用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。上述應用中，所述單子葉植物為煙草，所述雙子葉植物為擬南芥。所述表達是通過光照調(diào)節(jié)、激素脅迫或高溫脅迫實現(xiàn)的；所述激素優(yōu)選為細胞分裂素、赤霉素、水楊酸或脫落酸；所述高溫為37°C和/或42°C。所述光照調(diào)節(jié)的方式為如下I)-4)中任一一種1)在16h光/8h暗條件下培養(yǎng)48小時后，連續(xù)48小時光照處理；2)在16h光/8h暗條件下培養(yǎng)48小時后，連續(xù)48小時暗·處理；3)在8h光/16h暗條件下培養(yǎng)48小時后，連續(xù)48小時光照處理；4)在8h光/16h暗條件下培養(yǎng)48小時后，連續(xù)48小時暗處理。本發(fā)明的實驗證明，將本發(fā)明中啟動子GBPl與GUS基因一起導入煙草或擬南芥中后，赤霉素、水楊酸、細胞分裂素處理以及一定范圍內(nèi)高溫能促進啟動子調(diào)控GUS基因的表達受水楊酸誘導表達，表明該啟動子在植物脅迫抗性中起作用；受細胞分裂素誘導表達，表明該啟動子在細胞分裂増殖中起作用；受赤霉素誘導表達，表明該啟動子在植物赤霉素誘導開花途徑中起作用；受高溫誘導表達，表明該啟動子可能參與抗旱耐熱反應。將本發(fā)明的啟動子與⑶S基因一起導入擬南芥后，轉(zhuǎn)基因幼苗植株分別置于長日照(16h光/8h暗)、短日照(8h光/16h暗)下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該啟動子受短日照誘導表達，⑶S表達平均水平約為長日照下2倍。研究還發(fā)現(xiàn)連續(xù)光或連續(xù)暗處理均打破了該啟動子原有的晝夜節(jié)律性。將本研究中熱激相關(guān)的GBPl啟動子導入到植物中，培育抵御惡劣環(huán)境的植株，在更廣泛的環(huán)境和條件下(如高溫炎熱性地域)種植，提高農(nóng)作物產(chǎn)量，也可以在沙漠、荒山等地增加綠化，保護環(huán)境。此外，利用其對外源激素的應答效應，改良作物品種，進而大幅提高作物產(chǎn)量性狀，創(chuàng)造更高的經(jīng)濟價值。由于該啟動子同時受光周期調(diào)控，短日照誘導，長日照抑制，在植物的引種、育種工作中可將光周期誘導性啟動子，與不同的光周期效應因子融合導入植物體內(nèi)，通過控制日長驅(qū)動目的基因，調(diào)節(jié)植株的光周期敏感性，調(diào)節(jié)植物的開花時間，改變植物不同緯度的種植范圍，具有極為重要的意義。由于該啟動子受日長調(diào)控，因此還可以和其他的目的基因融合，僅需要改變?nèi)臻L的長短控制目的基因的表達量，簡單、方便易行。因此，在轉(zhuǎn)基因育種工作中將本發(fā)明的啟動子取代組成型啟動子，可實現(xiàn)對目的基因表達的準確調(diào)控，進而提高其對環(huán)境的適應性，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的應用前景。


圖I為GBPl基因啟動子GBPl圖2為GBPl基因啟動子順式作用元件分析
圖3為GBPl基因啟動子GBPl及該啟動子5'端缺失片段pBI121質(zhì)粒載體構(gòu)建示意4為GBPl基因啟動子GBPl及該啟動子5'端缺失片段轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后的PCR擴增示意5為GBPl基因啟動子GBPl Tl代轉(zhuǎn)基因煙草葉片的⑶S基因表達示意6為水楊酸(SA)、赤霉素(GA3)、細胞分裂素(6_BA)，脫落酸(ABA)噴施Tl代轉(zhuǎn)基因煙草植株后根中GUS組織化學染色示意7為水楊酸(SA)、赤霉素(GA3)、細胞分裂素(6_BA)，脫落酸(ABA)噴施Tl代轉(zhuǎn)基因煙草植株后莖中⑶S組織化學染色示意8為水楊酸(SA)、赤霉素(GA3)、細胞分裂素(6_BA)，脫落酸(ABA)噴施Tl代轉(zhuǎn) 基因煙草植株后葉中GUS組織化學染色示意9為為水楊酸(SA)、赤霉素(GA3)、細胞分裂素(6_BA),脫落酸(ABA)噴施Tl代轉(zhuǎn)煙草植株后GUS活性示意10為熱激處理后Tl代轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的GUS組織化學染色示意11為熱激處理后Tl代轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的⑶S活性示意12為GBPl基因啟動子GBPl Tl代轉(zhuǎn)基因擬南芥發(fā)育不同時期的⑶S組織化學染色示意13為GBPl基因啟動子GBPl及5'端缺失片段轉(zhuǎn)基因擬南芥生長6天、15天后的GUS組織化學染色示意14為水楊酸(SA)噴施轉(zhuǎn)GBPl啟動子(A)及5'端缺失片段擬南芥Tl代植株后GUS活性示意圖(B)圖15為為赤霉素(GA3)噴施轉(zhuǎn)GBPl啟動子(A)及5'端缺失片段擬南芥Tl代植株后GUS活性不意圖(B)圖16為細胞分裂素(6-BA)噴施轉(zhuǎn)GBPl啟動子(A)及5'端缺失片段擬南芥Tl代植株后GUS活性示意圖(B)圖17為熱激處理轉(zhuǎn)GBPl啟動子(A)及5'端缺失片段擬南芥Tl代植株⑶S活性示意圖(B)圖18轉(zhuǎn)GBPl啟動子擬南芥Tl代植株96h光周期(長日照48h后連續(xù)48h光照)下GUS基因表達示意圖(黒色虛框代表光期，黒色實框代表暗期，淺色條紋代表原有暗期被光替代)。圖19轉(zhuǎn)GBPl啟動子擬南芥Tl代植株96h光周期(長日照48h后連續(xù)48h黑暗)下⑶S基因表達示意圖(黒色虛框代表光期，黒色實框代表暗期，深色條紋代表原有光期被暗替代)圖20轉(zhuǎn)GBPl啟動子擬南芥Tl代植株96h光周期(短日照48h后連續(xù)48h光照)下GUS基因表達示意圖(黒色虛框代表光期，黒色實框代表暗期，淺色條紋代表原有暗期被光替代)圖21轉(zhuǎn)GBPl啟動子擬南芥Tl代植株96h光周期(短日照48h后連續(xù)48h黑暗)下⑶S基因表達示意圖(黒色虛框代表光期，黒色實框代表暗期，深色條紋代表原有光期被暗替代)
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。DNA片段回收采用博大泰克公司回收試劑盒，并按其說明書進行操作。所有無機化學試劑和有機溶劑購自上海化學試劑廠，試劑均為國產(chǎn)分析純，引物由上海生エ公司合成，Ependorf梯度式PCR擴增儀購自德國Eppendorf公司。植物材料大豆(Glycine max(L. )Merrill.)光敏感品種東農(nóng)42記載在陳麗君，不同播期對大豆東農(nóng)42產(chǎn)質(zhì)量性狀動態(tài)變化規(guī)律研究，[J],大豆科學，2008，(03).中，公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學獲得。擬南芥(Arabidopsis thaliana) Columbia野生型(Col-Ο,以下簡稱野生型擬南芥)記載在孫楓，劉裴清，董漢松.晝夜節(jié)律調(diào)控擬南芥核黃素信號傳導[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2010 (2) :17-20.公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學獲得。 煙草(Nicotianatabacum)記載在 Legg, P. D.，Collins, G. B.，Litton, C. C.，1970. Registration of LA Burley 21 tobacco germplasm. Crop Sci. 10, 212.中，公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學獲得。農(nóng)桿菌LBA4404菌株記載在根瘤農(nóng)桿菌介導B. t.基因和CpTI基因?qū)ㄒ说霓D(zhuǎn)化.植物生理與分子生物學學報.2002，28 (3) :193-199中，公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學獲得。pMD-18T vector 購自 TAKARA 公司。載體pBI 121 記載在 Chen P, Wang C, Soong S, To K. Complete sequence ofthe binary vector pBI 121 and its application in cloning T-DNA insertion fromtransgenic plants. Molecular Breeding. 2003,11 (4) :287-293.中，公眾可從東北農(nóng)業(yè)大
學獲得。限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶等均購自TAKARA公司。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結(jié)果取平均值。實施例I、啟動子的克隆及載體構(gòu)建I、植物總DNA的提取大豆(Glycine max (L. )Merrill.)光敏感品種東農(nóng)42,培養(yǎng)于25°C光照培養(yǎng)箱，250ymolm^sec^白光，長日照(LD) (16h光/8h暗)條件下生長，剪取第三個三出復葉，按照CTAB法提取大豆總DNA。2、引物設計根據(jù)Phytozome大豆基因組文庫(www.phytozome.net)報道的序列，Blast比對分析后定位GBPl基因起始密碼子上游序列,應用Primer Premier 5.0設計5'側(cè)翼序列下游引物，具體引物序列如表I所示表I引物序列
引物名稱引物序列(5' —3')
pGBPl-FGCMGCTT GMAGCACATGGCATTATTAGAGG (序列 2)
權(quán)利要求
1.DNA片段，為如下I) -9)中任一所述的DNA片段 1)序列表的序列I所不的DNA分子； 2)序列表的序列I自5’末端第8-1501位核苷酸； 3)序列表中序列I自5'末端起第457-1501位核苷酸； 4)序列表中序列I自5'末端起第655-1489位核苷酸； 5)序列表中序列I自5'末端起第768-1487位核苷酸； 6)序列表中序列I自5'末端起第1305-1501位核苷酸； 7)在嚴格條件下與I)-6)中任一所述DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA片段； 8)與1)-7)中任一所述DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA片段。
2.含有權(quán)利要求I中所述DNA片段的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
3.擴增權(quán)利要求I中所述DNA片段的引物對。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的引物對，其特征在于 所述引物對為如下任一 1)-5)所示的引物對 1):所述引物對中的一條引物為序列2所示的核苷酸，另一條引物為序列3所示的核苷酸； 2):所述引物對中的一條引物為序列4所示的核苷酸，另一條引物為序列5所示的核苷酸； 3):所述引物對中的一條引物為序列6所示的核苷酸，另一條引物為序列7所示的核苷酸； 4):所述引物對中的一條引物為序列8所示的核苷酸，另一條引物為序列9所示的核苷酸； 5):所述引物對中的一條引物為序列10所示的核苷酸，另一條引物為序列11所示的核苷酸。
5.權(quán)利要求I所述DNA片段在使目的基因在植物組織中表達中的應用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的應用，其特征在于所述植物組織為根、莖、葉、花或種子。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6中所述的應用，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一所述的應用，其特征在于所述單子葉植物為煙草，所述的雙子葉植物為擬南芥。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一所述的應用，其特征在于所述表達是通過光照調(diào)節(jié)、激素脅迫或高溫脅迫實現(xiàn)的；所述激素優(yōu)選為細胞分裂素、赤霉素、水楊酸、脫落酸，所述高溫為37°C和/或 42°C ； 所述光照調(diào)節(jié)的方式為如下I)-4)中任一一種 1)在16h光/8h暗條件下培養(yǎng)48小時后，連續(xù)48小時光照處理； 2)在16h光/8h暗條件下培養(yǎng)48小時后，連續(xù)48小時暗處理； 3)在8h光/16h暗條件下培養(yǎng)48小時后，連續(xù)48小時光照處理； 4)在8h光/16h暗條件下培養(yǎng)48小時后，連續(xù)48小時暗處理。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效誘導表達型啟動子及應用。本發(fā)明提供DNA片段(GBP1)，來源于大豆(Glycine max(L.)Merrill.)，為如下1)-5)中任一所述的DNA分子1)序列表的序列1所示的DNA分子；2)序列表的序列1自5’末端第8-1501位核苷酸；3)序列表的序列1中任意一段包含序列1中自5′末端第1305-1501位核苷酸的DNA分子；4)在嚴格條件下與1)、2)或3)所述DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；5)與1)、2)或3)中所述DNA序列具有90％以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。本發(fā)明的啟動子在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中將會有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N1/19GK102864145SQ20111018984
公開日2013年1月9日 申請日期2011年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月7日
發(fā)明者李文濱, 王志新, 趙琳 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學