專利名稱：一種白腐菌復合發(fā)酵生產漆酶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的用于協(xié)同高產漆酶的白腐菌復合發(fā)酵的培養(yǎng)方法，并分別利用不同農作物秸稈為發(fā)酵底物，包括玉米桿、玉米棒、小麥桿和稻草桿，屬于生物工程和微生物發(fā)酵領域。
背景技術：
漆酶(Laccase，Ε. C. 1. 10. 3. 2)是一類含銅的多酚氧化酶，最早是從漆樹的汁液中發(fā)現的，后來發(fā)現其還廣泛存在于真菌中，尤其在白腐菌中產量豐富，而白腐菌被認為是唯一能夠降解全部木質成分的生物體。漆酶利用分子氧作為最終電子受體，能夠廣泛地氧化多酚、甲氧基苯酚、二元胺和其他酚類及芳香類化合物，可以將酚類物質氧化成醌類，并能催化芳香環(huán)支鏈C α -C β鍵的斷裂，還可催化金屬有機化合物氧化，以及催化底物氧化聚合或交聯。由于漆酶作用底物廣泛，催化活性高，因而廣泛應用于造紙、生物修復、生物檢測和食品工業(yè)等領域。在造紙工業(yè)中，漆酶可在常溫常壓條件下選擇性地降解木質素而不影響纖維素和半纖維素，提高紙漿得率并且有效降低成本；經漆酶處理的紙漿制得的紙張具有良好的抗張強度和平滑度；造紙廢水中的有機氯化物等毒性物質也可由漆酶降解，利于減少環(huán)境污染。由于漆酶可降解環(huán)境中的多種有毒物質，因此可以用于染料脫色并對污染的局部環(huán)境進行生物修復。此外，漆酶在催化過程中消耗氧氣，使得這一過程很容易地被轉化為電信號而高靈敏地得到檢測，因此可用于制備生物傳感器進行生物檢測。在食品工業(yè)中，啤酒、果汁等飲料在儲存期間往往出現渾濁或沉淀，這與其中含有酚或芳胺類物質有關。用漆酶預先處理麥芽汁，使其中的酚氧化后除去，則可提高啤酒的質量和透明度。經固定化漆酶處理的葡萄汁和葡萄酒，除去其中的酚類物質，能長期儲存并保持澄清。目前，漆酶主要從真菌中獲得，真菌漆酶是通過絲狀真菌菌絲分泌到培養(yǎng)基中的， 其中漆酶分泌表達量最高的是白腐菌。白腐菌被認為是目前最活躍的木質素降解有機體， 能夠解聚甚至礦化所有木質成分(主要是纖維素、半纖維素和木質素)，具有顯著降解有色、芳香、異質性且頑固的在植物細胞壁中自然合成的木質素類苯丙單位。很多白腐菌都有較高的漆酶表達，因而是一種較為理想的漆酶來源。由于漆酶具有廣闊的應用前景，因此找到一種能夠以較低成本大規(guī)模生產漆酶的方法是當前推廣漆酶應用的最大瓶頸之一。目前國內關于漆酶工業(yè)化生產的報道很少，漆酶的生產還處于理論探索和試驗階段。而且當前漆酶的發(fā)酵培養(yǎng)方法主要僅限于單菌的液體或固體發(fā)酵培養(yǎng)，研究也主要是針對單菌的液體或固體發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基、發(fā)酵條件等進行優(yōu)化，尚未出現特別突出可以工業(yè)化生產的產酶效果。自然界中存在很多微生物降解群落，其中各種微生物之間既有協(xié)同作用，也有拮抗作用。彼此協(xié)同的微生物，能夠通過各種代謝產生許多降解酶類或氧化還原類物質，共同降解環(huán)境中的動植物殘體、垃圾等，可以說很多微生物降解群落本身就是一個高效的降解系統(tǒng)。如果能夠選擇兩種或兩種以上具有協(xié)同作用的菌株進行組合發(fā)酵，利用各種農作物殘體，如農作物秸稈等，來進行漆酶的生產，不僅能很好地利用農作物秸稈等廢棄物，減少農作物秸稈燃燒帶來的環(huán)境問題，而且生產成本低廉、附加值高，是一種極具潛力的生產方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種白腐菌復合發(fā)酵生產漆酶的方法，以農作物秸稈為發(fā)酵底物， 利用白腐菌屬的組合菌通過微生物發(fā)酵法生產漆酶，工藝簡單，條件溫和，產漆酶效率高?！N白腐菌復合發(fā)酵生產漆酶的方法，包括向培養(yǎng)液中接入活化后的組合菌，于25 30°C條件下發(fā)酵培養(yǎng)9 12天。所述的組合菌由白腐菌屬的射脈側菌、污叉絲孔菌和蟲擬蠟菌中的至少兩種組成。所述的射脈側菌(Phlebia radiate, PR DSM 5111)和污叉絲孔菌(Dichomitus squalens, DS DSM 9615)均購自 Deutsche Sammulung von Microorganismen und Zellkulturen(DSMZ)；蟲擬蠟菌(Ceriporiopsis subvermispora, CS ACCC 31513)購自中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)。白腐菌是目前最活躍的木質素降解有機體，能夠分泌胞外氧化酶降解木質素，是一種較為理想的漆酶來源。優(yōu)選地，所述的組合菌由射脈側菌和污叉絲孔菌組成，因為這兩株菌株組合發(fā)酵農作物秸稈時，菌株之間的協(xié)同作用最強，使組合菌能更充分地利用農作物秸稈從而獲得更高酶活的漆酶。所述的菌株的活化過程包括以滅過菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板為活化培養(yǎng)基， 選擇相同厚度的馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板，分別接入射脈側菌、污叉絲孔菌和蟲擬蠟菌，在 25 條件下活化培養(yǎng)5 7天。優(yōu)選地，菌株接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板后，在
條件下活化培養(yǎng)7天，待菌絲體長滿平板備用。所述的培養(yǎng)液由基礎液體培養(yǎng)基和農作物秸稈粉組成，所述的農作物秸稈粉為玉米桿粉、玉米棒粉、小麥桿粉和稻草桿粉中的至少一種。其中，所述的基礎液體培養(yǎng)基包括以下組分葡萄糖 0. 1 1. Og，蛋白胨 0. 03 0. 3g，KH2PO4O. 01 0. lg, ZnSO4O. 00001 0. OOlgjK2HPO4O. 01 0. lg，FeSO4O. 00001 0. OOOlgjMnSO4O. 001 0. OlgjMgSO4O. 001 0. Ig和水lOOOmL，基礎液體培養(yǎng)基的pH值為5. 5 6. 5 ；所述的農作物秸稈粉的粒徑為 40 100目；所述的培養(yǎng)液中農作物秸稈粉的質量百分比濃度為1 10%。優(yōu)選地，所述的農作物秸稈粉為玉米棒粉。在所述的發(fā)酵培養(yǎng)條件下，白腐菌屬的組合菌能更好地利用玉米棒粉生產漆酶。所述的培養(yǎng)液中組合菌的接種方式為選擇射脈側菌、污叉絲孔菌和蟲擬蠟菌中的兩株菌接入相同厚度馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板活化至菌絲體長滿平板后，分別挑取IcmXlcm 的菌絲塊各1 5塊接入培養(yǎng)液。所述的培養(yǎng)液接種后于25 30°C條件下發(fā)酵培養(yǎng)9 12天，優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)液接種后于條件下發(fā)酵培養(yǎng)12天。在此發(fā)酵培養(yǎng)條件下，組合菌降解農作物秸稈產漆酶活性最高，且漆酶穩(wěn)定性最好。所述的培養(yǎng)液置于旋轉式搖床中發(fā)酵培養(yǎng)，搖床轉速為50 200rpm，優(yōu)選 140rpm，便于發(fā)酵過程中菌株和農作物秸稈之間充分接觸，確保發(fā)酵反應的充分進行。本發(fā)明方法，選擇發(fā)酵培養(yǎng)過程中不同的時間點，分別取72h、144h、21Mi和288h， 對各樣品的發(fā)酵培養(yǎng)液進行取樣，采用2，2’_聯氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽法(ABTS法)測定樣品中漆酶的酶活，具體為取0. IM pH 5. 0的醋酸鈉緩沖液0. 5mL 和1. OmM的ABTS 0. 4mL,混勻，加入ImL發(fā)酵酶液啟動反應，采用紫外-可見分光光度計在 420nm處測定^iin內吸光度的變化，每分鐘使1 μ moL 2，2’ -聯氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)氧化所需要的酶量定義為一個酶活單位。本發(fā)明方法選擇射脈側菌、污叉絲孔菌和蟲擬蠟菌這三種菌株進行兩兩組合，以農作物秸稈為原料進行協(xié)同液體發(fā)酵，取得了較理想的產酶效果，尤其是射脈側菌和污叉絲孔菌的組合菌，產漆酶酶活不僅明顯高于本發(fā)明所選菌株單菌所產漆酶的酶活，而且優(yōu)于很多已報道的其它產漆酶的方法，且表現出較穩(wěn)定的高酶活特性。本發(fā)明方法采用液體發(fā)酵，取材廣泛，工藝簡單，便于控制；無需芳香化合物或重金屬離子誘導等，條件溫和，安全可靠；產漆酶活性高，穩(wěn)定性好，利于工業(yè)化生產，是一種安全、環(huán)保、成本低廉、產品高效穩(wěn)定，且極具工業(yè)化前景的生產方法。


圖1為本發(fā)明方法的流程示意圖。
具體實施例方式實施例1-3不同組合菌利用玉米棒粉原料產漆酶酶活比較(1)培養(yǎng)液的制備取葡萄糖 1. 0g，蛋白胨 0. 03g, KH2PO4O. 060g, ZnSO4O. OOOlg, K2HPO4O. 04g, FeSO4O. 00005g, MnSO4O. 005g, MgSO4O. 050g，加入 IOOOmL 蒸餾水中，混勻后加
熱溶解，調pH至6. 0，獲得基礎液體培養(yǎng)基；將基礎液體培養(yǎng)基分裝到250mL錐形瓶中，每個錐形瓶所含基礎液體培養(yǎng)基30mL，向其中各加入3. Og粉碎至60目的玉米棒粉，攪拌均勻即得培養(yǎng)液。(2)菌株的活化分別將射脈側菌(PR)、污叉絲孔菌(此)和蟲擬蠟菌(⑶)接種到已滅過菌的厚度相同的馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基上，在條件下活化培養(yǎng)7天。(3)將三株活化的菌株的兩兩組合菌分別接種到步驟(1)獲得的培養(yǎng)液中，其中接種方式為挑取射脈側菌、污叉絲孔菌和蟲擬蠟菌中兩株菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板上 IcmX Icm的菌絲塊各2塊接入培養(yǎng)液，在、搖床轉速140rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)12天。對比例1-3將實施例1-3中三株活化的菌株的兩兩組合菌分別用三株活化的菌株的單菌替代，其余步驟相同，以玉米棒粉為原料發(fā)酵產漆酶。對實施例1-3和對比例1-3的發(fā)酵培養(yǎng)液，分別在72h、144h、21Mi和觀他取樣， 采用ABTS法測定樣品液中漆酶酶活，具體結果見表1。表1不同單菌或組合菌利用玉米棒粉原料產漆酶酶活比較
權利要求
1.一種白腐菌復合發(fā)酵生產漆酶的方法，包括向培養(yǎng)液中接入活化后的組合菌，于25 30條件下發(fā)酵培養(yǎng)9 12天； 其中，所述的組合菌由射脈側菌(Phlebia radiate)、污叉絲孔菌(Dichomitus squalens)禾口蟲擬賭菌(Ceriporiopsis subvermispora)中的至少兩種組成；所述的培養(yǎng)液由基礎液體培養(yǎng)基和農作物秸稈粉組成，所述的農作物秸稈粉為玉米桿粉、玉米棒粉、小麥桿粉和稻草桿粉中的至少一種。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的組合菌由射脈側菌和污叉絲孔菌組成。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的基礎液體培養(yǎng)基由以下組分構成 葡萄糖 0. 1 1. Og,蛋白胨 0. 03 0. 3g, KH2PO4O. 01 0. lg, ZnSO4O. 00001 0. OOlg, K2HPO4O. 01 0. lg，FeSO4O. 00001 0. OOOlgjMnSO4O. 001 0. OlgjMgSO4O. 001 0. Ig 禾口水lOOOmL，基礎液體培養(yǎng)基的pH值為5. 5 6. 5。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的農作物秸稈粉的粒徑為40 100目。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)液中農作物秸稈粉的質量百分比濃度為1 10%。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的農作物秸稈粉為玉米棒粉。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)液接種后于條件下發(fā)酵培養(yǎng)12天。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)液置于搖床中發(fā)酵培養(yǎng)，搖床轉速為50 200rpm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種白腐菌復合發(fā)酵生產漆酶的方法，向培養(yǎng)液中接入活化后的組合菌，于25～30℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)9～12天；其中，所述的組合菌由射脈側菌、污叉絲孔菌和蟲擬蠟菌中的至少兩種組成；所述的培養(yǎng)液由基礎液體培養(yǎng)基和農作物秸稈粉組成，農作物秸稈粉為玉米桿粉、玉米棒粉、小麥桿粉或稻草桿粉中的至少一種。采用本方法，以玉米棒粉為原料，射脈側菌和污叉絲孔菌組合協(xié)同發(fā)酵在第12天產漆酶酶活穩(wěn)定達到110～120U/mL。本發(fā)明方法采用液體發(fā)酵，取材廣泛，工藝簡單；無需芳香化合物或重金屬離子誘導等，條件溫和；產漆酶活性高，穩(wěn)定性好，是一種安全、環(huán)保、成本低廉、產品高效穩(wěn)定，且極具工業(yè)化前景的生產方法。
文檔編號C12R1/645GK102250845SQ201110165649
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月20日 優(yōu)先權日2011年6月20日
發(fā)明者何國慶, 傅明亮, 馮宇, 董亞晨, 陳啟和 申請人:浙江大學