專利名稱：鴨疫里默氏菌用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別涉及鴨疫里默氏菌用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
鴨疫里默氏菌病(Riemerella anatipestifer infection)是家鴨、火雞和多種其它禽類的一種接觸傳染性疾病，也稱為新鴨病、鴨敗血癥、鴨疫綜合癥、鴨疫巴氏桿菌病和鴨傳染性漿膜炎。該病呈世界范圍分布，幾乎已在所有的集約化養(yǎng)鴨生產(chǎn)的國家發(fā)現(xiàn)，是目前危害世界各國養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。鴨疫里默氏菌病呈急性或慢性敗血癥過程，病理變化主要是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎。廣8周齡鴨高度敏感，惡劣的環(huán)境條件或并發(fā)感染可促發(fā)該病。該病的發(fā)病率和死亡率都很高，死亡率最高可達(dá)759Γ100% ；部分感染鴨消瘦，生長發(fā)育遲緩；慢性耐過鴨有神經(jīng)癥狀，可導(dǎo)致殘鴨和僵鴨，淘汰率高，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病在我國已呈漫延之勢，已經(jīng)嚴(yán)重阻礙了我國養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。關(guān)于鴨疫里默氏菌病的診斷，已建立了許多方法。BIOLOG微生物自動鑒定系統(tǒng)是BIOLOG公司研制開發(fā)的新型自動化快速微生物鑒定系統(tǒng)，其通過在鑒定板上使用95種碳源進(jìn)行試驗(yàn)，微生物利用碳源進(jìn)行呼吸，將四唑類氧化還原染色劑，從無色還原成紫色， 從而在微生物鑒定板上形成微生物特征性的反應(yīng)模式或指紋，通過光學(xué)讀數(shù)設(shè)備根據(jù)光密度的吸收值的差異，來讀取顏色變化，再將此指紋與數(shù)據(jù)庫相比較，確定微生物的屬名或種名。該系統(tǒng)操作標(biāo)準(zhǔn)化，簡便快捷，其菌種數(shù)據(jù)庫大、自動化程度高。BIOLOG微生物自動鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫包括鴨疫里默氏菌，因此可利用該系統(tǒng)對鴨疫里默氏菌病進(jìn)行快速鑒定。由于該鑒定系統(tǒng)涉及本病病原鴨疫里默氏菌的培養(yǎng)，但鴨疫里默氏菌的培養(yǎng)條件苛刻，在體外培養(yǎng)需要較高的營養(yǎng)條件，通常需要加入血液進(jìn)行培養(yǎng)，特別是在生產(chǎn)中初次分離病原菌。BIOLOG微生物自動鑒定系統(tǒng)操作要求須使用與該鑒定系統(tǒng)配套專用培養(yǎng)基BUG以及添加新鮮脫纖維綿羊血。一方面配套專用培養(yǎng)基依賴于進(jìn)口， 購買耗時長，價格高，另一方面制備新鮮脫纖維綿羊血操作易污染，部分地區(qū)尚不能提供綿羊，這些限制了 BIOLOG微生物自動鑒定系統(tǒng)的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種培養(yǎng)基添加劑，該添加劑可以用于替代BIOLOG 微生物自動鑒定系統(tǒng)中新鮮脫纖維綿羊血。為實(shí)現(xiàn)上述方案，本發(fā)明的技術(shù)方案為
培養(yǎng)基添加劑，所述培養(yǎng)基添加劑由非疫區(qū)健康鴨心臟或頸動脈來源的血液和抗凝劑組成。進(jìn)一步，所述抗凝劑為濃度為3、g/L的檸檬酸鈉； 進(jìn)一步，所述抗凝劑為濃度為8(T150 mg/L的肝素鈉；
本發(fā)明的目的之二在于提供一種培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基可以用于鴨疫里默氏菌的培養(yǎng)，且生產(chǎn)成本低。為實(shí)現(xiàn)上述方案，本發(fā)明的技術(shù)方案為
含有所述的培養(yǎng)基添加劑的培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和培養(yǎng)基添加劑組成，所述培養(yǎng)基中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 8%的培養(yǎng)基添加劑。進(jìn)一步，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基按重量千分比由以下成分組成 胰蛋白胨 15 17%。
大豆胨Γ7 0Z00
酵母提取物 4飛％。 NaCl5 6%0
瓊脂15 20%。
余量為水，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的PH值為7. 2^7. 4。本發(fā)明的目的之三在于提供含有培養(yǎng)基添加劑的培養(yǎng)基的應(yīng)用，該應(yīng)用為分離和鑒定鴨疫里默氏菌提供了新思路。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
所述的含有培養(yǎng)基添加劑的培養(yǎng)基在分離或鑒定鴨疫里默氏菌中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述應(yīng)用為所述的含有培養(yǎng)基添加劑的培養(yǎng)基在BIOLOG微生物鑒定系統(tǒng)中制備分離或鑒定鴨疫里默氏菌培養(yǎng)基的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于由于本發(fā)明的鴨疫里默氏菌培養(yǎng)基采用多種成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加抗凝劑的鴨全血作為添加物，可應(yīng)用于鴨疫里默氏菌的常規(guī)分離鑒定以及商業(yè)化的BIOLOG鑒定系統(tǒng)，克服了配套專用培養(yǎng)基依賴于進(jìn)口的缺點(diǎn)，同時，因避免了常規(guī)的抽血需脫纖維操作步驟，在培養(yǎng)基制備過程中能減少雜菌污染，降低培養(yǎng)基成本。


圖1為鴨疫里默氏菌在RCAD培養(yǎng)基菌落形態(tài)(整個平板)； 圖2為鴨疫里默氏菌在RCAD培養(yǎng)基菌落形態(tài)(局部)；
圖3為疫里默氏菌ATCC11845在BIOLOG微生物鑒定系統(tǒng)中指紋圖譜； 圖4為鴨疫里默氏菌ATCC11845在BIOLOG鑒定板中的顏色反應(yīng)(24h)； 圖5為鴨疫里默氏菌ATCCl 1845在BIOLOG微生物鑒定系統(tǒng)中讀數(shù)結(jié)果截圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1體積分?jǐn)?shù)為5%的含有培養(yǎng)基添加劑的培養(yǎng)基
胰蛋白胨15 g、大豆胨5g、酵母提取物5 g、NaCl 5 g，溶于900mL蒸餾水，煮沸徹底溶解，冷卻至室溫(25°C);再稱取瓊脂20 g，加入前述溶液并補(bǔ)加蒸餾水至總體積1000 ml，混勻后121°C滅菌15 min，冷卻至45 50°C時將所述添加物按體積比加入50ml含抗凝劑的鴨全血，傾倒平板。凝固后，倒置于37°C恒溫箱24h，無菌檢驗(yàn)后即得，其pH值為7. 2。添加物為采用心臟抽血或頸動脈放血的方法無菌采取非疫區(qū)健康鴨血，其中含抗凝劑80mg/L ( 80 150 mg/L均可)，于_20°C凍存，使用前解凍。實(shí)施例2體積分?jǐn)?shù)為8%的含有培養(yǎng)基添加劑的培養(yǎng)基
胰蛋白胨15 g、大豆胨5g、酵母提取物5 g、NaCl 5 g，溶于850mL蒸餾水，煮沸徹底溶解，冷卻至室溫(25°C);再稱取瓊脂20 g，加入前述溶液并補(bǔ)加蒸餾水至總體積1000 ml，混勻后121°C滅菌15 min，冷卻至45 50°C時將所述添加物按體積比加入80ml含抗凝劑的鴨全血，傾倒平板。凝固后，倒置于37°C恒溫箱24h，無菌檢驗(yàn)后即得，其pH值為7.4。添加物為采用心臟抽血或頸動脈放血的方法無菌采取非疫區(qū)健康鴨血，其中含抗凝劑檸檬酸鈉3g/L (3-5g/L均可)，于-20°C凍存，使用前解凍。實(shí)施例3含有培養(yǎng)基添加劑的培養(yǎng)基的應(yīng)用一材料
1菌株
鴨疫里默氏菌模式菌株ATCC11845，購自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)，12株鴨疫里默氏菌供試菌株，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。2 試劑
胰蛋白胨、大豆胨、酵母提取物購自BD公司，瓊脂購自Biowest公司、BUG+B購自 BIOLOG公司，聚醚F-68和吉冷膠(Gellan Gum)購自Sigma公司，NaCl為國產(chǎn)分析純，脫纖維綿羊血為自制。3其它耗材
鑒定板、濁度標(biāo)準(zhǔn)管(28%T，管規(guī)格為20Χ 150 mm)、V型加樣槽均購自BIOLOG公司。4培養(yǎng)基及接種液
4. 1 BUG+B培養(yǎng)基(IOOOmL)的制備
稱取57 g BUG培養(yǎng)基，加入900 ml蒸餾水，煮沸溶解，冷卻至室溫(25°C)后調(diào)整pH值至7. 4。121°C滅菌15分鐘，冷卻至45飛0°C，加50mL新鮮的脫纖維羊血，搖勻，傾倒平板。 凝固后，倒置于37°C恒溫箱24h，無菌檢驗(yàn)后即得BUG+B成品培養(yǎng)基。4. 2合成培養(yǎng)基配方采用實(shí)施例2所列配方制備。4. 3接種液制備
加0. 2g吉冷膠至1升蒸餾水中，煮沸并持續(xù)攪拌，直至吉冷膠完全溶解；加4g NaCl, 攪拌至完全溶解；加0. 3g聚醚F-68，攪拌至完全溶解；分裝到20 χ 150mm的試管中，每管裝19mL ;121°C滅菌30 min。冷卻后備用。5 方法 5.1細(xì)菌培養(yǎng)
將保存的菌株活化后，接種按上述方法制備好的培養(yǎng)基，37°C燭缸培養(yǎng)24小時。5. 2菌懸液制備及微平板接種培養(yǎng)
用無菌棉簽蘸生理鹽水濕潤后輕輕擦下培養(yǎng)基上的菌落，轉(zhuǎn)入制備好的接種液，混勻得到菌懸液，調(diào)整其濁度，控制在25%濁度標(biāo)準(zhǔn)的士5%以內(nèi)，接種培養(yǎng)用8孔自動移液器將菌懸液加入GN2鑒定板中，每孔150 μ 1，共96孔，蓋上鑒定板蓋，置37°C培養(yǎng)箱濕盒培養(yǎng)。5. 3微平板讀數(shù)
打開BIOLOG鑒定系統(tǒng)的應(yīng)用程序，初始化后，放入鑒定板，選擇合適的參數(shù)，自動讀數(shù)并判定結(jié)果。培養(yǎng)4飛h后讀一次，如果此次讀數(shù)沒有結(jié)果，培養(yǎng)至16 24小時后再讀取結(jié)
6 結(jié)果
6.1細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果
在含有培養(yǎng)基添加劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)基上生長良好，培養(yǎng)24小時菌落呈圓形，凸起、邊緣整齊、透明、有光澤的奶油狀、無色素的光滑型菌落(附圖1和2)。6.2兩種不同培養(yǎng)基的BIOLOG鑒定結(jié)果
1 MOL<>3徵生《 薹定系統(tǒng)鑒定結(jié)果
使用所述含有培養(yǎng)基添加劑的培養(yǎng)基及BIOLOG微生物鑒定系統(tǒng)配套專用培養(yǎng)基的能夠?qū)喴呃锬暇M(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。
6.3培養(yǎng)基成本核算
最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.培養(yǎng)基添加劑，其特征在于所述培養(yǎng)基添加劑由非疫區(qū)健康鴨心臟或頸動脈來源的血液和抗凝劑組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基添加劑，其特征在于所述抗凝劑為濃度為3、g/L的檸檬酸鈉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基添加劑，其特征在于所述抗凝劑為濃度為8(Γ150 mg/L的肝素鈉。
4.含有權(quán)利要求廣3中的任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基添加劑的培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和培養(yǎng)基添加劑組成，其特征在于所述培養(yǎng)基中含有體積分?jǐn)?shù)為5 8%的培養(yǎng)基添加劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的含有培養(yǎng)基添加劑的培養(yǎng)基，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基按重量千分比由以下成分組成胰蛋白胨 15 17%。大豆胨Γ7 0Z00酵母提取物 4飛％。NaCl5 6%0瓊脂15 20%。余量為水，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的PH值為7. 2^7. 4。
6.權(quán)利要求4或5所述的含有培養(yǎng)基添加劑的培養(yǎng)基在分離或鑒定鴨疫里默氏菌中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為所述的含有培養(yǎng)基添加劑的培養(yǎng)基在BIOLOG微生物鑒定系統(tǒng)中制備分離或鑒定鴨疫里默氏菌培養(yǎng)基的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別涉及鴨疫里默氏菌用培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和培養(yǎng)基添加劑兩部分，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基按千分比由以下成分組成胰蛋白胨15~17‰，大豆胨4~7‰，酵母提取物4~6‰，NaCl5~6‰，瓊脂15~20‰及余量的水；所述的含有培養(yǎng)基添加劑的培養(yǎng)基在分離或鑒定鴨疫里默氏菌中的應(yīng)用；由于本發(fā)明的鴨疫里默氏菌培養(yǎng)基采用多種成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加抗凝劑的鴨全血作為添加物，可應(yīng)用于鴨疫里默氏菌的常規(guī)分離鑒定以及商業(yè)化的BIOLOG鑒定系統(tǒng)，克服了配套專用培養(yǎng)基依賴于進(jìn)口的缺點(diǎn)，同時在培養(yǎng)基制備過程中能減少雜菌污染，降低培養(yǎng)基成本。
文檔編號C12N1/20GK102250792SQ20111016374
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月17日
發(fā)明者朱德康, 汪銘書, 程安春, 陳孝躍 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)