專利名稱：基于Cd-VIA族納米顆粒檢測淀粉酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生化醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及酶活性的檢測方法。
背景技術(shù)：
生命體體液內(nèi)蛋白質(zhì)的消化功能對于維持人類健康有著重要作用。淀粉酶是其中的一種重要蛋白質(zhì)。它能夠反映內(nèi)源性腎上腺素活力，可作為交感神經(jīng)系統(tǒng)的一種生物標(biāo)志物。其活性的高低對急性胰腺炎、胰腺癌、肝病、腎功能障礙等惡性疾病的診斷有一定的臨床參考價值。本發(fā)明即針對淀粉酶活性的快速檢測。目前，淀粉酶的活性檢測方法很多，如碘-淀粉比色法、對-硝基苯麥芽七糖苷法等，其中后者已有商品化的試劑盒銷售。這些檢測手段均較為繁瑣復(fù)雜，需要借助大型儀器，經(jīng)過多步操作才能完成。因此，尋找更簡便、快速的酶活檢測方法對于目前發(fā)展迅速的個性化生物醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)具有較大的實(shí)際意義。近年來，納米技術(shù)已深深地滲透到生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，有望為之提供優(yōu)異的分子探針工具。納米結(jié)構(gòu)所具有的小尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)、表面效應(yīng)等使納米材料呈現(xiàn)出獨(dú)特的光學(xué)、電子學(xué)、磁學(xué)等性能，在高效催化、微電子器件、磁介質(zhì)及醫(yī)藥新材料等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。生物納米技術(shù)基于納米材料科學(xué)、化學(xué)與生物技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，對基因治療、生物醫(yī)學(xué)、生物納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建及生物大分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究均具有重要意義。在各類生物納米技術(shù)中，基于比色法的納米檢測技術(shù)(或稱作可視化檢測)是一個亮點(diǎn)。該檢測通過肉眼即可觀察，不僅操作方便，而且成本低廉。其中最典型的納米結(jié)構(gòu)為金納米粒子。 根據(jù)金納米粒子聚集時的顏色改變(紅色到藍(lán)紫色)，可以設(shè)計(jì)各式各樣由之介導(dǎo)的聚集過程，用于檢測核酸/適體、蛋白甚至細(xì)胞在內(nèi)的分析物。從原理上看，由于納米顆粒的穩(wěn)定性受顆粒間靜電作用、立體位阻作用和靜電-立體位阻聯(lián)合作用等控制，一旦維持穩(wěn)定的主導(dǎo)作用受到破壞，納米顆粒就容易引起聚集。常用聚集模式包括交聯(lián)和非交聯(lián)兩大類， 前者利用生物功能化的納米顆粒相互吸引后碰撞產(chǎn)生聚集，用于分子檢測通常需要耗費(fèi)大量時間。例如，基于金納米粒子聚集的可視化DNA探針雜交檢測通常需要幾個小時才能完成。而非交聯(lián)聚集體系利用外來因素破壞納米顆粒表面的穩(wěn)定基團(tuán)，能大大縮短檢測時間， 實(shí)現(xiàn)快速檢測。該模式為本發(fā)明所采用。在過去的十年中，以天然高分子聚合物(如生物多糖、蛋白質(zhì))等為前驅(qū)材料，應(yīng)用“綠色”化學(xué)手段合成納米材料成為一種趨勢。制備的材料具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好等特點(diǎn)，因而在環(huán)境保護(hù)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域受到青睞?；谶@類納米材料可以設(shè)計(jì)選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、能適應(yīng)復(fù)雜體系的新型檢測方法，為發(fā)展生物檢測技術(shù)開辟了廣闊的前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種快速、簡單且成本低廉的基于Cd-VIA族納米顆粒檢測淀粉酶活性的方法。針對現(xiàn)有酶活檢測中步驟較繁雜、檢測時間長、所用試劑眾多、成本偏高等缺點(diǎn)， 本發(fā)明提出了一種由淀粉穩(wěn)定Cd-VIA族納米顆粒的聚集響應(yīng)作為考察指標(biāo)來檢測淀粉酶活性的方法。該酶活檢測方法簡單實(shí)用，采樣量少，檢測快速，成本低廉，能滿足日常檢驗(yàn)的靈敏度需求，可應(yīng)用于常規(guī)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的唾液淀粉酶活性檢測，其技術(shù)方案如下一種基于Cd-VIA族納米顆粒檢測淀粉酶活性的方法，包括如下步驟第一步，取濃度為0. 5 2. Omg/mL、溫度為25°C的淀粉溶液，向50mL淀粉溶液中加入0. 04 0. 2mmol Cd鹽和0. 02 0. Immol VIA族元素的鈉鹽，隨后在60 90°C下加熱1 3小時，合成淀粉穩(wěn)定的Cd-VIA族納米顆粒；第二步，以12000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心第一步所得樣品，棄去上清液，向沉積物中按沉積物水的重量比為1 600加入去離子水，超聲波重新分散獲得棕紅色膠體溶液產(chǎn)
品；第三步，將2 μ L不同活性的商品化標(biāo)準(zhǔn)淀粉酶樣品、25 μ L 0. 2mol/LpH5. 5 8. O 磷酸緩沖液和35 μ L去離子水加入0. 5mL規(guī)格的透明塑料離心管中，得預(yù)備混合溶液，向該預(yù)備溶液加入38 μ L第二步所得產(chǎn)品后立即開始計(jì)時，觀察并記錄與不同活性的商品化標(biāo)準(zhǔn)淀粉酶樣品一一對應(yīng)的混合液中開始出現(xiàn)渾濁時所需消耗的時間，以酶活性的倒數(shù)為橫坐標(biāo)、消耗時間為縱坐標(biāo)，根據(jù)上述數(shù)據(jù)作圖，并采用線性擬合獲得校準(zhǔn)關(guān)系式t = 25. 23+166. 95/Activity,t為所需消耗的時間，單位秒；Activity為酶活性，單位活性單位/mL ；第四步，將2 μ L活性未知的淀粉酶樣品、25 μ L 0. 2mol/L pH5. 5 8. O磷酸緩沖液和35 μ L去離子水混合加入0. 5mL規(guī)格的透明塑料離心管中，得預(yù)備混合溶液，向該預(yù)備溶液加入38 μ L第二步所得產(chǎn)品后立即開始計(jì)時，觀察并記錄混合液中出現(xiàn)渾濁時所需消耗的時間，將此時間代入第三步所得校準(zhǔn)關(guān)系式，計(jì)算出未知的酶活性。有益效果傳統(tǒng)的淀粉酶活檢測方法(如對-硝基苯麥芽七糖苷法)的標(biāo)準(zhǔn)步驟較為繁雜， 所需試劑眾多，且普遍需要借助如分光光度計(jì)、紫外可見光譜儀或熒光光譜儀等光學(xué)儀器來作定量手段，通常所需的檢測時間在半小時以上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明采用的淀粉穩(wěn)定Cd-VIA族納米顆粒制備方法成熟，合成與濃縮純化等操作均較簡單，無需苛刻的反應(yīng)設(shè)備，可在較短時間(0.5 7. 5分鐘)內(nèi)獲得符合要求的產(chǎn)品；利用酶作用下均勻分散的特定納米顆粒喪失穩(wěn)定性而迅速產(chǎn)生渾濁作為考察指標(biāo)來檢測人唾液淀粉酶活性，反應(yīng)前后對比度明顯，容易判斷計(jì)時終點(diǎn)。與傳統(tǒng)方法相比，本方法簡單實(shí)用、用樣量少、檢測快速、靈敏度高。尤其值得注意的是，本發(fā)明以混合液出現(xiàn)渾濁的時間為量化指標(biāo)，該技術(shù)可以在不借助任何現(xiàn)代化儀器的條件下完成酶活檢測，降低了檢測成本。


下面結(jié)合

本發(fā)明的實(shí)施例。本發(fā)明保護(hù)范圍不以實(shí)施例為限。圖1是該納米顆粒(左)及其在加入淀粉酶后出現(xiàn)渾濁瞬間(右)的照片。
圖2是納米顆粒(實(shí)線)在加入淀粉酶后出現(xiàn)渾濁(虛線)時的粒徑分布。圖3是渾濁出現(xiàn)時間與淀粉酶活性倒數(shù)的線性關(guān)系曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明采用的α -淀粉酶(EC. 3. 2. ll，25U/mg)購于 Sigma 公司(St. Louis, MO, USA)，淀粉和其它試劑購于中國上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，去離子水由Millipore 公司Milli-Q集成純水系統(tǒng)制造。通過調(diào)節(jié)0. 2mol/L Na2HPO4和0. 2mol/L NaH2PO4的比例來配制0. 2mol/L pH 5. 5 8. 0磷酸鹽緩沖溶液。實(shí)施例1淀粉穩(wěn)定的CdTe納米顆粒的制備本實(shí)施例合成淀粉穩(wěn)定的CdTe納米顆粒。25°C下，稱量25 IOOmg淀粉，加入 50mL去離子水中，其中淀粉的重量可以是25 IOOmg中的任一數(shù)值。煮沸并保持15min，淀粉完全溶解，得到無色透明溶液。冷卻至25°C后倒入50mL三頸燒瓶，攪拌下加入0. 2mmol 的CdCl2水溶液。通入氮?dú)?，保持氣體流量為60mL/min。15min后，加入0. 2mL lmol/L NaOH 溶液，此時混合液PH 8. 0。繼續(xù)反應(yīng)15min，以lmL/min速度緩慢加入ImL 0. lmol/L NaHTe溶液。溶液顏色立刻由無色變?yōu)榧t棕色。升溫至85°C繼續(xù)反應(yīng)lh，得深棕色透明溶液。該溶液用12000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心，得棕色沉積物。向沉積物中按沉積物水的重量比為1 600加入去離子水，利用超聲波G0W，40KHz)作用;3min，分散到去離子水中備用。 此產(chǎn)品濃度為1. 6mg/mL。實(shí)施例2 —種淀粉穩(wěn)定的CdTe納米顆粒的制備本實(shí)施例合成一種淀粉穩(wěn)定的CdTe納米顆粒。25°C下，稱量50mg淀粉，加入50mL 去離子水中。煮沸并保持15min，淀粉完全溶解，得到無色透明溶液。冷卻至25°C后倒入 50mL三頸燒瓶，攪拌下加入0. 2mmol的CdCl2水溶液。通入氮?dú)?，保持氣體流量為60mL/ min。15min后，加入0. 2mL lmol/L NaOH溶液，此時混合液pH 8. 0。繼續(xù)反應(yīng)15min，以 lmL/min速度緩慢加入ImL 0. Imol/LNaHTe溶液。溶液顏色立刻由無色變?yōu)榧t棕色。升溫至85°C繼續(xù)反應(yīng)lh，得深棕色透明溶液。該溶液用12000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心，得棕色沉積物。向沉積物中按沉積物水的重量比為1 600加入去離子水，利用超聲波G0W，40KHz) 作用3min，分散到去離子水中備用。此產(chǎn)品濃度為1. 6mg/mL。實(shí)施例3淀粉穩(wěn)定的Cdk納米顆粒的制備本實(shí)施例合成淀粉穩(wěn)定的CcKe納米顆粒。25°C下，將25 IOOmg淀粉在50mL沸水中溶脹。其中，稱量的淀粉的重量可以是25 IOOmg中的任一數(shù)值。冷卻至25°C后倒入50mL三頸燒瓶，攪拌下加入0. 2mmol的CdCl2水溶液。通入氮?dú)?，保持氣體流量為60mL/ min。15min后，加入0. 2mL lmol/L NaOH溶液，此時混合液pH 8. 0。繼續(xù)反應(yīng)15min，以 lmL/min速度緩慢加入ImL 0. lmol/LNaHk溶液。溶液顏色立刻由無色變?yōu)榧t棕色。升溫至85°C繼續(xù)反應(yīng)lh，得紅棕色透明溶液。該產(chǎn)品用12000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心，得紅棕色沉積物。向沉積物中按沉積物水的重量比為1 600加入去離子水，利用超聲波(40W，40KHz) 作用3min，分散到去離子水中備用。此產(chǎn)品濃度為1.6mg/mL。實(shí)施例4淀粉酶制劑引發(fā)淀粉穩(wěn)定的CdTe納米顆粒的聚集本實(shí)施例中，將25yL 0. 2mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH范圍為5. 5 8. 0)、35yL 去離子水和2 μ L 一定活性的標(biāo)準(zhǔn)淀粉酶制劑在塑料離心管(500 μ L規(guī)格)中混合，快速注入38 μ L 1. 6mg/mL實(shí)施例2制備的淀粉穩(wěn)定的CdTe納米顆粒，迅速倒轉(zhuǎn)混勻，同時開啟秒表，測量該棕色澄清溶液中出現(xiàn)渾濁所需時間(圖1)。混合后總體積為0. lmL，最終濃度為磷酸鹽緩沖溶液50mmol/L，淀粉穩(wěn)定的CdTe納米顆粒0. 6mg/mL。酶制劑引發(fā)該澄清溶液出現(xiàn)渾濁的原因在于淀粉酶水解包裹納米顆粒的淀粉后，顆粒穩(wěn)定下降，迅速發(fā)生聚集。亞微米粒徑分析表明，作用后顆粒平均尺寸是原有尺寸的9倍，因此迅速發(fā)生渾濁(圖2)。實(shí)施例5顆粒出現(xiàn)時間與淀粉酶活力之間標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系曲線的繪制本實(shí)施例包括6例實(shí)驗(yàn)。將25 μ L 0. ^iiol/L磷酸鹽緩沖溶液(ρΗ 6. 8),35 μ L 去離子水和2yL活性已知的淀粉酶樣品(不同稀釋倍數(shù))混合，使溶液中最終酶活性分別為 0. 38,0. 76,0. 95、1. 9,3. 8 和 7. 6U/mL?？焖僮⑷?38 μ Li. 6mg/mL 淀粉穩(wěn)定的 CdTe 納米顆粒，迅速倒轉(zhuǎn)混勻，同時開啟秒表，記錄每例實(shí)驗(yàn)下該棕色澄清溶液中出現(xiàn)渾濁所需時間。根據(jù)該時間與反應(yīng)溶液中的淀粉酶活性的倒數(shù)，可繪制標(biāo)準(zhǔn)的線性關(guān)系曲線(圖3) t (s) = 25. 23+166. 95/ [Activity (U/mL)]，該擬合方程式的線性相關(guān)系數(shù)0. 993，線性范圍在 0. 38 7. 6U/mL。實(shí)施例6唾液中未知的淀粉酶活性的檢測在500yL塑料離心管中，將25yL 0. 2mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 6. 8),35 μ L 去離子水和2 μ L未知淀粉酶活性的唾液樣品混合，快速注入38 μ L 1. 6mg/mL淀粉穩(wěn)定的 CdTe納米顆粒，迅速倒轉(zhuǎn)混勻，同時開啟秒表，測量得該棕色澄清溶液中出現(xiàn)渾濁所需時間為50.0秒。將該時間代入實(shí)施例5的標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系中計(jì)算得反應(yīng)溶液中的淀粉酶活性為6. 74U/ mL。而原唾液中的淀粉酶活性為該值的50倍，即337. OU/mL。
權(quán)利要求
1.一種基于Cd-VIA族納米顆粒檢測淀粉酶活性的方法，其特征在于包括如下步驟 第一步，取濃度為0. 5 2. Omg/mL、溫度為25°C的淀粉溶液，向50mL淀粉溶液中加入0. 04 0. 2mmol Cd鹽和0.02 0. Immol VIA族元素的鈉鹽，隨后在60 90°C下加熱1 3小時，合成淀粉穩(wěn)定的Cd-VIA族納米顆粒；第二步，以12000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心第一步所得樣品，棄去上清液，向沉積物中按沉積物水的重量比為1 600加入去離子水，超聲波重新分散獲得棕紅色膠體溶液產(chǎn)品；第三步，將2 μ L不同活性的商品化標(biāo)準(zhǔn)淀粉酶樣品、25 μ L 0. 2mol/L pH5. 5 8. 0磷酸緩沖液和35 μ L去離子水加入0. 5mL規(guī)格的透明塑料離心管中，得預(yù)備混合溶液，向該預(yù)備溶液加入38 μ L第二步所得產(chǎn)品后立即開始計(jì)時，觀察并記錄與不同活性的商品化標(biāo)準(zhǔn)淀粉酶樣品一一對應(yīng)的混合液中開始出現(xiàn)渾濁時所需消耗的時間。以酶活性的倒數(shù)為橫坐標(biāo)、消耗時間為縱坐標(biāo)，根據(jù)上述數(shù)據(jù)作圖，并采用線性擬合獲得校準(zhǔn)關(guān)系式t = 25. 23+166. 95/Activity,t為所需消耗的時間，單位秒；Activity為酶活性，單位活性單位/mL ； 第四步，將2 μ L活性未知的淀粉酶樣品、25 μ L 0. 2mol/L pH5. 5 8. 0磷酸緩沖液和 35 μ L去離子水混合加入0. 5mL規(guī)格的透明塑料離心管中，得預(yù)備混合溶液，向該預(yù)備溶液加入38 μ L第二步所得產(chǎn)品后立即開始計(jì)時，觀察并記錄混合液中出現(xiàn)渾濁時所需消耗的時間，將此時間代入第三步所得校準(zhǔn)關(guān)系式，計(jì)算出未知的酶活性。
2.如權(quán)利要求1所述的基于Cd-VIA族納米顆粒檢測淀粉酶活性的方法，其特征在于所述的VIA族元素包括k或Te。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，提供了一種將Cd-VIA族納米顆粒應(yīng)用于淀粉酶活性的檢測方法。第一步，合成淀粉穩(wěn)定的Cd-VIA族納米顆粒；第二步，離心納米顆粒，向沉積物中加入去離子水，超聲波分散獲得產(chǎn)品；第三步，將已知不同活性的淀粉酶樣品、磷酸緩沖液和去離子水混合，向其中加入第二步產(chǎn)品后立即開始計(jì)時，記錄混合液中出現(xiàn)渾濁時一一對應(yīng)的時間。以酶活性倒數(shù)為橫坐標(biāo)、該時間為縱坐標(biāo)作圖，采用線性擬合獲得校準(zhǔn)關(guān)系式；第四步，對活性未知的淀粉酶樣品按第三步操作，記錄出現(xiàn)渾濁時所需時間。將此時間代入第三步校準(zhǔn)關(guān)系式，計(jì)算出未知的酶活。上述淀粉酶樣品包括標(biāo)準(zhǔn)酶試劑、唾液樣品。該酶活檢測方法簡單實(shí)用，具有快速、成本低廉等特點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/40GK102337326SQ20111016345
公開日2012年2月1日 申請日期2011年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月17日
發(fā)明者姜暉, 王雪梅 申請人:東南大學(xué)