專利名稱:OsMIOX蛋白及其編碼基因與抗旱應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種OsMIOX蛋白及其編碼基因與抗旱應(yīng)用。
背景技術(shù):
隨著全球性水資源貧乏問題日趨嚴重,干旱缺水給糧食生產(chǎn)造成嚴重威脅。眾所周知,我國是世界最缺水的13個國家之一,現(xiàn)人均水資源擁有量2400立方,僅為世界人均水平的1/4,并且分布極不均勻,特別是華北地區(qū)常遭遇干旱,南方地區(qū)也有“伏旱”和“夾秋旱”等現(xiàn)象發(fā)生,嚴重影響了我國稻作生產(chǎn)。水稻是我國和世界上的主要糧食作物之一,是我國60%以上人口的主糧。據(jù)統(tǒng)計,水稻用水占農(nóng)業(yè)用水的70%左右,我國水稻栽培面積從1997年以來持續(xù)縮減,并且每年還有2千多萬畝水稻受旱,甚至還有上千萬畝水稻無法種植。因此培育抗旱水稻品種以達到高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的目的將成為解決糧食問題的重要途徑。眾所周知,利用傳統(tǒng)育種方法培育抗旱水稻品種周期長、偶然性大,所培育的品種不穩(wěn)定,進展比較緩慢;而利用基因工程技術(shù)可以直接在基因水平上改造植物的遺傳背景,定向改造植物的遺傳性狀。外源基因的轉(zhuǎn)入豐富了基因資源,彌補了常規(guī)育種方法的不足,是抗旱品種選育的有效途徑之一。到目前為止,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因抗旱植物已有數(shù)十種。這類基因按照功能可以分為兩類,第一類是功能基因1)增加植物滲透性代謝產(chǎn)物合成能力,使植物在水分脅迫下能合成更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(如脯氨酸、甜菜堿、海藻糖、甘露醇、多胺類等),以提高植物的滲透調(diào)節(jié)能力,從而增強植物的抗旱性;2)增強植物對活性氧自由基的清除能力,使植物在水分脅迫下增強一些關(guān)鍵酶的活性(如SOD,POD,CAT等),可以有效地排除有害的活性氧自由基,從而提聞細胞耐脫水的能力;3) LEA等抗旱相關(guān)蛋白基因;另一類是調(diào)節(jié)基因,如DREB類轉(zhuǎn)錄因子,MYB類轉(zhuǎn)錄因子,NAC基因家族等,這類基因可以在逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用,迅速傳遞信息讓植物在逆境中作出反應(yīng)來抵抗惡劣環(huán)境。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將不同功能基因轉(zhuǎn)入水稻,獲得抗旱性轉(zhuǎn)基因植株,已取得了一定的研究進展。P5CS基因編碼脯氨酸合成酶,是合成脯氨酸的關(guān)鍵基因。在水稻中脅迫誘導(dǎo)和組成型超表達P5CS基因,高鹽和水分脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量比對照明顯提高,根和芽生長速率提高,表現(xiàn)出抗旱性;Zhu等(1997)利用ABA或逆境誘導(dǎo)的特異啟動子超表達P5CS基因,在逆境脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量比對照提高I. 5倍,根和莖的鮮重增加,生物產(chǎn)量也增加。ADC基因編碼燕麥精氨酸脫羧酶,是多胺合成的關(guān)鍵基因。水稻中組成型表達ADC基因,在干旱條件下,轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量明顯高于對照,抗旱性明顯提高。Xiao等(2007)將0sLEA3-l基因轉(zhuǎn)入水稻,與對照相比轉(zhuǎn)基因水稻不但提高了抗旱性,而且也提高了田間產(chǎn)量。Hu等(2006)同源克隆了 SNACl基因并將其轉(zhuǎn)入水稻,苗期進行干旱、高鹽處理,表現(xiàn)出相對較高的抗旱、耐鹽性,開花期在田間進行重度干旱處理,轉(zhuǎn)基因后代結(jié)實率比對照提高了 22-34% Jeong等(2010)將水稻NAC家族中的另一個轉(zhuǎn)錄因子OsNACIO轉(zhuǎn)入水稻,在水稻中組成型和根特異超表達該基因,苗期均表現(xiàn)抗旱性,在田間干旱條件下,根特異超表達的轉(zhuǎn)基因后代單株產(chǎn)量比對照提高了 25-42%。到目前為止,雖然只有三個水稻轉(zhuǎn)基因材料在田間表現(xiàn)出抗旱性且產(chǎn)量提高,但其它抗旱轉(zhuǎn)基因材料的獲得豐富了抗旱育種資源,為抗旱育種工作帶來希望。因此,為了使抗旱育種工作取得突破性進展,需要不斷發(fā)現(xiàn)新抗旱基因并獲得新的抗旱轉(zhuǎn)基因材料,從而最終解決干旱引發(fā)的糧食危機。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種OsMIOX蛋白及其編碼基因。本發(fā)明提供蛋白,名稱為OsMIOX,是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì);
(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。序列表中的序列2由308個氨基酸殘基組成。編碼所述蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述基因是如下⑴或⑵或(3)的DNA分子(I)序列表中序列I所示的DNA分子;(2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子;(3)與(I)限定的DNA分子序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。所述嚴格條件為在6XSSC,0. 5% SDS的溶液中,在65°C下雜交,然后用2XSSC,
O.I % SDS 和 I X SSC, O. I % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列I由1288個核苷酸組成。含有所述基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組載體是將所述基因插入PMDC32載體Asc I和Pac I識別位點間得到的
重組載體。擴增所述基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍;所述引物對中的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列3,所述弓I物對中的另一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列4。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的方法,是將所述基因?qū)肽康闹参镏校玫侥湍嫘愿哂谒瞿康闹参锏霓D(zhuǎn)基因植物。所述基因通過所述重組載體導(dǎo)入所述目的植物中。所述耐逆性為耐旱性。
所述耐旱性通過增強CAT活性、增強POD酶活性和/或提高脯氨酸含量體現(xiàn)。所述目的植物為雙子葉或單子葉植物;所述單子葉植物具體為水稻。本發(fā)明的實驗證明,本發(fā)明通過超表達OsMIOX基因,獲得了耐旱轉(zhuǎn)基因水稻,其CAT活性、POD酶活性和脯氨酸含量均高于未轉(zhuǎn)入OsMIOX基因的野生型水稻,為抗旱品種的選育提供了一個新材料,豐富了抗旱育種資源,加速了育種速度,具有操作簡單,周期短的優(yōu)點。本研究獲得的抗旱轉(zhuǎn)基因水稻為抗旱育種工作提供了一個新資源。
圖I為轉(zhuǎn)基因水稻的PCR鑒定圖2為轉(zhuǎn)基因水稻的RT-PCR鑒定圖3為甘露醇處理及復(fù)水后轉(zhuǎn)基因后代表型變化圖4為處理前后轉(zhuǎn)基因后代CAT和POD酶活性變化圖5為處理前后轉(zhuǎn)基因后代脯氨酸含量變化
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、基因的獲得OsMIOX利用軟件primer 5. 0,依據(jù)OsMIOX cDNA序列設(shè)計引物MIOXF和MI0XR,以旱稻材料 IRAT109 (Comparison of gene expression between upland and lowland ricecultivars under water stress using cDNA microarray ;HaiRuanR ffanR, HonRl ianRZhang, FenRhua Gao, Junxia Li and Zichao Li (Theoretical and Applied Genetics ;115(8) :1109-1126, 2007,公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。)cDNA為模板進行PCR擴增。超表達引物MI0XF5’ A GGCGCGCC GATGACCATCACCATTG 3’ (Asc I,序列 3)MIOXR 5,G TTAATTAA TCACCATCTCAACTTGG 3,(Pac I,序列 4)PCR體系如下
權(quán)利要求
1.一種蛋白,是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì); (b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求I所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因,其特征在于所述基因是如下⑴或(2)或(3)的DNA分子 (1)序列表中序列I所不的DNA分子; (2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子; (3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體,其特征在于所述重組載體是將權(quán)利要求2或3所述基因插入PMDC32載體的多克隆位點得到的重組載體。
6.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法,是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)肽康闹参镏?,得到耐逆性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
7.如權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于權(quán)利要求2或3所述基因通過權(quán)利要求5所述重組載體導(dǎo)入所述目的植物中。
8.如權(quán)利要求6或7所述的方法,其特征在于所述耐逆性為耐旱性。
9.如權(quán)利要求6-8中任一所述的方法,其特征在于所述耐旱性通過增強CAT活性、增強POD酶活性和/或提高脯氨酸含量體現(xiàn)。
10.如權(quán)利要求6-9中任一所述的方法,其特征在于 所述目的植物為雙子葉或單子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種OsMIOX蛋白及其編碼基因與抗旱應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種蛋白,名稱為OsMIOX,是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì);(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實驗證明,本發(fā)明通過超表達OsMIOX基因,獲得了耐旱轉(zhuǎn)基因水稻,其CAT活性、POD酶活性和脯氨酸含量均高于未轉(zhuǎn)入OsMIOX基因的野生型水稻,為抗旱品種的選育提供了一個新材料。
文檔編號C12N15/63GK102827262SQ20111016349
公開日2012年12月19日 申請日期2011年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月17日
發(fā)明者李自超, 段俊枝, 李金杰, 張洪亮 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)