專利名稱：基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶及其制備方法和該彈性蛋白酶的醫(yī)藥用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體是一種基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶及其制備方法和該彈性蛋白酶的醫(yī)藥用途。
背景技術：
彈性蛋白酶(elastase)是炎癥過程中由分葉核中性粒細胞(neutrophil granulocyte)分泌的一種蛋白酶，檢測彈性蛋白酶的含量能幫助診斷前列腺及其他附性腺器官細菌性感染的狀況。彈性蛋白酶作為絲氨酸蛋白家族的一個亞科，可以作用于彈性蛋白。人體內目前有6個基因可表達結構和功能相似的彈性蛋白酶。中性粒細胞分泌的彈性蛋白酶具有降解外源蛋白的功能，已有研究表明彈性蛋白酶可降解大腸桿菌的外膜蛋白A (ompA)，外膜蛋白A —般認為是沙門氏菌等細菌的毒力因子，所以，彈性蛋白酶的水解功能在抗外部感染途徑中發(fā)揮一定的作用。彈性蛋白酶共有267個氨基酸，如圖1所示，對彈性蛋白酶的功能域進行分析，發(fā)現(xiàn)第7-22個氨基酸表達一段具有透膜功能的蛋白，第29-242個氨基酸表達具有絲氨酸蛋白酶活性的功能蛋白，如圖1所示。人中性粒細胞彈性蛋白酶(human neutrophil elastase, HNE)在機體各種炎癥反應、組織損傷重構(如肺炎)、成人呼吸窘迫綜合征、肺纖維化、急(慢)性肺損傷、肺水腫、 動脈粥樣硬化、硬皮病等病理過程中起重要作用，并且具有阻止病毒、細菌的侵入及癌細胞轉移的功能。彈性蛋白酶作為前列腺炎鑒別診斷的指標依照美國國立衛(wèi)生研究所標準，前列腺液白細胞計數(shù)被認為是診斷前列腺炎的主要指標，檢測彈性蛋白酶可能對區(qū)別前列腺炎引起的炎癥性骨盆疼痛癥和由泌尿生殖器植物神經紊亂引起的非炎癥性骨盆疼痛有幫助。以人中性粒細胞彈性蛋白酶為抗原，制備相應的抗體，用于診斷前列腺及其他附性腺器官細菌性感染，檢測彈性蛋白酶的含量。但是，從人體獲得中性粒細胞彈性蛋白酶的來源受限，遠不能滿足臨床和試驗檢測的需要。

發(fā)明內容
本發(fā)明就是為了解決以人中性粒細胞彈性蛋白酶為抗原制備特異性抗體來源受限的問題，提供一種基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶及其制備方法和該彈性蛋白酶的醫(yī)藥用途。本發(fā)明是按照以下技術方案設計的。一種基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶，用BamHI和HindIII酶切構建彈性蛋白酶的表達質粒PET-28a-ELA2，如圖2所示；該彈性蛋白酶的核酸序列如SEQUENCE LISTING 所示。
所述基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶，該彈性蛋白酶具有天然人中性粒細胞彈性蛋白酶的免疫原性。所述基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶的制備方法，其人中性粒細胞的裂解液， 取含有基因組DNA的上清液，用PCR方法擴增，獲得中性粒細胞彈性蛋白酶的基因片段 ELA2，構建克隆質粒后轉化大腸桿菌T0P10的感受態(tài)細胞，提取質粒DNA，構建彈性蛋白酶的PET-28a-ELA2表達質粒，并在大腸桿菌中的表達彈性蛋白酶，收集菌體，超聲裂解菌液， 鎳柱洗脫純化后獲得彈性蛋白酶。所述重組人中性粒細胞彈性蛋白酶的制備方法，其PCR方法擴增引物 Primerl 5’ _ agctgcgcgg aggccacttc_3’
Primer2 5’ -gga gccgt cacca 已ggctca_3’0所述基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶的制備方法，其PCR擴增的條件為94°C 變性50秒，55°C退火1分鐘，72度延伸3分鐘，共循環(huán)30次，最后72度保溫10分鐘。所述基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶的制備方法，其重組質粒PET-28a_ELA2 在大腸桿菌中表達，將含有重組質粒PET-28a-ELA2的大腸桿菌接種在含卡那霉素的IOml LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜；將所得菌液接種到含卡那霉素的1000ml LB培養(yǎng)基中，在37°C 培養(yǎng)約4h，使其A65tl OD值到0. 6-0. 8時，向菌液中加入異丙基硫化半乳糖苷，使其終濃度為 0. 5mM，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時；收集菌體后制備超聲裂解菌液。所述基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶的制備方法，其純化彈性蛋白酶是將是將超聲裂解菌液在12，000轉/分，41離心IOmin后，將沉淀懸浮于由8M尿素、IOmM Tris, ρΗ8· 0制備的基礎緩沖液30ml中；12, 000轉/分，4°C離心lOmin，取上清液，使用300mM的 NaCl的洗脫濃度獲得純化的基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶。所述基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶作為特異性抗體的抗原，在制備高效抗體臨床診斷試劑中的應用。這樣設計的本發(fā)明，利用彈性蛋白酶的表達基因，獲得足量穩(wěn)定的基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶，為臨床檢測和試驗研究彈性蛋白酶提供原料，為制備高效抗體提供特異性抗原。


圖1是彈性蛋白酶類胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶功能域(Tryp_SPc)圖； 圖2是PET-28a-ELA2質粒圖3是表達的彈性蛋白酶SDS-PAGE電泳圖； 圖4是純化的彈性蛋白酶SDS-PAGE電泳圖5是純化的彈性蛋白酶具有天然人中性粒細胞彈性蛋白酶免疫原性的 western-blot 圖。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發(fā)明進行詳細的說明。一.人中性粒細胞彈性蛋白酶的基因獲得
1.使用人中性粒細胞的裂解液1ml，離心，12，000轉/分，5分鐘，取含有基因組DNA的上清液為模板，進行PCR擴增。使用一對引物是
Primerl 5’ _ agctgcgcgg aggccacttc_3’ Primer2 5’ -gga gccgt cacca aggctca-S' 2.以基因組DNA為模板，PCR擴增的條件為 94°C變性50秒 55°C退火1分鐘 72度延伸3分鐘，
共循環(huán)30次，最后72度保溫10分鐘。3. PCR產物經1%瓊脂糖電泳確證得到目標基因后，用酚氯仿抽提回收。二.構建人中性粒細胞彈性蛋白酶基因的克隆質粒
1.將PCR產物用膠回收純化；
2.將A-T克隆載體(如pUCm-T載體等)和PCR產物連接，連接反應體系如下
權利要求
1.一種基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶，其特征在于用BamHI和HindIII酶切質粒DNA構建彈性蛋白酶的表達質粒PET-28a-ELA2，如圖2所示；該彈性蛋白酶的核酸序列如圖6所示。
2.根據(jù)權利要求1所述基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶，其特征在于該彈性蛋白酶具有天然人中性粒細胞彈性蛋白酶的免疫原性。
3.如權利要求1所述基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶的制備方法，其特征在于人中性粒細胞的裂解液，取含有基因組DNA的上清液，用PCR方法擴增，獲得中性粒細胞彈性蛋白酶的基因片段ELA2，構建克隆質粒后轉化大腸桿菌T0P10的感受態(tài)細胞，提取質粒 DNA，構建彈性蛋白酶的PET-28a-ELA2表達質粒，并在大腸桿菌中的表達彈性蛋白酶，收集菌體，超聲裂解菌液，鎳柱洗脫純化后獲得彈性蛋白酶。
4.根據(jù)權利要求3所述基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶的制備方法，其特征在于 PCR方法擴增引物Primerl 5’ _ agctgcgcgg aggccacttc_3’Primer2 5’ -gga gccgt cacca 已ggctca_3’0
5.根據(jù)權利要求3所述基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶的制備方法，其特征在于 PCR擴增的條件為94°C變性50秒，55°C退火1分鐘，72度延伸3分鐘，共循環(huán)30次，最后 72度保溫10分鐘。
6.根據(jù)權利要求3所述基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶的制備方法，其特征在于 重組質粒PET-28a-ELA2在大腸桿菌中表達，是含有重組質粒PET-28a_ELA2的大腸桿菌接種在含卡那霉素的IOml LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜；將所得菌液接種到含卡那霉素的 1000ml LB培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)約4h，使其A650 OD值到0. 6-0. 8時，向菌液中加入異丙基硫化半乳糖苷，使其終濃度為0. 5mM,繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時；收集菌體后制備超聲裂解菌液。
7.根據(jù)權利要求3所述基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶的制備方法，其特征在于 純化彈性蛋白酶是將超聲裂解菌液在12，000轉/分，4°C離心IOmin后，將沉淀懸浮于由8M 尿素、IOmM Tris，pH8. 0制備的基礎緩沖液30ml中；12，000轉/分，4°C離心lOmin，取上清液，使用300mM的NaCl的洗脫濃度獲得純化的基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶。
8.根據(jù)權利要求1所述基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶在制備彈性蛋白酶特異性抗體臨床診斷試劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶及其制備方法和該彈性蛋白酶的醫(yī)藥用途，屬于基因工程領域。本發(fā)明利用人中性粒細胞裂解液，取含有基因組DNA的上清液，擴增獲得中性粒細胞彈性蛋白酶的基因片段ELA2，連接克隆質粒轉化大腸桿菌，構建彈性蛋白酶的PET-28a-ELA2表達質粒，在大腸桿菌中表達彈性蛋白酶，收集菌體，超聲裂解菌液，鎳柱洗脫后獲得純化的彈性蛋白酶。這樣設計的本發(fā)明，利用彈性蛋白酶的表達基因，獲得足量穩(wěn)定的基因重組人中性粒細胞彈性蛋白酶，為臨床檢測和試驗研究提供彈性蛋白酶原料，并為制備彈性蛋白酶高效抗體提供特異性抗原。
文檔編號C12N15/70GK102250863SQ201110163759
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月17日 優(yōu)先權日2011年4月29日
發(fā)明者張楷, 閻智慧 申請人:天津金斯坦生物科技有限公司