專(zhuān)利名稱(chēng)：一種豬細(xì)小病毒lamp快速檢測(cè)引物、檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)快速檢測(cè)豬細(xì)小病毒的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域中疫病診斷技術(shù)。
背景技術(shù)：
豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus，PPV)可引起豬的繁殖障礙，廣泛存在于世界各地的豬群中，在臨床上以受感染母豬產(chǎn)出死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔豬為特征，給世界各主要養(yǎng)豬地區(qū)的規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，也是成為當(dāng)前危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一。隨著高度集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，PPV的防治備受關(guān)注。豬的許多疾病可以引起相似臨床癥狀，根據(jù)臨床癥狀很難做出初步診斷，病理學(xué)變化也只能作出初步診斷。因此，臨·床快速診斷具有十分重要的意義。目前，國(guó)內(nèi)外已建立了豬細(xì)小病毒的分離培養(yǎng)鑒定、免疫組織化學(xué)、PCR及熒光定量PCR等病毒抗原的檢測(cè)方法；隨著豬細(xì)小病毒病疫苗的應(yīng)用，兩種病毒抗體檢測(cè)診斷學(xué)作用受到了影響。而病毒分離鑒定技術(shù)要求較高，費(fèi)時(shí)，不利于快速檢測(cè)與診斷。PCR及熒光定量PCR方法在檢測(cè)方面雖然有很多優(yōu)勢(shì)，但都需要昂貴的儀器，且操作復(fù)雜，不適于現(xiàn)場(chǎng)快速診斷，同時(shí)由于檢測(cè)成本較高，也加大了推廣應(yīng)用的難度。環(huán)介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)是由T. Notomi等發(fā)明的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)(Notomi, T. , et al. , Loop-mediated isothermal amplification of DNA. NucleicAcids Res. 2000，28，e63.)，該技術(shù)依賴(lài)4條特異設(shè)計(jì)的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可以高效、高特異地?cái)U(kuò)增靶序列。近年來(lái)，國(guó)外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，CN10157565A和CN101818212A均公開(kāi)了一種豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，公開(kāi)了相應(yīng)的設(shè)計(jì)的引物，但是在實(shí)際使用過(guò)程中，還是存在檢測(cè)試劑盒的配置不夠合理，反應(yīng)體系不夠穩(wěn)定，以及所設(shè)計(jì)引物的針對(duì)性和靈敏度不夠高等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，研制一種實(shí)用的豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)試劑盒，包括以下成分(I)反應(yīng)液 A 含有IOXLamp buffer, Bst DNA 聚合酶 8U/μ 1、2· 5 mM dNTP、20-50 μ M 內(nèi)引物
1,20-50 μ M 內(nèi)引物 2、3-6μΜ 外引物 1、3_6μΜ 外引物 2,15-25 μ M LooP 引物 1、15_25μΜLooP引物2，甜菜堿(5Μ)，滅菌超純水，其中I) IOXLamp buffer 含有 200mM Tris-HCl (pH 8· 8，25°C )、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和I %曲拉通X-IOO ；2)引物的序列為內(nèi)引物 I 為GTCCTCCTGTATTGGAGTTGCTGTTTTTCCACATCAGTGAAAACTTCG內(nèi)引物 2 為CGAGCCAACAACACCAACTTTTTTGTCCGTATTGCTGAATCTGG外引物I 為ACACCAACAGACTCTCAGA外引物2 為GGTTTCTATTTCCGACCAAGLP 引物 I 為CGTAGTTGTTGTCCGCTGG LP 引物 2 為CAACCTGCACTTAACTCCAACA(2)反應(yīng)液 B :1000XSYBR Green I。豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)試劑盒，其反應(yīng)液A每管22 μ I的組成2. 5 μ I10 X LampbufferU. O μ I Bst DNA 聚合酶(8υ/μ1)、4μ1 2. 5 mM dNTP,O. 5 μ I 20-50 μ M內(nèi)引物 1、0·5μ 1 20-50μΜ 內(nèi)引物 2、0· 5μ I 3-6 μ M 外引物 1、0· 5 μ I 3-6 μ M 外引物 2、O. 5 μ 115-25 μ M LooP 引物 1、0· 5μ I 15-25 μ M LooP 引物 2，5μ I 甜菜堿(5Μ)和 6· 5 μ I滅菌超純水。豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)豬細(xì)小病毒的檢測(cè)方法，其步驟包括(I)組織樣品中DNA的提取①樣品的采集瀕死豬、撲殺的成年豬和幼齡豬、流產(chǎn)胎兒取腎、肺、肝和腦等組織；待檢活豬，用注射器取血2 4mL，立即送往實(shí)驗(yàn)室；②樣品的處理每份樣品分別處理；③組織樣品處理取待檢病料約O. Ig置研磨器中剪碎并研磨，加入I. 5mL生理鹽水繼續(xù)研磨。取已研磨好的待檢組織液，置I. 5mL滅菌離心管中，8000g離心5min，取上清445μ L，加入 10% SDS 50 μ L，蛋白酶 K(5mg/ml) 5 μ L，混勻后，置 55°C 水浴中 Ih ；④血清樣品處理待血液凝固后，取上清放于離心管中，4°C 8000g離心5min，取上清IOOyL,置1.5mL滅菌離心管中，加入345yL消化液，10% SDS50 μ L，蛋白酶K(5mg/ml) 5 μ L，混勻后，置55°C水浴中Ih ；⑤取出已處理的待檢樣品，每管加入500 μ L酚/氯仿/異戊醇混合液(比例為24 23 1，用之前不要晃動(dòng)，不要吸到酚/氯仿/異戊醇液上層保護(hù)液)，用力顛倒10次混勻，12 OOOg 離心 IOmin ；⑥取上清450 μ L置I. 5mL滅菌離心管中，加入兩倍體積的無(wú)水乙醇、45“11^六((3厘)，混勻，-201中301^11。取出離心管，室溫融化，_4°C 12 OOOg離心15min ;⑦棄上清，沿離心管開(kāi)口方向管壁緩緩滴入lml-20°C預(yù)冷的75%乙醇溶液，輕輕旋轉(zhuǎn)洗一次后倒掉，將離心管倒扣于吸水紙上lmin，真空抽干15min ；⑧取出離心管，用30 μ L滅菌超純水溶解沉淀，作為模板備用；(2)豬細(xì)小病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在裝有22 μ I反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ I待檢DNA，于62_64°C恒溫水浴箱中放置43min ；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測(cè)在上述反應(yīng)結(jié)束后，加入I μ I反應(yīng)液B直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變?yōu)榫G色，則說(shuō)明樣品中含有豬細(xì)小病毒；如果顏色為橙色，說(shuō)明待檢樣品不含豬細(xì)小病毒(見(jiàn)附圖I)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在本發(fā)明建立了豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，本方法根據(jù)豬細(xì)小病毒的基因保守區(qū)的六個(gè)序列設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性?xún)?nèi)引物和兩個(gè)特異性外引物及兩個(gè)環(huán)引物，該保守基因序列為豬細(xì)小病毒所共有，并且該套引物不同于已公布的豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)引物，其特異性、敏感性及擴(kuò)增效率都有明顯提升；尤為重要的是本方法試劑配置更加合理，試劑盒的特異性、敏感性和穩(wěn)定性都進(jìn)行了改進(jìn)，增加了檢測(cè)工作中的可靠性，本發(fā)明試劑盒最低檢測(cè)量可達(dá)12fgPPVDNA,反應(yīng)時(shí)間縮短僅為43min。本發(fā)明采用LAMP技術(shù)，特異性強(qiáng)，比PCR檢測(cè)方法有更高的靈敏度，但不需要昂貴的PCR儀，只需普通的金屬浴或水浴箱即可，簡(jiǎn)單而快速。可用于豬細(xì)小病毒的檢測(cè)，特別適合于基層現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)豬細(xì)小病毒的方法所需周期長(zhǎng)、靈敏度較低、成本高、現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用困難等缺陷，提供的豬細(xì)小病毒的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，對(duì)豬細(xì)小病毒進(jìn)行LAMP檢測(cè)，快速、準(zhǔn)確性高、靈敏性好、現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用方便，可廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)、食品、出入境檢疫等領(lǐng)域。


圖I :豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)顯色結(jié)果圖。I反應(yīng)管中液體綠色說(shuō)明樣品為陽(yáng)性。2反應(yīng)管中液體橙色說(shuō)明樣品為陰性；圖2 :本發(fā)明試劑盒特異性檢測(cè)結(jié)果1 PPV ；2 PPV ；3 PCV2 ；4 =PRRSV ；5 =PEDV ；6 =CSFV ；7 :陰性對(duì)照。圖3 :本發(fā)明試劑盒敏感性檢測(cè)結(jié)果1 :10^1稀釋?zhuān)? :10_2稀釋?zhuān)? :10_3稀釋?zhuān)? 10_4稀釋?zhuān)? :10_5稀釋?zhuān)? :10_6稀釋?zhuān)? :10_7稀釋?zhuān)? :10_8稀釋?zhuān)? :10_9稀釋?zhuān)?0 :陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)該當(dāng)作本發(fā)明的限制。實(shí)施例I按下列配方制作豬細(xì)小病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒；I.豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)豬細(xì)小病毒的檢測(cè)方法，其步驟包括(I)組織樣品中DNA的提取①樣品的采集瀕死豬、撲殺的成年豬和幼齡豬、流產(chǎn)胎兒取腎、肺、肝和腦等組織；待檢活豬，用注射器取血2 4mL，立即送往實(shí)驗(yàn)室；②樣品的處理每份樣品分別處理；③組織樣品處理取待檢病料約O. Ig置研磨器中剪碎并研磨，加入I. 5mL生理鹽水繼續(xù)研磨。取已研磨好的待檢組織液，置I. 5mL滅菌離心管中，8000g離心5min，取上清445μ L，加入 10% SDS 50 μ L，蛋白酶 K(5mg/ml) 5 μ L，混勻后，置 55°C 水浴中 Ih ；④血清樣品處理待血液凝固后，取上清放于離心管中，4°C 8000g離心5min，取上清IOOyL,置1.5mL滅菌離心管中，加入345yL消化液，10% SDS50 μ L，蛋白酶K(5mg/ml) 5 μ L，混勻后，置55°C水浴中Ih ；⑤取出已處理的待檢樣品，每管加入500 μ L酚/氯仿/異戊醇混合液(比例為24 23 1，用之前不要晃動(dòng)，不要吸到酚/氯仿/異戊醇液上層保護(hù)液)，用力顛倒10次混勻，12 OOOg 離心 IOmin ；⑥取上清450 μ L置I. 5mL滅菌離心管中，加入兩倍體積的無(wú)水乙醇、45“11^六((3厘)，混勻，-201中301^11。取出離心管，室溫融化，_4°C 12 OOOg離心15min ;⑦棄上清，沿離心管開(kāi)口方向管壁緩緩滴入lml-20°C預(yù)冷的75%乙醇溶液，輕輕旋轉(zhuǎn)洗一次后倒掉，將離心管倒扣于吸水紙上lmin，真空抽干15min ；⑧取出離心管，用30 μ L滅菌超純水溶解沉淀，作為模板備用；
2.豬細(xì)小病毒LAMP試劑盒中LAMP反應(yīng)試劑包括以下成分(I)反應(yīng)液 A 含有IOXLamp buffer, Bst DNA 聚合酶 8U/μ 1、2· 5 mM dNTP、20-50 μ M 內(nèi)引物
1,20-50 μ M 內(nèi)引物 2、3-6μΜ 外引物 1、3_6μΜ 外引物 2,15-25 μ M LooP 引物 1、15_25μΜLooP引物2，甜菜堿(5Μ)，其中I) IOXLamp buffer 含有 2OOmM Tris-HCl(pH 8· 8，25O )、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和I %曲拉通X-100 ；2)所含引物序列為內(nèi)引物 I 為GTCCTCCTGTATTGGAGTTGCTGTTTTTCCACATCAGTGAAAACTTCG內(nèi)引物 2 為CGAGCCAACAACACCAACTTTTTTGTCCGTATTGCTGAATCTGG外引物I 為ACACCAACAGACTCTCAGA外引物2 為GGTTTCTATTTCCGACCAAGLP 引物 I 為CGTAGTTGTTGTCCGCTGGLP 引物 2 為CAACCTGCACTTAACTCCAACA(2)反應(yīng)液 B :1000XSYBR Green I。豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)試劑盒反應(yīng)液A每次反應(yīng)由22 μ I組成，其配制如下
2.5μ I IOXLamp bufferU. 0μ I Bst DNA 聚合酶(8U/μ I)、4 μ I 2. 5 mM dNTP,O. 5 μ I40μΜ內(nèi)引物1、0· 5μ I 40μΜ內(nèi)引物2、0· 5μ I 5μΜ外引物1、0· 5μ I 5μΜ夕卜弓I物2、O. 5μ I 20 μ M LooP 引物 1、0·5μ I 20 μ M LooP 引物 2，5 μ I 甜菜堿(5Μ)和 6· 5 μ I 滅菌超純水。(2)豬細(xì)小病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在裝有22 μ I反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ I待檢DNA，于62_64°C恒溫水浴箱中放置43min ；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測(cè)在上述反應(yīng)結(jié)束后，加入μ I反應(yīng)液B，直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變?yōu)榫G色，則說(shuō)明樣品中含有豬細(xì)小病毒；如果顏色為橙色，說(shuō)明樣品不含豬細(xì)小病毒。試驗(yàn)例I :本發(fā)明試劑盒在檢測(cè)PPV中的應(yīng)用效果特異性、敏感性和穩(wěn)定性。一、特異性I. I毒株細(xì)小病毒(PPV SC株)，偽狂犬(PRVLA株)，圓環(huán)病毒2型(PCV2)，豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV)，豬流行性腹瀉(PEDV)和豬瘟(SFV)由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院保存。I· 2提取待檢測(cè)組織樣品DNAI. 3檢測(cè)體系各組分配比如下
豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)試劑盒反應(yīng)液A由22 μ I組成，其配制如下2. 5μ IIOXLamp bufferU. 0μ I Bst DNA聚合酶(8U/μ I)、4 μ I 2. 5 mM dNTP、0. 5 μ 140 μ M 內(nèi)弓I物 1、0. 5μ1 40μΜ 內(nèi)引物 2、0. 5μ I 5μΜ外引物 1、0. 5μ I 5μΜ外引物 2、0. 5μ I 20 μ MLooP引物1、0· 5μ I 20 μ M LooP引物2，5μ I甜菜堿(5Μ)和6. 5 μ I滅菌超純水。I. 4豬細(xì)小病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)在裝有22 μ I反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ I待檢DNA，于62_64°C恒溫水浴箱中放置43min ；I. 5擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測(cè) 在上述反應(yīng)結(jié)束后，加入I μ I反應(yīng)液B，直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變?yōu)榫G色，則說(shuō)明樣品中含有豬細(xì)小病毒；如果顏色為橙色，說(shuō)明樣品不含豬細(xì)小病毒。I. 6試劑盒的特異性結(jié)果結(jié)果如圖2所示，用本試劑盒可特異檢測(cè)PPV，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，出現(xiàn)特異性的綠色熒光。而其它六種與PPV相關(guān)病毒的核酸及采自健康豬組織提取的DNA(陰性對(duì)照)檢測(cè)結(jié)果均為陰性，沒(méi)有出現(xiàn)特異性的綠色熒光，表明本試劑盒具有很高的特異性。二、敏感性2. I 樣品PPVDNA (原始濃度為 12ng/ μ I)2. 2樣品處理將PPVDNA (原始濃度為12ng/ μ I)做ΚΓ-ΙΟ—8的倍比稀釋。2. 3檢測(cè)體系各組分配比如下豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)試劑盒反應(yīng)液A由22 μ I組成，其配制如下2. 5μ I IOXLamp bufferU. Ομ I Bst DNA聚合酶(8U/μ I)、4 μ I 2. 5 mM dNTP、0·5μ 140μΜ內(nèi)引物1、0·5μ I 40μΜ內(nèi)引物2、0· 5μ I 5μ M外引物1、0· 5μ I 5μΜ夕卜弓丨物
2、0·5μ I 20 μ M LooP 引物 1、0·5μ I 20 μ M LooP 引物 2，5 μ I 甜菜堿(5Μ)和 6· 5 μ I 滅菌
超純水。2. 4豬細(xì)小病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)在裝有22 μ I反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ I待檢DNA，于62_64°C恒溫水浴箱中放置43min ；2. 5擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測(cè)在上述反應(yīng)結(jié)束后，加入I μ I反應(yīng)液B，直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變?yōu)榫G色，則說(shuō)明樣品中含有豬細(xì)小病毒；如果顏色為橙色，說(shuō)明樣品不含豬細(xì)小病毒。2. 6試劑盒的敏感性結(jié)果結(jié)果如圖3所示，試驗(yàn)結(jié)果表明采用本發(fā)明試劑盒最低檢測(cè)12 fg PPV DNA，表明本發(fā)明試劑盒具有很高的敏感性。三、穩(wěn)定性3. I樣品PPV陽(yáng)性樣品3. 2樣品處理同一批樣本由3位不同人員間隔3 d、7 d用本發(fā)明建立的檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)3次。3. 3檢測(cè)體系各組分配比如下豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)試劑盒反應(yīng)液A由22 μ I組成，其配制如下2. 5μ IIOXLamp bufferU. 0μ I Bst DNA聚合酶(8U/μ I)、4 μ I 2. 5 mM dNTP、0. 5 μ 140 μ M 內(nèi)弓I物 1、0·5μ1 40μΜ 內(nèi)引物 2、0· 5μ I 5μΜ 外引物 1、0· 5μ I 5μΜ 夕卜弓 I物 2、0· 5μ I 20 μ MLooP引物1、0· 5μ I 20 μ M LooP引物2，5μ I甜菜堿(5Μ)和6. 5 μ I滅菌超純水。3. 4豬細(xì)小病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)在裝有22 μ I反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ I待檢DNA，于62_64°C恒溫水浴箱中放置43min ；3. 5擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測(cè)在上述反應(yīng)結(jié)束后，加入I μ I反應(yīng)液B，直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變?yōu)榫G色，則說(shuō)明樣品中含有豬細(xì)小病毒；如果顏色為橙色，說(shuō)明樣品不含豬細(xì)小病毒。3. 6試劑盒的穩(wěn)定性結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果表明采用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)樣本的批間變異系數(shù)為4.7%，表明本發(fā)明試劑盒具有很高的穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
1.一種豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)試劑盒，包含提取DNA試劑和LAMP反應(yīng)試劑兩個(gè)組分，其特征在于所述的反應(yīng)試劑包括以下成分 (1)根據(jù)權(quán)利要求I中所描述的一種豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)試劑盒的DNA提取試劑包括濃度10%的SDS、濃度5mg/ml的蛋白酶K和濃度3M的NaAC。
(2)根據(jù)權(quán)利要求I中所描述的一種豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)試劑盒的反應(yīng)液含有IOXLamp buffer, Bst DNA 聚合酶 8U/μ 1、2· 5 mM dNTP、20-50 μ M 內(nèi)引物 I、20-50 μ M 內(nèi)引物 2、3-6μΜ外引物 1、3-6“] 外引物2、15-254]\1 LooP 引物 1、15_25μΜ LooP 引物 2，甜菜堿(5Μ)，其中 IOXLamp buffer 含有 200mM、pH 8. 8、25°C 的 Tris-HCl，IOOmM 氯化鉀、IOOmM 硫酸銨、.20mM硫酸鎂和I %曲拉通X-100 ；
2.根據(jù)權(quán)利要求I中所描述的一種豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)試劑盒的所含引物序列為 內(nèi)引物 I 為GTCCTCCTGTATTGGAGTTGCTGTTTTTCCACATCAGTGAAAACTTCG 內(nèi)引物 2 為CGAGCCAACAACACCAACTITITTGTCCGTATTGCTGAATCTGG 外引物 I 為ACACCAACAGACTCTCAGA 外引物 2 為GGTTTCTATTTCCGACCAAG LP 引物 I 為CGTAGTTGTTGTCCGCTGG LP 引物 2 為CAACCTGCACTTAACTCCAACA
3.根據(jù)權(quán)利要求I中所描述的一種豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)試劑盒反應(yīng)液B:1000 X SYBRGreen I。
4.根據(jù)權(quán)利要求I中所描述的一種豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于反應(yīng)液A每次反應(yīng)由 22μ I 組成2· 5μ I IOXLamp bufferU. 0μ I Bst 的 8U/μ I 的 DNA 聚合酶、.4μ I 2. 5 mM dNTP,O. 5 μ I 20-50 μ M 內(nèi)引物 I、0· 5 μ I 20-50 μ M 內(nèi)引物 2、0· 5 μ I 3-6 μ M外引物 1、0·5μ1 3-6μΜ 外引物 2、0. 5μ I 15-25 μ M LooP 引物 1、0· 5 μ 115-25 μ M LooP引物2，5 μ I的5Μ甜菜堿和6. 5 μ I滅菌超純水。
5.根據(jù)權(quán)利要求I中所描述的一種豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)豬細(xì)小病毒的檢測(cè)方法，其步驟包括 (I)組織樣品中DNA的提取 ①樣品的采集瀕死豬、撲殺的成年豬和幼齡豬、流產(chǎn)胎兒取腎、肺、肝和腦等組織；待檢活豬，用注射器取血2 4mL，立即送往實(shí)驗(yàn)室； ②樣品的處理每份樣品分別處理； ③組織樣品處理取待檢病料約O.Ig置研磨器中剪碎并研磨，加入I. 5mL生理鹽水繼續(xù)研磨。取已研磨好的待檢組織液，置I. 5mL滅菌離心管中，8000g離心5min，取上清.445 μ L，加入10% SDS 50μ L，5y L的5mg/ml蛋白酶K，混勻后，置55°C水浴中Ih ； ④血清樣品處理待血液凝固后，取上清放于離心管中，4°C8000g離心5min，取上清.100 μ L,置I. 5mL滅菌離心管中，加入345 μ L消化液，10% SDS50 μ L, 5 μ L的5mg/ml蛋白酶K，混勻后，置55°C水浴中Ih ； ⑤取出已處理的待檢樣品，比例為24 23 1，用之前不要晃動(dòng)，不要吸到酚/氯仿/異戊醇液上層保護(hù)液的每管加入500 μ L酚/氯仿/異戊醇混合液，用力顛倒10次混勻，12OOOg 離心 IOmin ；⑥取上清450μ L置I. 5mL滅菌離心管中，加入兩倍體積的無(wú)水乙醇、45 μ 13Μ的NaAC，混勻，_20°C中30min。取出離心管，室溫融化，-4°C 12000g離心15min ； ⑦棄上清，沿離心管開(kāi)口方向管壁緩緩滴入lml-20°C預(yù)冷的75%乙醇溶液，輕輕旋轉(zhuǎn)洗一次后倒掉，將離心管倒扣于吸水紙上lmin，真空抽干15min ； ⑧取出離心管，用30μ L滅菌超純水溶解沉淀，作為模板備用； (2)豬細(xì)小病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 在裝有22 μ I反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ I待檢DNA，于62_64°C恒溫水浴箱中放置43min ； (3)擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測(cè) 在上述反應(yīng)結(jié)束后，加入Ιμ I反應(yīng)液B :直接用肉眼觀察顏色變化，顏色變?yōu)榫G色，則說(shuō)明樣品中含有豬細(xì)小病毒；顏色為橙色，說(shuō)明樣品不含豬細(xì)小病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)快速檢測(cè)豬細(xì)小病毒的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。本發(fā)明含有10×Lamp buffer、Bst DNA聚合酶8U/μl、10mM dNTP、20-50μM內(nèi)引物1、20-50μM內(nèi)引物2、3-6μM外引物1、3-6μM外引物2、15-25μM LooP引物1、15-25μM LooP引物2和5M甜菜堿的反應(yīng)液A和反應(yīng)液B1000×SYBR Green I。通過(guò)對(duì)照組織樣品中DNA的提取、豬細(xì)小病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測(cè)，從而檢測(cè)出豬細(xì)小病毒。解決了現(xiàn)有技術(shù)時(shí)間長(zhǎng)、工作量大、交叉污染、儀器昂貴和操作復(fù)雜等缺陷。本發(fā)明具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速且成本低、操作方法更簡(jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間僅為43min，更加有利于推廣和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102808038SQ20111014272
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月30日
發(fā)明者沈志強(qiáng), 曲光剛 申請(qǐng)人:山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院