專利名稱：一種耐堿性低溫α-半乳糖苷酶AgaAJB13及基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種耐堿性低溫α -半乳糖苷酶 AgaAJB13及其基因。
背景技術(shù)：
α -半乳糖苷酶即蜜二糖酶(1，6-α -d-galactoside galactohydrolase ； α -galactosidase ；melibiase ；EC 3. 2. 1. 22)，可移除不同底物中α-連接的末端非還原性D-半乳糖，包括蜜二糖、棉子糖、水蘇糖和毛蕊花糖等低聚糖底物及半乳甘露聚糖等多聚糖底物。這些多糖廣泛存在于食品和飼料原料中，特別是豆類植物的種子中，如豆粕、棉柏和菜粕等(Karr-Lilienthal et al. Livest Prod Sci, 2005，97: 1-12·)。α-半乳糖苷酶可應(yīng)用于飼料、食品、造紙和醫(yī)療行業(yè)中。在飼料業(yè)中，α-半乳糖苷酶制劑可以促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化并消除或減少飼料組成中的抗?fàn)I養(yǎng)因子(棉子糖等低聚糖)對營養(yǎng)物質(zhì)消化的副作用，從而改善了動(dòng)物的生產(chǎn)性能，降低飼料成本；在食品業(yè)中，α-半乳糖苷酶制劑可以降低棉子糖等在豆奶中的含量，增加人類對豆類營養(yǎng)的吸收；α-半乳糖苷酶還可提高紙張的漂白效果及治療Fabry疾病等(Cao et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2009，83: 875 - 884·)。α-半乳糖苷酶廣泛存在于細(xì)菌、放線菌、真菌和植物中。根據(jù)氨基酸序列相似性， α -半乳糖苷酶被劃分到糖苷水解酶第4、27、36和57家族，絕大多數(shù)α -半乳糖苷酶屬于糖苷水解酶第27和36家族。真核生物來源的α-半乳糖苷酶多數(shù)屬于27家族，而原核生物來源α -半乳糖苷酶基本都屬于36家族(Finn et al. Nucleic Acids Res, 2008，36: D281-D288.)。但是，目前所報(bào)導(dǎo)的α -半乳糖苷酶多為中溫或高溫酶及耐酸性或耐中性 PH酶，同時(shí)具有耐堿性和低溫活性的(0 -20°C) α-半乳糖苷酶還未曾報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種耐堿性低溫α -半乳糖苷酶。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述α -半乳糖苷酶的基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發(fā)明所述α-半乳糖苷酶AgaAJB13可得自鞘氨醇單胞菌(分力切卯/^/ sp.)， tWSphingobium estrogenivorans ATCC BAA-1367 AgaAJB 13 的M基酸序歹lj如 SEQ ID NO. 1所示。該酶總共含738個(gè)氨基酸，其中N端23個(gè)氨基酸為其預(yù)測的信號(hào)肽序列 “MVMRRffGAALAAATMLAAAPAHA“ (SEQ ID N0. 2)。因此，成熟的α -半乳糖苷酶AgaAJB13的理論分子量為80. OkDa，其氨基酸序列如 SEQ ID N0. 3 所示。本發(fā)明的0-半乳糖苷酶々8仏邛13的最適？!1值為5.0，在？!14.5-6.0的范圍內(nèi)維持80%以上的酶活性；經(jīng)pH4. 0-11.0的緩沖液處理lh，酶活剩余35%以上；最適溫度為 60°C，在10°C和20°C分別具有10%和20%以上的酶活，具有低溫酶的低溫催化特性；在37°C 和60°C下的半衰期>60min，具有良好的熱穩(wěn)定性；可水解豆粕、棉粕和棉籽糖；經(jīng)胰蛋白酶和蛋白酶K處理Ih后，AgaAJB 13仍能分別保持102. 1%和114. 0%的酶活。本發(fā)明提供了編碼上述α-半乳糖苷酶的基因a^A/Z^J，該基因序列如SEQ ID NO. 4所示。DNA序列結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，α -半乳糖苷酶基因agaAJB13編碼信號(hào)肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。α -半乳糖苷酶基因agaAjm3編碼成熟肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了 α-半乳糖苷酶AgaAJB13的編碼基因 agaAJB13,其全長2217bp，起始密碼為ATG，終止密碼為TAG。經(jīng)BLAST比對，該α -半乳糖苷酶基因J編碼的氨基酸序列與GenBank中Acidobacterium sp. MP5ACTX8來源的潛在α -半乳糖苷酶(EFI56085)具有最高的一致性，為59. 2% ；與確證活性的
corymb if era IFO 8084來源α -半乳糖苷酶(AAF68953)的一致性為40. 1%。說明α-半乳糖苷酶AgaAJB13是一種新的α-半乳糖苷酶。本發(fā)明還提供了包含上述α-半乳糖苷酶基因的重組載體，優(yōu)選為 m~agaAJB130將本發(fā)明的α -半乳糖苷酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，將本發(fā)明的α-半乳糖苷酶基因插入到質(zhì)粒ρΕΤ48ει ( + )上的feoRI和歷ii/III限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒m_agaAjm30本發(fā)明還提供了包含上述α -半乳糖苷酶基因的重組菌株，優(yōu)選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組菌株見力^^歲/^^/擬義本發(fā)明的制備α -半乳糖苷酶AgaAJB13的方法按以下步驟進(jìn)行
1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組α-半乳糖苷酶表達(dá)； 3)回收并純化所表達(dá)的α-半乳糖苷酶AgaAJB13。其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞，優(yōu)選將重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞BL21 (DE3 )，得到重組菌株BL21 (DE3) ZagaAJBLS0本發(fā)明提供了一個(gè)新的α-半乳糖苷酶基因，其編碼的α-半乳糖苷酶最適 pH5. 0 ；在10°C和20°C下分別具有10%和20%以上的酶活；經(jīng)0. IM pHll. 0緩沖液37°C處理lh，仍能保持約40%的活性，作用溫度范圍較廣，良好的熱穩(wěn)定性和蛋白酶抗性；較好的水解各種自然底物的能力，可廣泛的應(yīng)用于飼料和食品等行業(yè)。


圖1 在大腸桿菌中表達(dá)的重組α -半乳糖苷酶的SDS-PAGE分析，其中，M 低分子量蛋白質(zhì)Marker ；1 純化的重組α -半乳糖苷酶。圖2 重組α -半乳糖苷酶的最適ρΗ。圖3 重組α -半乳糖苷酶的ρΗ穩(wěn)定性。圖4 重組α -半乳糖苷酶的最適溫度。
圖5 重組α -半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式試驗(yàn)材料和試劑
1、菌株及載體鞘氨醇單胞菌(分力切卯況“ sp.)同文獻(xiàn)報(bào)道菌種性質(zhì)，如 Sphingobium estrogenivorans ATCC BAA—1367 ；lif Escherichia coli BL21 (DE3) 和表達(dá)載體pET18a ( + )可購于Novagen公司。2、酶類及其它生化試劑限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、連接酶和dNTP購自TaKaRa ^W] ；/7NPG (/7-nitrophenyl- α -d-galactopyranoside)J)^ g Sigma ^w] 5 ^ /^ 劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養(yǎng)基
LB 培養(yǎng)基=Peptone 10g, Yeast extract 5g, NaCl 10g，加蒸餾水至 1000ml，pH 自然 (約為7)。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2. 0% (w/v)瓊脂。說明以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。 實(shí)施例1 α -半乳糖苷酶基因agaAJB13的克隆
提取鞘氨醇單胞菌基因組DNA:將液體培養(yǎng)2d的菌液離心取菌體，加入ImL溶菌酶，37°C處理60min，再加入裂解液，70°C水浴裂解60min，每隔IOmin混勻一次，在4°C下 IOOOOrpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇， 于室溫靜置5min后，4°C下IOOOOrpm離心lOmin。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量TE溶解，置于_20°C備用。 根據(jù)糖苷水解酶第36家族的保守序列([F/L/V]-[L/V]_[L/M/V]-D-D-G-W-F和 E-P-E-M-[V/I]-[N/S]_[P/E])設(shè)計(jì)合成了簡并引物 GH36F 和 GH36R (表 1)。
權(quán)利要求
1.一種耐堿性低溫α-半乳糖苷酶AgaAJB13，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.如權(quán)利要求1所述的耐堿性低溫α-半乳糖苷酶AgaAJB13，其特征在于所述α-半乳糖苷酶AgaAJB13的信號(hào)肽序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.如權(quán)利要求1所述的耐堿性低溫α-半乳糖苷酶AgaAJB13，其特征在于所述α-半乳糖苷酶AgaAJB13的成熟肽序列如SEQ ID NO. 3所示。
4.一種編碼權(quán)利要求1所述的耐堿性低溫α -半乳糖苷酶AgaAJB13的α -半乳糖苷酶基因a^aA/^J，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
5.如權(quán)利要求4所述的α-半乳糖苷酶基因eigeiAJB13，其特征在于所述α -半乳糖苷酶基因編碼信號(hào)肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
6.如權(quán)利要求4所述的α-半乳糖苷酶基因eigeiAJB13，其特征在于所述α -半乳糖苷酶基因編碼成熟肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
7.一種包含權(quán)利要求4所述α-半乳糖苷酶基因a^aA^A 的重組載體。
8.一種包含權(quán)利要求4所述α-半乳糖苷酶基因的重組菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種耐堿性低溫α-半乳糖苷酶AgaAJB13及其基因。本發(fā)明提供了一種來源于鞘氨醇單胞菌(Sphingobiumsp.)的α-半乳糖苷酶AgaAJB13，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示，且提供了編碼上述α-半乳糖苷酶的編碼基因agaAJB13，及包含α-半乳糖苷酶基因agaAJB13的重組載體和包含α-半乳糖苷酶基因agaAJB13的重組菌株。α-半乳糖苷酶具有以下性質(zhì)最適pH5.0；最適溫度60℃，在10℃和20℃下分別具有10%和20%以上的酶活；經(jīng)0.1MpH11.0緩沖液在37℃下處理1h，仍能保持~40%的活性；良好的熱穩(wěn)定性和蛋白酶抗性；較好的水解各種自然底物的能力；可作為一種飼料或食品添加劑應(yīng)用于飼料與食品行業(yè)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102220301SQ201110142558
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月30日
發(fā)明者周峻沛, 唐湘華, 李俊俊, 潘璐, 董巖巖, 許波, 高雅潔, 黃遵錫 申請人:云南師范大學(xué)