專利名稱：酶的混合物、高通量酶篩選板及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種酶的混合物、高通量酶篩選板及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
化學(xué)工業(yè)的發(fā)展為人類帶來(lái)了巨大的變革與利益，但同時(shí)也為人類的健康、社區(qū)安全以及生態(tài)環(huán)境帶來(lái)了危害。隨著全球性環(huán)境污染問(wèn)題的日益加劇和能源、資源急劇減少，公眾環(huán)境意識(shí)逐步提高，綠色化學(xué)逐漸成為21世紀(jì)的主題?；诰G色化學(xué)的準(zhǔn)則，生物轉(zhuǎn)化成為當(dāng)前國(guó)際公認(rèn)最綠色的化學(xué)轉(zhuǎn)化技術(shù)之一。 生物轉(zhuǎn)化具有一些化學(xué)方法無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)，例如專一性強(qiáng)，選擇性好，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好。將生物轉(zhuǎn)化應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，不但緩解環(huán)境問(wèn)題，成本也會(huì)降低，產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟(jì)效益。酶催化生物轉(zhuǎn)化是一種高選擇性反應(yīng)，不同種類的酶可作用于不同構(gòu)型和不同種類的特定底物，從而達(dá)到定向轉(zhuǎn)化的目的。正是由于酶的這一特點(diǎn)，針對(duì)某一底物就要進(jìn)行酶的篩選。酶的篩選是決定一個(gè)項(xiàng)目成敗的關(guān)鍵，但同時(shí)也是比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作，如能高效地進(jìn)行酶的篩選，將大大提高效率，同時(shí)也會(huì)相應(yīng)降低成本。已有研究人員對(duì)此關(guān)注，例如，Yazbeck等將酶預(yù)先放置于96孔板中做成預(yù)制板，然后保存，待使用時(shí)再自行加入緩沖液等其他輔助試劑及底物(Adv. Synth. Catal. 2003，；345(4) =524-532) ；Codeix公司也推出了酶篩選板，同時(shí)分別將緩沖液等各種輔助試劑配好，在使用時(shí)按該公司提供的比例進(jìn)行混合。這些努力雖然一定程度上改善了酶篩選的效率，但操作不簡(jiǎn)便，仍然不能高效地進(jìn)行酶篩選。酶催化反應(yīng)過(guò)程中加入緩沖液是為了給酶提供一個(gè)適宜pH值的酸堿緩沖體系， 使酶發(fā)揮最大的作用，防止過(guò)酸或過(guò)堿而影響酶的活性。在傳統(tǒng)工藝中，酶在用于催化反應(yīng)之前的儲(chǔ)存階段，為了酶的穩(wěn)定和保持活性，酶通常獨(dú)立封裝，直到催化反應(yīng)時(shí)，再配制所需緩沖液和其它輔助試劑與酶混合。然而，現(xiàn)配制緩沖液和輔助試劑給酶催化反應(yīng)的操作帶來(lái)不便，尤其是進(jìn)行高通量酶篩選時(shí)，由于近百個(gè)不同活性的酶所需的緩沖液及輔助試劑的種類及量都不同，分別給這些酶添加緩沖液及輔助試劑是一件十分繁瑣和耗時(shí)的工作，使得酶篩選效率非常低下。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種酶的混合物，該酶的混合物使酶催化反應(yīng)的操作更加便利、高效。此外，還要提供一種高通量酶篩選板，該酶篩選板可以高效、便捷地針對(duì)某一底物進(jìn)行高通量酶篩選。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種酶的混合物，包含酶和緩沖鹽。
所述酶的濃度為0. lg/Ι 50g/l，所述緩沖鹽的pH值為5. 0 9. 0，其濃度為 IOmM 500mM。所述酶包括酮還原酶、水解酶、或轉(zhuǎn)氨酶等各種用于生物轉(zhuǎn)化的酶類；所述緩沖鹽包括磷酸、Tri-HCl或其他常用緩沖鹽類。對(duì)于氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、或某些裂解酶等，在催化相應(yīng)反應(yīng)時(shí)，需要NAD(P)+、 NAD (P) H或PLP等輔酶的參與。而這些輔酶參加反應(yīng)后，如果沒有輔酶再生系統(tǒng)使之再生， 一旦輔酶完全被消耗，酶反應(yīng)就會(huì)停止，因此，還需要加入輔酶再生系統(tǒng)，如葡萄糖脫氫酶 (GDH)和D-葡萄糖、或甲酸脫氫酶(FDH)和甲酸銨等。優(yōu)選的，對(duì)于氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、或某些裂解酶等，所述酶的混合物還包含輔酶和輔酶再生系統(tǒng)。輔酶的濃度為0. Olg/Ι 2. Og/Ι，所述輔酶再生系統(tǒng)的濃度為0. 5g/l 100g/l。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種高通量酶篩選板，該篩選板為孔板，所述篩選板的孔中放置有酶的混合物，該混合物包含酶和緩沖鹽。所述酶的濃度為0. lg/Ι 50g/l，所述緩沖鹽的pH值為5. 0 9. 0，其濃度為 IOmM 500mM。優(yōu)選的，對(duì)于篩選氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、或某些裂解酶等，所述酶的混合物還包含輔酶和輔酶再生系統(tǒng)。輔酶的濃度為0. Olg/Ι 2. Og/Ι，所述輔酶再生系統(tǒng)的濃度為0. 5g/ 1 100g/l。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述高通量酶篩選板的制備方法，包括以下步驟分別配制實(shí)驗(yàn)緩沖液和各酶濃縮液；將實(shí)驗(yàn)緩沖液與各濃縮液按比例混合；將上述混合液分裝至篩選板的各孔；去除篩選板孔中混合液的水分后，低溫保存。對(duì)于需要輔酶和輔酶再生系統(tǒng)的酶篩選板，在將實(shí)驗(yàn)緩沖液與各濃縮液按比例混合之前，還包括步驟分別配制輔酶和輔酶再生系統(tǒng)的濃縮液。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述酶的混合物在制備催化反應(yīng)的酶產(chǎn)品中的應(yīng)用。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述高通量酶篩選板在制備篩選酶的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明酶的混合物，使酶催化反應(yīng)的操作更加便利、高效。本發(fā)明的高通量酶篩選板，可以高效、便捷地針對(duì)某一底物進(jìn)行高通量酶篩選，大大提高了效率，節(jié)約了成本。本發(fā)明高通量酶篩選板，具有適用性廣，穩(wěn)定性好，使用方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于科研、醫(yī)藥、精細(xì)化工等多個(gè)行業(yè)。
具體實(shí)施例方式為了使酶催化反應(yīng)的操作更加便利、高效，本發(fā)明研制出一種酶的混合物，該混合物包含酶和緩沖鹽。其中，酶的濃度為0. lg/Ι 50g/l，緩沖鹽的PH值為5. 0 9. 0，緩沖鹽的濃度為IOmM 500mM。對(duì)于氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、或某些裂解酶等，酶的混合物還包含輔酶和輔酶再生系統(tǒng)。輔酶的濃度為0. Olg/Ι 2. Og/Ι，輔酶再生系統(tǒng)的濃度為0. 5g/l 100g/l。輔酶包括NAD(P)+、NAD(P)H或PLP等，輔酶再生系統(tǒng)包括葡萄糖脫氫酶(⑶H)和 D-葡萄糖、或甲酸脫氫酶(FDH)和甲酸銨等。本發(fā)明還提供了一種高通量酶篩選板，該篩選板為孔板，孔中放置有酶的混合物， 該混合物包含酶和緩沖鹽。酶的濃度為0. lg/Ι 50g/l，緩沖鹽的pH值為5. 0 9. 0，緩沖鹽的濃度為IOmM 500mM。對(duì)于篩選氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、或某些裂解酶等，酶的混合物還包含輔酶和輔酶再生系統(tǒng)。輔酶的濃度為0. Olg/Ι 2. Og/Ι，輔酶再生系統(tǒng)的濃度為0. 5g/ 1 100g/l。本發(fā)明高通量酶篩選板的制備方法，包括以下步驟分別配制實(shí)驗(yàn)緩沖液和各酶濃縮液；將實(shí)驗(yàn)緩沖液與各濃縮液按比例混合；將上述混合液分裝至篩選板的各孔；在不損害酶活的前提下去除篩選板孔中混合液的水分后，低溫保存。對(duì)于需要輔酶和輔酶再生系統(tǒng)的酶篩選板，在將實(shí)驗(yàn)緩沖液與各濃縮液按比例混合之前，還包括步驟分別配制輔酶和輔酶再生系統(tǒng)的濃縮液。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，去除篩選板孔中混合液的水分后，還要進(jìn)行包裝、貼標(biāo)簽步驟，然后低溫保存。本發(fā)明高通量酶篩選板的使用方法如下(以反應(yīng)規(guī)模為0. 1ml，加入底物濃度為 lg/Ι為例)1.在酶篩選板各孔中加入90 μ 1去離子水，建議在使用之前加，以免篩選板中的輔酶變壞；2.制備底物母液，將10mg底物溶于Iml去離子水中，如果底物不溶于水，可將底物溶于有機(jī)溶劑中(例如，DMS0、甲醇、乙腈、異丙醇等)；3.將10 μ 1底物母液分別加入到酶篩選板各孔中開始篩選反應(yīng)；4.將酶篩選板放置于恒溫并有一定攪拌速度的培養(yǎng)箱或搖床中反應(yīng)M 72小時(shí)；5.根據(jù)已建立的分析方法終止反應(yīng)，如用于正相HPLC或氣相GC分析，加入0. Iml 乙酸乙酯或MTBE ；如用于反相HPLC分析，則加入0. Iml乙腈。震蕩后離心，將有機(jī)相或乙腈水溶液取出，分析轉(zhuǎn)化率及選擇性。 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例1酮還原酶的高通量酶篩選
權(quán)利要求
1.一種酶的混合物，其特征在于，包含酶和緩沖鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶的混合物，其特征在于，所述酶的濃度為0.lg/Ι 50g/l， 所述緩沖鹽的PH值為5. 0 9. 0，其濃度為IOmM 500mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶的混合物，其特征在于，該混合物還包含輔酶和輔酶再生系統(tǒng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶的混合物，其特征在于，所述輔酶的濃度為0.01g/l 2. Og/Ι，所述輔酶再生系統(tǒng)的濃度為0. 5g/l 100g/l。
5.一種高通量酶篩選板，該篩選板為孔板，其特征在于，所述篩選板的孔中放置有酶的混合物，該混合物包含酶和緩沖鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高通量酶篩選板，其特征在于，所述酶的濃度為0.lg/Ι 50g/l，所述緩沖鹽的pH值為5. 0 9. 0，其濃度為IOmM 500mM。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的高通量酶篩選板，其特征在于，所述酶的混合物還包含輔酶和輔酶再生系統(tǒng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的高通量酶篩選板，其特征在于，所述輔酶的濃度為0.01g/l 2. Og/Ι，所述輔酶再生系統(tǒng)的濃度為0. 5g/l 100g/l。
9.權(quán)利要求5所述的高通量酶篩選板的制備方法，其特征在于，包括以下步驟分別配制實(shí)驗(yàn)緩沖液和各酶濃縮液；將實(shí)驗(yàn)緩沖液與各濃縮液按比例混合；將上述混合液分裝至篩選板的各孔；去除篩選板孔中混合液的水分后，低溫保存。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，對(duì)于需要輔酶和輔酶再生系統(tǒng)的酶篩選板，在將實(shí)驗(yàn)緩沖液與各濃縮液按比例混合之前，還包括步驟分別配制輔酶和輔酶再生系統(tǒng)的濃縮液。
11.權(quán)利要求1所述酶的混合物在制備催化反應(yīng)的酶產(chǎn)品中的應(yīng)用。
12.權(quán)利要求5所述的高通量酶篩選板在制備篩選酶的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酶的混合物，包含酶和緩沖鹽。本發(fā)明還公開了高通量酶篩選板，該篩選板為孔板，其孔中放置有酶的混合物，該混合物包含酶和緩沖鹽。本發(fā)明還公開了酶的混合物及高通量酶篩選板的應(yīng)用。本發(fā)明酶的混合物，使酶催化反應(yīng)的操作更加便利、高效。本發(fā)明的高通量酶篩選板，可以高效、便捷地針對(duì)某一底物進(jìn)行高通量酶篩選，大大提高了效率，節(jié)約了成本。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK102154231SQ201110037919
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月15日
發(fā)明者蘇金環(huán), 邱貴森 申請(qǐng)人:尚科生物醫(yī)藥(上海)有限公司