專利名稱：一種基于抗生素標記的超嗜熱泉古菌表達載體及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種古菌表達載體及其應用，尤其涉及一種基于抗生素標記的超嗜熱泉古菌表達載體及其應用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
根據(jù)16S rDNA序列，生物界分為真細菌(Eubacteria)，真核生物(Eucarya)和古細菌(Archaebacteria)三個域。目前，古菌分為四個界泉古菌(Crenarchaeota)，廣古菌 (Euryarchaeota),初生古菌(Korarchaeota)禾口納米古菌(Nanoarchaeota)。泉古菌中又有一類超嗜熱泉古菌，它們的最適生長溫度為70-85°C，最適生長pH值為2-3。超嗜熱泉古菌自身合成的蛋白酶、脂肪酶、DNA聚合酶能耐酸、耐高溫，它們中的一些酶已成功的應用于工業(yè)生產(chǎn)。超嗜熱酶在大腸桿菌中異源表達后，其酶活和性質(zhì)有的發(fā)生改變，有的酶基因在大腸桿菌中不表達，或者異源表達后形成包涵體，因而為了更好的研究和利用超嗜熱酶， 在古菌自身體系中表達超嗜熱酶非常必要。目前存在的超嗜熱泉古菌表達體系主要利用 PyrEF基因為選擇標記基因，要求宿主必須為尿嘧啶為營養(yǎng)缺陷性菌株，另外這個體系得到的轉(zhuǎn)化子假陽性較高，且相應的選擇培養(yǎng)基價格比較昂貴。以抗生素標記作為選擇基因，可以克服上述缺陷。然而，在相關(guān)的檢索中，目前還未見有此類報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種基于抗生素標記的超嗜熱泉古菌表達載體及其應用。本發(fā)明所述的基于抗生素標記的超嗜熱泉古菌表達載體，是一種環(huán)狀穿梭載體， 其特征在于其包括一個原核復制起點、一個古菌復制起點、氨芐青霉素抗性基因、多克隆位點、阿拉伯糖啟動子和抗生素選擇標記基因SimR ；所述載體命名為pSSR ；載體的核苷酸序列為SEQ ID NO. 4所示序列。其中上述選擇標記基因SimR是一種辛伐他汀抗性基因，由Sac7d基因的啟動子和hmg基因組成；其核苷酸序列為SEQ ID NO. 3所示序列。本發(fā)明所述的基于抗生素標記的超嗜熱泉古菌表達載體的構(gòu)建方法，步驟是1)設(shè)計合成如下引物sac7d 上游5' TAATTGAGCTCCCCTCACTATAACT 3 ‘sadd 下游5' TCTCTTGCATATTAGGTCAAGTTATCT 3 ‘hmg 上游5 ‘ CTTGACCTAATATGCAAGAGATAATTG 3 ‘hmg 下游5 ‘ TATATACCCGGGATGGTTAAGTTAATT 3 ‘2)以 Sulfolobus acidocaldarius 基因組 DNA 為模板，用 sac7d 上游和 sac7d 下游引物進行PCR擴增，得到Sac7d基因的啟動子片段；3)以Sulfolobus tokodaii基因組DNA為模板，用hmg上游和hmg下游引物進行PCR擴增，得到hmg基因片段；4)利用重疊延伸PCR將sac7d基因的啟動子和hmg基因融合，得到simR基因；5)用Mel和XmaI限制性內(nèi)切酶雙酶切simR基因和pZC載體；6)用T4DNA連接酶對酶切后的simR基因和pZC載體進行連接；7)以步驟6)的含重組載體的連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，獲得基于抗生素標記的超嗜熱泉古菌表達載體，即PSSR載體。本發(fā)明所述表達載體在超嗜熱泉古菌中表達超嗜熱酶的應用。其中上述超嗜熱酶優(yōu)選是半乳糖苷酶或DNA解旋酶。上述超嗜熱泉古菌優(yōu)選冰島硫化葉菌。本發(fā)明構(gòu)建了基于抗生素一辛伐他汀(simvastatin)標記的超嗜熱泉古菌表達載體。辛伐他汀作為一種抗生素，其原理是作為3-羥基-3-甲基輔酶A (HMG-CoA)還原酶的競爭性抑制劑，辛伐他汀阻礙了 HMG-CoA生成甲羥戊酸，進而阻礙了細胞膜脂的合成，因此，只要在細胞內(nèi)過量表達HMG-CoA還原酶就能解除辛伐他汀對細胞生長的抑制。本發(fā)明的載體以抗生素抗性為選擇標記，相對于營養(yǎng)缺陷性標記的載體，該載體具有更廣泛的宿主范圍，既可以是營養(yǎng)缺陷性菌株，也可以是野生型菌株。實驗證實本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化冰島硫化葉菌的效率較高，假陽性較低，可以簡便、快速、高效的表達超嗜熱酶。表達的超嗜熱酶既可在氨基端，也可在羧基端加入組氨酸標簽，大大方便了蛋白的純化，并且經(jīng)過一步鎳柱親和層析即可得到純度較高的目的蛋白。預示本發(fā)明的表達載體在超嗜熱酶的表達方面有很大的應用前景與經(jīng)濟價值。


圖1為pSSR載體圖譜。圖2為轉(zhuǎn)化了 pSSR-lacS載體的冰島硫化葉菌X_gal顯色結(jié)果。圖3為在冰島硫化葉菌中表達的HerA蛋白SDS-PAGE結(jié)果，其中M是蛋白marker， 1是菌體破壁后的全蛋白，2是經(jīng)鎳柱親和層析后的蛋白。
具體實施例方式實施例1、辛伐他汀抗性基因simR的獲得1)獲得sac7d啟動子DNA片段設(shè)計引物sac7d上游和Sac7d下游，引物Sac7d上游中加入了 ^icI酶切位點，引物sac7d上游和sac7d下游的序列如下sac7d 上游5' TAATTGAGCTCCCCTCACTATAACT 3 ‘sac7d 下游5' TCTCTTGCATATTAGGTCAAGTTATCT 3 ‘以 Sulfolobus acidocaldarius 基因組 DNA (GenBank :CP000077)為模板，用引物 sac7d上游和sac7d下游PCR擴增sac7d啟動子DNA片段。PCR 反應體系10XPCRbuffer 5yL，上游、下游引物(ΙΟμΜ)各 lyL，模板 lyL， dNTPs (各 2. 5mM) 4 μ L，pfu 酶(2. 5U/ μ L) 1 μ L,最后補水至 50 μ L。反應條件94°C熱變性5min ；94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，共30個循環(huán)；72°C延伸IOmin。
PCR產(chǎn)物在0. 5 X TBE配制的瓊脂糖凝膠中電泳，DNA回收試劑盒(omega公司)回收目的片段，方法參考其說明書，回收產(chǎn)物_20°C保存?zhèn)溆?。得到純的sac7d啟動子DNA片段，其DNA序列是如SEQ ID NO. 1所示序列?；毛@得hmg基因片段設(shè)計引物hmg上游和hmg下游，引物hmg下游中加入了 XmaI酶切位點，引物hmg 上游和hmg下游的序列如下hmg 上游5' CTTGACCTAATATGCAAGAGATAATTG 3 ‘hmg 下游5' TATATACCCGGGATGGTTAAGTTAATT 3 ‘以 Sulfolobus tokodaii 基因組 DNA(GenBank :BA000023)為模板，用引物 hmg 上游和hmg下游PCR擴增hmg基因片段。PCR反應體系10 XPCR buffer 5 μ L，上游、下游引物(10 μ Μ)各 1 μ L，模板 1 μ L， dNTPs (各 2. 5mM) 4 μ L，pfu 酶(2. 5U/ μ L) 1 μ L,最后補水至 50 μ L。反應條件94°C熱變性5min ；94°C變性45s，56°C退火45s，72°C延伸aiiin，共30個循環(huán)；72°C延伸IOmin。PCR產(chǎn)物在0. 5 X TBE配制的瓊脂糖凝膠中電泳，DNA回收試劑盒(omega公司)回收目的片段，方法參考其說明書，回收產(chǎn)物_20°C保存?zhèn)溆谩５玫郊兊膆mg基因片段，其DNA序列是如SEQ ID N0. 2所示序列。3)辛伐他汀抗性基因SimR的獲得以得到的Sac7d啟動子DNA片段和hmg基因片段為模板進行重疊延伸PCR反應， 反應分為兩步。第一步，不加引物的預延伸。反應體系10XPCR buffer 5 μ L，sac7d啟動子DNA片段2 μ L，hmg基因片段 0. 5 μ L，dNTPs (各 2. 5mM) 4 μ L，pfu 酶(2. 5U/ μ L) 1 μ L,最后補水至 50 μ L。反應條件94°C熱變性5min ；94°C變性45sJ4°C退火45s，72°C延伸3min，共5個循環(huán)；72°C延伸IOmin。第二步，預延伸完成后，加入引物進行PCR擴增。反應體系在第一步的反應體系中加入sac7d上游引物(10 μ M) 1 μ L，hmg下游引物(10μΜ)1μ 。反應條件94°C熱變性5min ；94°C變性45s，56°C退火45s，72°C延伸:3min，共20個循環(huán)；72°C延伸IOmin。PCR產(chǎn)物在0. 5 X TBE配制的瓊脂糖凝膠中電泳，DNA回收試劑盒(omega公司)回收目的片段，方法參考其說明書，回收產(chǎn)物_20°C保存?zhèn)溆?。得到純的SimR基因片段，其DNA序列如SEQ ID N0. 3所示序列。實施例2、基于抗生素標記的超嗜熱泉古菌表達載體(pSSR)載體的構(gòu)建用Mel和XmaI限制性內(nèi)切酶雙酶切simR基因的PCR產(chǎn)物和pZC載體(Peng et al.，2009，Mol Microbiol, 74 :928-929)。雙酶切體系如下10 X buffer4 5 μ L, BSA 0. 5 μ L, simR 基因片段或 pZC 載體 20 μ L, SacI (20U, NEB 公司)1 μ L，XmaI (10U，NEB公司)lyL，補充水至50 μ L，37°C酶切過夜。
酶切產(chǎn)物在0. 5 X TBE配制的瓊脂糖凝膠中電泳，DNA回收試劑盒(omega公司)回收目的片段。回收產(chǎn)物_20°C保存?zhèn)溆?。酶切后的PCR產(chǎn)物和pZC載體進行連接反應，反應體系如下IOXligation buffer 1 μ L，T4DNA 連接酶(NEB 公司)1 μ L，酶切后的 PCR 產(chǎn)物 3 μ L，酶切后的pZC載體2 μ L，補充水至10 μ L，16°C反應2小時。連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (invitrogen公司)，轉(zhuǎn)化步驟如下100 μ L感受態(tài)細胞中加入10 μ L連接液，混勻，冰浴30分鐘。42°C水浴熱激90 秒，冰上放置3分鐘，加入LB培養(yǎng)基500yL，置于37°C下，150rpm震蕩培養(yǎng)1小時。收集菌體，用200 μ L LB培養(yǎng)基重懸，涂布在LB平板上(含有氨芐青霉素)，37°C培養(yǎng)14小時。 挑取平板上的單克隆提取質(zhì)粒(omega公司試劑盒)，經(jīng)測序驗證其序列正確，該載體命名為 pSSR0pSSR載體序列如SEQ ID NO. 4所示序列，pSSR載體圖譜如圖1所示。pSSR載體是一個大腸桿菌一冰島硫化葉菌的穿梭載體，序列的第3-51位為古菌中的阿拉伯糖核心啟動子，第77-247位為多克隆位點，第M7-1803位為冰島硫化葉菌選擇標記基因simR序列，第20654925位為大腸桿菌選擇標記基因ampR序列，第3200-8100位為來源于冰島硫化葉菌的質(zhì)粒PRN2部分序列。實施例3、利用pSSR載體表達β -半乳糖苷酶1) pSSR-lacS 載體的構(gòu)建設(shè)計引物IacS上游和IacS下游，引物IacS上游中加入了 SphI酶切位點，引物 IacS下游中加入了 Mil酶切位點，引物IacS上游和IacS下游的序列如下IacS 上游5' CGTGCTGCATGCCTCCTCTTATTATTAG 3‘IacS 下游5' TATATAGTCGACCTAGTGTTGCAAGGCAG 3‘以 Sulfolobus solfataricus 基因組 DNA(GenBank :AE006641)為模板，用引物 IacS上游和IacS下游PCR擴增IacS基因片段。PCR反應體系10 XPCR buffer 5 μ L，上游、下游引物(10 μ Μ)各 1 μ L，模板 1 μ L， dNTPs (各 2. 5mM) 4 μ L，pfu 酶(2. 5U/ μ L) 1 μ L,最后補水至 50 μ L。反應條件94°C熱變性5min ；94°C變性45s，退火45s，72°C延伸aiiin，共30個循環(huán)；72°C延伸IOmin。PCR產(chǎn)物在0. 5 X TBE配制的瓊脂糖凝膠中電泳，DNA回收試劑盒(omega公司)回收目的片段，方法參考其說明書，回收產(chǎn)物_20°C保存?zhèn)溆谩Ｓ肧phI和Mil限制性內(nèi)切酶雙酶切IacS基因的PCR產(chǎn)物和pSSR載體。雙酶切體系如下10XH buffer 5 μ L, IacS 基因片段或 pSSR載體 20 μ L，SphI (Takara 公司)2 μ L， Sail (Takara公司)2 μ L，補充水至50 μ L，37°C酶切過夜。酶切產(chǎn)物在0. 5 X TBE配制的瓊脂糖凝膠中電泳，DNA回收試劑盒(omega公司)回收目的片段?；厥债a(chǎn)物_20°C保存?zhèn)溆谩Ｃ盖泻蟮腜CR產(chǎn)物和pSSR載體進行連接反應，反應體系如下IOXligation buffer 1 μ L，T4DNA 連接酶(NEB 公司)1 μ L，酶切后的 PCR 產(chǎn)物 3 μ L，酶切后的載體2 μ L，補充水至10 μ L，16°C反應2小時。
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連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (invitrogen公司)，轉(zhuǎn)化步驟如下100 μ L感受態(tài)細胞中加入10 μ L連接液，混勻，冰浴30分鐘。42°C水浴熱激90 秒，冰上放置3分鐘，加入LB培養(yǎng)基500yL，置于37°C下，150rpm震蕩培養(yǎng)1小時。收集菌體，用200 μ L LB培養(yǎng)基重懸，涂布在LB平板上(含有氨芐青霉素)，37°C培養(yǎng)14小時。 挑取平板上的單克隆提取質(zhì)粒(omega公司試劑盒)，經(jīng)測序驗證其序列正確，該載體被命名為 pSSR-lacS。2) pSSR-lacS載體轉(zhuǎn)化冰島硫化葉菌冰島硫化葉菌感受態(tài)細胞制備所用菌株為 S. islandicus E233S(Deng et al.,2009, Extremophiles,13 735-746)，該菌株為尿嘧啶和乳糖營養(yǎng)缺陷性菌株。硫化葉菌培養(yǎng)基成分為Brock培養(yǎng)基(Brocket al.，1972,Arch Mikrobiol,84 54-68)，蛋白胨(3g/L)，蔗糖(2g/L)，尿嘧唆(2g/L)。從_80°C取出E233S菌種，常規(guī)方法接種到30ml液體培養(yǎng)基中活化，75°C高溫搖床培養(yǎng)，當菌液的0D600在0. 8左右時，按體積比5%的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。重復轉(zhuǎn)接4次后，轉(zhuǎn)接到IOOml培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當0D600在0. 2左右時停止培養(yǎng)，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到2個IOOml的離心管中，6000rpm離心IOmin收集細胞，棄上清。每管加入30ml20mM蔗糖溶液，輕柔地吸吹，重懸細胞，重復2次。用500 μ L蔗糖溶液重懸細胞，將感受態(tài)細胞在室溫放置。用電轉(zhuǎn)的方法將pSSR-lacS載體轉(zhuǎn)化到冰島硫化葉菌中，轉(zhuǎn)化步驟如下將要電轉(zhuǎn)的質(zhì)粒(500ng)分到EP管中，加入50ul感受態(tài)細胞，混勻。將感受態(tài)細胞-DNA懸浮液轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯(Bio-Rad公司)中。電擊，電壓1200伏，電阻600歐，電容25 微法；電擊后，立即用SOOul提前在75度預熱的培養(yǎng)基重懸到EP管中。電擊后細胞75°C 孵育lh。孵育結(jié)束后，將細胞倒在固體平板(含有20 μ M的辛伐他汀，杭州德立公司)上于 75°C培養(yǎng)。3)轉(zhuǎn)化子中β -半乳糖苷酶表達情況檢測將25mg 5_溴_4_氯_3_吲哚-β -D-吡喃半乳糖苷(X-gal)溶解在Iml 二甲基甲酰胺(Dimethylformamide)中，配成Χ-gal母液。將X-gal母液加水稀釋至5mg/ml，然后噴灑在含有轉(zhuǎn)化子的平板上，平板放置75°C中，繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘。經(jīng)過X-gal顯色的轉(zhuǎn)化子顏色由白色變成藍色，如圖2所示，說明pSSR-lacS載體已成功轉(zhuǎn)入冰島硫化葉菌細胞中，且β —半乳糖苷酶得到了成功的表達。 實施例4、pSSR載體表達DNA解旋酶1) pSSR-herA 載體的構(gòu)建設(shè)計引物herA上游和herA下游，引物herA上游中加入了 NdeI酶切位點，引物 herA下游中加入了 Mil酶切位點，引物herA上游和herA下游的序列如下herA 上游5' CGCCGCATATGATAATTGGTTATGTAATTGGTC3 ‘herA 下游5' CTAGTCGACATCACCAATTTCCGTTCCAAAG 3 ‘以Sulfolobus islandicus基因組DNA為模板，用引物herA上游和herA下游PCR 擴增herA基因片段。PCR反應體系10 XPCR buffer 5 μ L，上游、下游引物(10 μ Μ)各 1 μ L，模板 1 μ L，dNTPs (各 2. 5mM) 4 μ L，pfu 酶(2. 5U/ μ L) 1 μ L,最后補水至 50 μ L。反應條件94°C熱變性5min ；94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸aiiin，共30個循環(huán)；72°C延伸IOmin。PCR產(chǎn)物在0. 5 X TBE配制的瓊脂糖凝膠中電泳，DNA回收試劑盒(omega公司)回收目的片段，方法參考其說明書，回收產(chǎn)物_20°C保存?zhèn)溆?。用NdeI和Mil限制性內(nèi)切酶雙酶切herA基因的PCR產(chǎn)物和pSSR載體。雙酶切體系如下IOXH buffer 5 μ L，herA 基因片段或 pSSR 載體 20 μ L，NdeI (Takara 公司)2 μ L， Sail (Takara公司)2 μ L，補充水至50 μ L，37°C酶切過夜。酶切產(chǎn)物在0. 5 X TBE配制的瓊脂糖凝膠中電泳，DNA回收試劑盒(omega公司)回收目的片段?；厥债a(chǎn)物_20°C保存?zhèn)溆谩Ｃ盖泻蟮腜CR產(chǎn)物和pSSR載體進行連接反應，反應體系如下IOXligation buffer 1 μ L，T4DNA 連接酶(NEB 公司)1 μ L，酶切后的 PCR 產(chǎn)物 3 μ L，酶切后的載體2 μ L，補充水至10 μ L，16°C反應2小時。連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (invitrogen公司)，轉(zhuǎn)化步驟如下100 μ L感受態(tài)細胞中加入10 μ L連接液，混勻，冰浴30分鐘。42°C水浴熱激90 秒，冰上放置3分鐘，加入LB培養(yǎng)基500yL，置于37°C下，150rpm震蕩培養(yǎng)1小時。收集菌體，用200 μ L LB培養(yǎng)基重懸，涂布在LB平板上(含有氨芐青霉素)，37°C培養(yǎng)14小時。 挑取平板上的單克隆提取質(zhì)粒(omega公司試劑盒)，經(jīng)測序驗證其序列正確，該載體被命名為 pSSR-herA。2) pSSR-herA載體轉(zhuǎn)化冰島硫化葉菌冰島硫化葉菌感受態(tài)細胞制備所用菌株為 S. islandicus Rey15A(Deng et al. ，2009， Extremophiles,13 735-746)。硫化葉菌培養(yǎng)基成分為=Brock培養(yǎng)基，蛋白胨(3g/L)，蔗糖Qg/L)。從-80°C取出Rey 15A菌種，常規(guī)方法接種到30ml液體培養(yǎng)基中活化，75°C高溫搖床培養(yǎng)，當菌液的0D600在0. 8左右時，按體積比5%的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 重復轉(zhuǎn)接4次后，轉(zhuǎn)接到IOOml培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當0D600在0. 2左右時停止培養(yǎng)，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到2個IOOml的離心管中，6000rpm離心IOmin收集細胞，棄上清。每管加入30ml20mM 蔗糖溶液，輕柔地吸吹，重懸細胞，重復2次。用500 μ L蔗糖溶液重懸細胞，將感受態(tài)細胞在室溫放置。用電轉(zhuǎn)的方法將PSSR-herA載體轉(zhuǎn)化到冰島硫化葉菌中，轉(zhuǎn)化步驟如下將要電轉(zhuǎn)的質(zhì)粒(500ng)分到EP管中，加入50ul感受態(tài)細胞，混勻。將感受態(tài)細胞-DNA懸浮液轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯(Bio-Rad公司)中。電擊，電壓1200伏，電阻600歐，電容25 微法；電擊后，立即用SOOul提前在75度預熱的培養(yǎng)基重懸到EP管中。電擊后細胞75°C 孵育lh。孵育結(jié)束后，將細胞倒在固體平板(含有20 μ M的辛伐他汀)上于75°C培養(yǎng)。3) HerA DNA解旋酶在冰島硫化葉菌中表達挑取平板上的單克隆到30ml液體培養(yǎng)基(含有20μΜ的辛伐他汀)中培養(yǎng)，當 0D600在0. 8時，1 %接種量轉(zhuǎn)接到250ml培養(yǎng)基(不含蔗糖，含有20 μ M的辛伐他汀)中培養(yǎng)，當0D600在0. 2時，加入阿拉伯糖(終濃度0. 2mg/ml)誘導蛋白表達，當0D600在0. 5 時，6000rpm，IOmin收集菌體。收集的菌體經(jīng)超聲波破壁，IOOOOrpm離心，取上清，進行鎳柱親和層析(Novagen公司)，得到純度較高的HerA解旋酶蛋白。將得到的蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，結(jié)果如圖3所示，M是蛋白marker，1是菌體破壁后的全蛋白，2是經(jīng)鎳柱親和層析后的蛋白。
權(quán)利要求
1.一種基于抗生素標記的超嗜熱泉古菌表達載體，其特征在于所述表達載體包括一個原核復制起點、一個古菌復制起點、氨芐青霉素抗性基因、多克隆位點、阿拉伯糖啟動子和抗生素選擇標記基因SimR ；所述載體命名為PSSR ；載體的核苷酸序列為SEQ ID NO. 4所示序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于所述選擇標記基因SimR是一種辛伐他汀抗性基因，由sac7d基因的啟動子和hmg基因組成；其核苷酸序列為SEQ ID NO. 3所示序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述載體的構(gòu)建方法，步驟是1)設(shè)計合成如下引物sac7d 上游5' TAATTGAGCTCCCCTCACTATAACT 3' sac7d 下游5' TCTCTTGCATATTAGGTCAAGTTATCT 3' hmg 上游5' CTTGACCTAATATGCAAGAGATAATTG 3' hmg 下游5' TATATACCCGGGATGGTTAAGTTAATT 3'2)以Sulfolobusacidocaldarius基因組DNA為模板，用sac7d上游和sac7d下游引物進行PCR擴增，得到Sac7d基因的啟動子片段；3)以Sulfolobustokodaii基因組DNA為模板，用hmg上游和hmg下游引物進行PCR 擴增，得到hmg基因片段；4)利用重疊延伸PCR將sac7d基因的啟動子和hmg基因融合，得到simR基因；5)用Mel和XmaI限制性內(nèi)切酶雙酶切simR基因和pZC載體；6)用T4DNA連接酶對酶切后的simR基因和pZC載體進行連接；7)以步驟6)的含重組載體的連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，獲得基于抗生素標記的超嗜熱泉古菌表達載體，即PSSR載體。
4.權(quán)利要求1所述的表達載體在超嗜熱泉古菌中表達超嗜熱酶的應用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于所述超嗜熱酶是半乳糖苷酶或DNA解旋酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于所述超嗜熱泉古菌選擇冰島硫化葉菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于抗生素標記的超嗜熱泉古菌表達載體，包含一個原核復制起點、一個古菌復制起點、氨芐青霉素抗性基因、多克隆位點、阿拉伯糖啟動子和抗生素選擇標記基因simR；所述載體的核苷酸序列為SEQ ID NO.4所示序列。其中simR基因是一種辛伐他汀抗性基因，由sac7d基因的啟動子和hmg基因組成。本發(fā)明還公開了所述表達載體在超嗜熱泉古菌中表達超嗜熱酶的應用。本發(fā)明的載體具有廣泛的宿主范圍，轉(zhuǎn)化效率高，假陽性低，可以簡便、快速、高效的表達帶有組氨酸標簽的超嗜熱酶，預示本發(fā)明的載體具有很好的應用前景。
文檔編號C12N9/40GK102174552SQ20111002092
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月19日
發(fā)明者佘群新, 倪金鳳, 申玉龍, 鄭濤 申請人:山東大學