專利名稱：一種水中沙門氏菌活體的定量檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及地表水體、污水的檢測方法，具體涉及一種水中沙門氏菌活體的定量檢測方法，該方法將多管發(fā)酵技術(shù)、PCR技術(shù)和最大可能數(shù)(MPN)計數(shù)方法相結(jié)合，能夠準確的定量檢測水中沙門氏菌活體的含量。適合于地表水體、污水等多種水樣中沙門氏菌活體的定量檢測。
背景技術(shù)：
前對于沙門氏菌的檢測，可以分為培養(yǎng)法、免疫學(xué)檢測法和核酸檢測法三類。培養(yǎng)法和免疫學(xué)檢測法通常是根據(jù)沙門氏菌的生長特性，采用選擇性的培養(yǎng)基使沙門氏菌成為優(yōu)勢菌群，然后基于沙門氏菌的生化特性和菌體表面抗原特性，利用生化反應(yīng)和抗原-抗體反應(yīng)的特異性進行沙門氏菌的檢測。這些方法大都存在操作復(fù)雜、易受干擾、難以定量檢測的問題。沙門氏菌屬種類極多，其性狀在水環(huán)境中時常會出現(xiàn)變異，常常出現(xiàn)實際生化反應(yīng)結(jié)果與沙門氏菌鑒別表中的類型不相符的情況，造成檢測失敗。核酸檢測法是利用PCR 技術(shù)對沙門氏菌保守的基因片段進行檢測來實現(xiàn)準確檢測的目的，然而其最大的弊端是無法區(qū)分活體和已死亡的菌體，單純利用PCR技術(shù)無法深入研究水環(huán)境中沙門氏菌對人體健康的影響。因此，目前還沒有一種適用于水中沙門氏菌活體的定量檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種水中沙門氏菌活體的定量檢測方法。為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案
一種水中沙門氏菌活體的定量檢測方法，其特征在于，按下列步驟進行 步驟一，樣品采集
用預(yù)先滅菌的采樣瓶采集水樣1L，水樣采集后立即放入冰盒內(nèi)保存，6h內(nèi)進行檢測； 步驟二，水樣的濃縮
對于沙門氏菌濃度低的水樣，真空抽濾IOOOmL水樣通過微孔濾膜，過濾完畢后取出濾膜，置于已滅菌的燒杯中，加入IOmL磷酸鹽緩沖液，該磷酸鹽緩沖液的pH值為7. 4，用磁力攪拌洗脫濾膜30min ；棄濾膜，保存洗脫產(chǎn)物，取洗脫產(chǎn)物lmL，加入到9mL超純水中，混勻后再取出lmL，加入到9mL超純水中，依次梯度稀釋，得到ΙΟΛΚΓ1和10_2三種稀釋度的樣品； 對于沙門氏菌濃度高的水樣，取原水lmL，加入到9mL超純水中，混勻后再取出lmL，加入到9mL超純水中，依次梯度稀釋，得到ΙΟΛΚΓ1和10_2稀釋度的樣品； 步驟三，水樣前增菌
將1O-0、lO-1和10_2這三種稀釋度的樣品分別加入前增菌液混勻，每個稀釋度做5份，放入37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh ； 步驟四，選擇性增菌
將各個稀釋度樣品的前增菌產(chǎn)物ImL轉(zhuǎn)入到100 mL選擇性增菌液中并混勻，在42°C下進行選擇性增菌培養(yǎng)Mh ；步驟五，平板劃線分離
挑取選擇性 增菌產(chǎn)物，分別在XLD平板和BS平板上劃線分離和培養(yǎng)，其中，XLD平板在 37°C下培養(yǎng)24h，BS平板在37°C下培養(yǎng)48h ； 步驟六，陽性菌落的鑒定
培養(yǎng)完畢，觀察在XLD和BS平板上生長的菌落形態(tài)，分別挑取不同形態(tài)的菌落，置于 PCR反應(yīng)管中，以沙門氏菌屬通用引物進行擴增，擴增片段長度為284 bp ；并對PCR產(chǎn)物在 IOOV下電泳40min，觀察在284 bp位置上是否有明亮的擴增條帶出現(xiàn)，若有，則該菌落為沙門氏菌陽性；
所述的沙門氏菌屬通用引物包括上游引物139和下游引物141，其中 上游引物 139 的序列為5，- GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’ ； 下游引物 141 的序列為5，- TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3，；
步驟七，鑒定XLD和BS兩種平板上的陽性菌落，并進行互補計數(shù)，對于每個稀釋度的樣品，對應(yīng)的XLD平板和BS平板只要有其一是陽性平板，則該稀釋度即為陽性；以陽性組合的方式記錄平板上陽性菌落的結(jié)果，對照MPN表查找對應(yīng)的MPN值，除以在步驟二中水樣濃縮的倍數(shù)，得到100 mL水樣的沙門氏菌活體含量(MPN/100mL)。所述的PCR擴增的條件是
(1 )PCR反應(yīng)體系總體積25μ ，其中各成分終濃度為引物139和引物141各0. 4 μ mo 1/ L,0. 75U Taq 酶，0· 8 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L MgCl2 ；
(2) PCR擴增反應(yīng)在PCR儀上進行，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min ；95°C，30s，65°C， 30s，72°C，30s，進行30個循環(huán)；最后72°C延伸4min。本發(fā)明的水中沙門氏菌活體的定量檢測方法，能夠定量檢測水中沙門氏菌活體含量，并提高檢測的特異性，操作簡便可行，適用于地表水、污水等多種水樣的檢測。


圖1是沙門氏菌屬通用引物的PCR產(chǎn)物電泳圖，其中的泳道的標(biāo)號分別為，M泳道表示DNA marker ；1泳道表示鼠傷寒沙門氏菌；2泳道表示傷寒沙門氏菌(CMCC 50071) ；3 泳道表示大腸埃希菌(ATCC25922) ;4泳道表示金黃色葡萄球菌(ATCC25923) ;5泳道表示金黃色葡萄球菌(ATCC29213) ；6泳道表示銅綠假單胞菌(ATCC27853) ；7泳道表示志賀氏菌； 8泳道表示枯草芽孢桿菌；N泳道表示陰性對照。以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式1、設(shè)備和試劑
(1)PCR儀；
(2)核酸水平電泳儀；
(3)凝膠成像儀；
(4)恒溫培養(yǎng)箱
(5)高壓蒸汽滅菌器
(6)不銹鋼真空抽濾器(7)微波爐
(8)0. 22 μ m混合纖維素酯微孔濾膜
(9)鼠傷寒沙門氏菌；
(10)木糖賴氨酸去氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(XLD)
(11)亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基(BS)
(12)氯化鎂孔雀綠增菌液
(13)蛋白胨
(14)瓊脂糖
(15)Tris 干粉
(16)Na2EDTA · 2H20
(17)核酸染料
(18)DNA marker
(19)6XLoading buffer
(20)Taq酶
(21)dNTPs
(22)PCR buffer
(23)沙門氏菌屬通用引物，包括上游引物139和下游引物141；上、下游引物由專業(yè)生物工程公司合成。上游引物139的核苷酸序列為5’_ GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA -3'；下游引物141的核苷酸序列為5'- TCATCGCACCGTCAAAGGAACC _3'，特異性擴增片段為 284bp。2、試劑配制
(1)前增菌液配制稱取8g蛋白胨溶于400mL超純水中，加熱煮沸至完全溶解，定量分裝，高壓蒸汽滅菌備用。(2)選擇性增菌液配制稱取24g氯化鎂孔雀綠固體干粉溶于SOOmL超純水中，力口熱煮沸至完全溶解，分裝，高壓蒸汽滅菌備用。(3)XLD平板的制備稱取21. 57g XLD培養(yǎng)基溶于400mL超純水中，加熱煮沸至完全溶解，冷卻至55°C左右，搖勻，傾注平板，室溫冷卻備用。(4)BS平板的制備稱取19. 84g BS培養(yǎng)基溶于400mL超純水中，加熱煮沸至完全溶解，冷卻至55°C左右，搖勻，傾注平板，室溫冷卻備用。(5)電泳緩沖液的制備稱量242g Tris干粉和37. 2g Na2EDTA ·2Η20置于燒杯中， 加入約800 mL的超純水，57. ImL醋酸，充分攪拌溶解。加超純水定容至IL后，得到50ΧΤΑΕ Buffer。根據(jù)需要，以1 50的比例稀釋，即得到IXTAE Buffer，作為電泳緩沖液。(6)瓊脂糖凝膠的制備稱量1.5g瓊脂糖，置于250mL錐形瓶中，加入100 mL IXTAE Buffer，放入微波爐中加熱至完全溶解，溶液清澈透明時取出。待稍冷，加入IOyL 核酸染料，混勻后傾倒入已插入梳子的核酸水平電泳槽中。待瓊脂糖凝膠完全凝固后即可使用。3、測定程序
(1)樣品采集用預(yù)先滅菌的采樣瓶采集水樣1L，水樣采集后立即放入冰盒內(nèi)保存，6h 內(nèi)進行檢測。
(2)水樣的濃縮將不銹鋼真空抽濾器高壓蒸汽滅菌，把已滅菌的微孔濾膜用超純水潤濕，平貼于真空抽濾器的承托片上，過濾IOOOmL水樣。結(jié)束后，取出濾膜，置于無菌的燒杯中，其中盛有IOmL磷酸鹽緩沖液(pH7. 4)，磁力攪拌洗脫濾膜30min。取洗脫產(chǎn)物lmL， 加入到9mL超純水中，混勻后再取出lmL，加入到9mL超純水中，依次梯度稀釋，得到10_°、 ΙΟ"1和10_2三種稀釋度的樣品。(3)水樣前增菌取ΙΟΛ Ο—1和10_2三種稀釋度的樣品各lmL，分別加入9 mL前增菌液，在具棉塞的錐形瓶中混勻，每種稀釋度各做5管，放入37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。(4)選擇性增菌分別將各個稀釋度樣品的前增菌產(chǎn)物ImL轉(zhuǎn)入到100 mL選擇性增菌液中，在具棉塞的錐形瓶中混勻后置于42°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。(5)平板劃線分離對于每一個進行選擇性增菌的錐形瓶，都用接種環(huán)挑取其中的選擇性增菌產(chǎn)物，分別在一個XLD平板和一個BS平板上劃線分離單菌落，然后在37°C培養(yǎng)。 XLD平板培養(yǎng)24h，BS平板培養(yǎng)48h。(6)陽性菌落鑒定培養(yǎng)完畢，觀察XLD和BS平板上菌落生長形態(tài)。用接種針分別挑取各平板上不同形態(tài)的單菌落，置于PCR反應(yīng)管中，加入沙門氏菌屬通用引物139 (lOymol/L)禾口 141 (10ymol/L)# lyL,0. 15yL 5U/ul Taq 酶，2 μ L 10 mmol/L dNTPs, 2. 5μ L 25mmol/L MgCl2, 2. 5μ L 10XPCR buffer，15. 85 μ L 超純水，總反應(yīng)體積 25 PL。PCR 反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min ；然后95°C，30s，65°C，30s，72°C 30s，共進行30個循環(huán)；最后 72°C 延伸 4min。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物 μ ，加入5μ 6 X Loading buffer混勻，取5μ 置于瓊脂糖凝膠的點樣孔中，以100V的電壓電泳約40 Hiin0完畢后，取出凝膠，置于凝膠成像儀上， 以DNA marker作為參照，觀察樣品擴增條帶的位置。如果樣品在284 bp的位置上有明亮的擴增條帶，則證明該菌落為沙門氏菌屬陽性。一個平板上只要出現(xiàn)一個陽性菌落，該平板即為陽性。(7) MPN定量分析對于每個稀釋度的樣品，其XLD平板和BS平板的陽性菌落鑒定結(jié)果互補計數(shù)。XLD平板和BS平板只要有其一是陽性平板，則該稀釋度樣品即為陽性。 以陽性組合的方式記錄每個稀釋度樣品的檢測結(jié)果，查找最大可能數(shù)(MPN)表(附表1)，得到對應(yīng)的MPN值。例如10_°樣品5管中有3管呈陽性，ΙΟ"1稀釋度樣品5管中有1管呈陽性，10_2稀釋度樣品5管全部為陰性，則記錄為“3-1-0”，查找最大可能數(shù)(MPN)表得到 llOMPN/lOOmL。由于在步驟(2)中進行了 100倍的濃縮，因此水樣的沙門氏菌活體含量為 110
—=l_IMPN/100m￡。 100表1 最大可能數(shù) (MPN)表
權(quán)利要求
1.一種水中沙門氏菌活體的定量檢測方法，其特征在于，按下列步驟進行步驟一，樣品采集用預(yù)先滅菌的采樣瓶采集水樣1L，水樣采集后立即放入冰盒內(nèi)保存，6h內(nèi)進行檢測； 步驟二，水樣的濃縮對于沙門氏菌濃度低的水樣，真空抽濾IOOOmL水樣通過微孔濾膜，過濾完畢后取出濾膜，置于已滅菌的燒杯中，加入IOmL磷酸鹽緩沖液，該磷酸鹽緩沖液的pH值為7. 4，用磁力攪拌洗脫濾膜30min ；棄濾膜，保存洗脫產(chǎn)物，取洗脫產(chǎn)物lmL，加入到9mL超純水中，混勻后再取出lmL，加入到9mL超純水中，依次梯度稀釋，得到ΙΟΛΚΓ1和10_2三種稀釋度的樣品； 對于沙門氏菌濃度高的水樣，取原水lmL，加入到9mL超純水中，混勻后再取出lmL，加入到9mL超純水中，依次梯度稀釋，得到ΙΟΛΚΓ1和10_2稀釋度的樣品； 步驟三，水樣前增菌將IO-flUO-1和10_2這三種稀釋度的樣品分別加入前增菌液混勻，每個稀釋度做5份，放入37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh ； 步驟四，選擇性增菌將各個稀釋度樣品的前增菌產(chǎn)物ImL轉(zhuǎn)入到100 mL選擇性增菌液中并混勻，在42°C下進行選擇性增菌培養(yǎng)Mh ； 步驟五，平板劃線分離挑取選擇性增菌產(chǎn)物，分別在XLD平板和BS平板上劃線分離和培養(yǎng)，其中，XLD平板在 37°C下培養(yǎng)Mh，BS平板在37°C下培養(yǎng)48h ； 步驟六，陽性菌落的鑒定培養(yǎng)完畢，觀察在XLD和BS平板上生長的菌落形態(tài)，分別挑取不同形態(tài)的菌落，置于 PCR反應(yīng)管中，以沙門氏菌屬通用引物進行擴增，擴增片段長度為觀4 bp ；并對PCR產(chǎn)物在 IOOV下電泳40 min，觀察在觀4 bp位置上是否有明亮的擴增條帶出現(xiàn)，若有，則該菌落為沙門氏菌陽性；所述的沙門氏菌屬通用引物包括上游引物139和下游引物141，其中 上游引物 139 的序列為5，- GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’ ； 下游引物 141 的序列為5，- TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3，；步驟七，鑒定XLD和BS兩種平板上的陽性菌落，并進行互補計數(shù)，對于每個稀釋度的樣品，對應(yīng)的XLD平板和BS平板只要有其一是陽性平板，則該稀釋度即為陽性；以陽性組合的方式記錄平板上陽性菌落的結(jié)果，對照MPN表查找對應(yīng)的MPN值，除以在步驟二中水樣濃縮的倍數(shù)，得到100 mL水樣的沙門氏菌活體含量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PCR擴增的條件是(1)PCR反應(yīng)體系總體積25μ ，其中各成分終濃度為引物139和引物141各0.4 μ mol/ L,0. 75U Taq 酶，0· 8 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L MgCl2 ；(2)PCR擴增反應(yīng)在PCR儀上進行，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min ；95°C，30s，65°C， 30s，72°C，30s，進行30個循環(huán)；最后72°C延伸4min。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的前增菌液配制方法是稱取8g蛋白胨溶于400 mL超純水中，加熱煮沸至完全溶解，定量分裝，高壓蒸汽滅菌備用。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的選擇性增菌液配制方法是稱取24g氯化鎂孔雀綠固體干粉溶于SOOmL超純水中，加熱煮沸至完全溶解，分裝，高壓蒸汽滅菌備用。全文摘要
本發(fā)明公開了一種水中沙門氏菌屬活體的定量檢測方法，該方法根據(jù)沙門氏菌的生長特性和invA基因的保守性，采用多管發(fā)酵法從水樣中初步篩選出以沙門氏菌為主的活體細菌。利用沙門氏菌屬通用引物139和141，通過PCR擴增來鑒別沙門氏菌陽性菌落。通過MPN計數(shù)方法，定量檢測水中的沙門氏菌活體。該方法能夠準確檢測水中沙門氏菌活體的含量，特異性高，操作簡便可行，適用于地表水、污水等多種水樣的檢測。
文檔編號C12Q1/06GK102154472SQ20111002050
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月18日
發(fā)明者張崇淼, 王曉昌, 船水尚行 申請人:西安建筑科技大學(xué)