專利名稱：一種γ-氨基丁酸的生產(chǎn)方法及其生產(chǎn)菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Y-氨基丁酸的生產(chǎn)方法及其生產(chǎn)菌株，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
γ-氨基丁酸(Y-Aminobutyric acid，簡稱 GABA)，由谷氨酸(Glutamic acid, Glu)經(jīng)谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase,簡稱GAD)催化脫羧而來。Y -氨基丁酸是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。具有重要的生理功能，已報道的生理活性有調(diào)節(jié)血壓、促使精神安定、促進(jìn)腦部血流、增進(jìn)腦活力、營養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞、增加生長激素分泌、健肝利腎、預(yù)防肥胖、促進(jìn)乙醇代謝(醒酒)、改善更年期綜合癥等多種功效。目前利用基因工程技術(shù)過量表達(dá)谷氨酸脫羧酶基因，來進(jìn)一步提高GABA的產(chǎn)量的研究已有相關(guān)報道。在這個研究領(lǐng)域中，主要是將這些來源于GABA積累菌株的谷氨酸脫羧酶基因?qū)氲酱竽c桿菌或枯草芽孢桿菌的某個野生型菌株中，并使谷氨酸脫羧酶在宿主菌中得到高效表達(dá)，從而增強宿主菌生產(chǎn)GABA的能力，但是采用該方法生產(chǎn)GABA，需要加入大量L-谷氨酸或L-谷氨酸鈉作為前體物質(zhì)，而L-谷氨酸或L-谷氨酸鈉通常由谷氨酸棒桿菌發(fā)酵產(chǎn)生。因此，現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)GABA的過程復(fù)雜且生產(chǎn)成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種Y-氨基丁酸的生產(chǎn)方法，是將谷氨酸脫羧酶基因?qū)氲焦劝彼嵘a(chǎn)菌中構(gòu)建基因工程菌，利用基因工程菌分泌的谷氨酸脫羧酶將其自身積累的谷氨酸脫去一個羧基合成出Y-氨基丁酸。具體方法如下以谷氨酸棒桿菌ATCC13032為出發(fā)菌株，它具有積累谷氨酸的能力，將谷氨酸脫羧酶基因gadBl導(dǎo)入到谷氨酸棒桿菌ATCC13032中構(gòu)建了重組谷氨酸棒桿菌，使得重組菌利用異源表達(dá)的谷氨酸脫羧酶gadBl將其自身積累的谷氨酸脫去一個羧基合成出Y-氨基丁酸。所述谷氨酸脫羧酶基因gadBl來自產(chǎn)Y-氨基丁酸的短乳桿菌，該菌株已于2010 年12月27日，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢、武漢大學(xué)，保藏編號 CCTCC NO :M 2010367，分類學(xué)命名短乳桿菌 Lb85 (Zacio^ci/^As brevis Lb85)。該菌株是從本實驗室系列乳酸菌中利用紙層析方法篩選得到的一株產(chǎn)Y-氨基丁酸的乳酸菌，通過鏡檢和16SrDNA鑒定，證實與GenBank中公布的各種短乳桿菌的 16SrDNA的同源性為99%，從而確定該菌株為短乳桿菌。所述谷氨酸脫羧酶基因gadBl是根據(jù)基因組全序列已公布的短乳桿菌ATCC 367 的谷氨酸脫羧酶基因為參照設(shè)計引物，以篩選出的這株產(chǎn)GABA的短乳桿菌的基因組為模板，利用PCR技術(shù)將其基因組中編碼谷氨酸脫羧酶的基因gadBl擴增出來，并進(jìn)行基因測序，其核苷酸序列如Seq ID NO . I0本發(fā)明還提供了一種GABA的生產(chǎn)菌株，采用本實驗室構(gòu)建的大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭型誘導(dǎo)表達(dá)載體pDXW-8(專利申請?zhí)?00910233618. 1)，將擴增出的目的基因gadBl連接到載體上，構(gòu)建出谷氨酸脫羧酶重組表達(dá)質(zhì)粒pDXW8-gadBl，將重組質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到谷氨酸棒桿菌ATCC13032中，得到重組谷氨酸棒桿菌pDXW8-gadBl/ATCC13032。發(fā)酵液中GABA的精確定量氨基酸自動分析儀法。用5%三氯乙酸將發(fā)酵液稀釋 25倍后靜止30min，12000rpm離心IOmin沉淀蛋白，取上清液，用日立L835-50型氨基酸自動分析儀檢測。氨基酸自動分析儀采用2619#樹脂(陽離子交換柱f2.6X150mm)，53°C分析，GABA用外標(biāo)法定量。本發(fā)明利用重組谷氨酸生產(chǎn)菌，將發(fā)酵產(chǎn)生的L-谷氨酸直接轉(zhuǎn)變成γ-氨基丁酸，具有如下優(yōu)點
1)將谷氨酸的發(fā)酵和GABA的轉(zhuǎn)化合二為一，簡化了GABA生產(chǎn)步驟；
2)培養(yǎng)基以葡萄糖作為碳源、尿素等無機氮作為氮源，相對于需要外源添加L-谷氨酸或L-谷氨酸鈉為前體物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)成本明顯降低。



圖1重組質(zhì)粒pDXW8_gadBl的構(gòu)建示意圖。
具體實施例方式以下通過實施例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明，下列實施例用于說明目的而非用于限制本發(fā)明范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，基本上都按照常見的分子克隆手冊所述的條件進(jìn)行操作。材料和試劑
所用限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，PCR試劑等均購于TaKaRa寶生物公司；大腸桿菌 JM109購自天根生物公司；引物，質(zhì)粒提取試劑盒，PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購于上海生工生物工程公司；電轉(zhuǎn)儀購自Bio-Rad公司；其他試劑均為國內(nèi)或國外購買的分析純試劑。實施例一谷氨酸脫羧酶基因gadBl的獲得
從本實驗室系列乳酸菌中利用紙層析方法篩選出一株產(chǎn)Y-氨基丁酸的乳酸菌，通過鏡檢和16SrDNA鑒定，證實與GenBank中公布的各種短乳桿菌的16SrDNA的同源性為99%， 從而確定該菌株為短乳桿菌。該菌株已于2010年12月27日，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢、武漢大學(xué)，保藏編號CCTCC NO =M 2010367，分類學(xué)命名短乳桿菌 Lb85 {Lactobacillus brevis Lb85)。根據(jù)基因組全序列已公布的短乳桿菌ATCC 367的谷氨酸脫羧酶基因LVIS_1847 為參照設(shè)計引物，以篩選出的這株產(chǎn)GABA的短乳桿菌的基因組為模板，利用PCR技術(shù)將其基因組中編碼谷氨酸脫羧酶的基因gadBl擴增出來，并進(jìn)行基因測序。上游引物BlF:
5' -CTAGCTAGCAGAAGGAGATATACCATGGCTATGTTGTATGGAAAACAC-3’
下游引物BlR: 5， -CCGAAGCTTTTAGTGCGTGAACCCGTATTTTTTA-3’
實施例二 重組谷氨酸棒桿菌pDXW8-gadBl/ATCC13032的構(gòu)建 ① 將gadBl與pDXW-8用同樣的兩種限制性內(nèi)切酶Nhel、HindIII進(jìn)行雙酶切，分別回收1. 43kb和9. 48kb酶切片段，然后將這兩個片段用T4 DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中完成pDXW8-gadBl重組質(zhì)粒的構(gòu)建(圖1)；
② 將重組質(zhì)粒pDXW8-gadBl經(jīng)電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到谷氨酸棒桿菌ATCC13032中， 得到重組谷氨酸棒桿菌pDXW8-gadBl/ATCC13032。谷氨酸棒桿菌ATCC13032感受態(tài)的制備。將谷氨酸棒桿菌ATCC13032單菌落于液體LBG培養(yǎng)基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，5g/L葡萄糖)中30°C培養(yǎng)過夜， 隨后以10%的接種量轉(zhuǎn)接于30mL感受態(tài)培養(yǎng)基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl, 25g/L甘氨酸，0. 1% Tween-80)中，30°C培養(yǎng)3-釙，之后將菌液置于冰水浴冷卻15min，離心棄上清，將細(xì)胞懸浮于30mL冰冷的10%甘油中，再次離心棄上清，并用10%甘油重復(fù)洗滌2 次，最后用400μ L 10%的冷甘油重懸細(xì)胞，分裝后于_70°C保存或直接用于電轉(zhuǎn)化。實施例三重組谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA
培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基(葡萄糖2. 5%，尿素0. 6%，玉米漿3. 0%，K2HPO4 · 3H20 0. 15%， MgSO4 · 7H20 0. 05%, pH 7. 0 7. 5)；發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖16%，尿素0. 4%，玉米漿0. 3%， K2HPO4 · 3H20 0. 2%, MgSO4 · 7H20 0. 08%, MnSO4 2mg/L, FeSO4 2mg/L, pH 7· 0 7· 5)
培養(yǎng)條件重組谷氨酸棒桿菌在種子培養(yǎng)基中30°C振蕩培養(yǎng)12h后，以10%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵12h時加入ImM IPTG誘導(dǎo)，并在隨后的24h之內(nèi)通過間歇性添加尿素的方法使培養(yǎng)基PH值控制在中性范圍，之后繼續(xù)發(fā)酵至60h，測定發(fā)酵液中Y-氨基丁酸含量。經(jīng)檢測重組菌發(fā)酵液中Y-氨基丁酸的含量為5.6mM，而野生菌ATCC13032發(fā)酵液中未檢出Y-氨基丁酸。序列表
<110>江南大學(xué)
<120> 一種Y-氨基丁酸的生產(chǎn)方法及其生產(chǎn)菌株 <160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1407
<212> DNA
<213> Seq ID NO · 1
<220>
<223>擴增得到基因序列
<400> 1
atggctatgttgtatggaaaacacacgcatgaaacagatgagacgctcacaccaatcttc60ggggccaccgctgaacgccacgacctccccaaatataaattggcgaagcacgcgctcgag120ccccgtgaagccgatcggttggttcgcgatcaactgctagatgaaggaaaCtCgCggCtg180aatctcgccacgttctgtcagacttacatggaaccggaagctgttgaactcatgaaggat240acactggagaaaaacgccatcgataaatccgagtatcctcggaccgctgaaattgaaaat300cgttgcgttaatatcattgccaacctctggcatgctccggaagctgagtcgttcactggc360acctcaacgattgggtcctccgaagcttgcatgctggccggtttggcgatgaagtttgct420tggcgtaagcgcgccaaggcgaacggtcttgacttaactgcccatcaacctaatattgtc480atctcagccggctatcaagtttgttgggaaaaattctgtgtctattgggacatcgacatg540catgtcgttcccatggacgatgaccacatgtccttgaatgtcgatcacgtgttagattac600gtggatgactacaccattggtatcgttggcattatgggcatcacttatactggacaatac660gacgatttagcccgattagatgccgttgtagagcggtataatcggacgactaagttcccg720gtatatatccatgtcgatgccgcttccggcggattttacacgccgtttattgaacccgag780ctcaagtgggacttccgtttaaacaacgtgatttccatcaatgcctccggccacaaatat840ggcttggtttatcccggagtcggctgggtaatctggcgtgaccaacagtatctaccaaaa900gagttggtctttaaggtcagctacttgggtggtgaactacctacgatggccatcaacttc960tcccacagtgcctcccaattaatcggtcagtattacaactttattcgctttggttttgat1020ggctatcgtgaaattcaagaaaaaactcacgacgttgcccgctatctcgcgaaatcgctc1080actaaattagggggcttttccctcattaacgacggccacgagttaccgctgatctgttat1140gaactcactgccgattctgatcgtgaatggaccctctacgatttatccgatcggctatta1200atgaagggctggcaggttcccacctatccc 3.0 C 3.3.3.3.3.acatggcggaccgcgttatc1260caacggattgtggttcgggctgactttggtatgagtatggcccacgactttattgatgat1320ctaacccaagccattcacgatctcgaccaagcacacatcgttttccatagtgatccgcaa1380cctaaaaaat acgggttcac gcactaa1407
<210>2
<211>48
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>根據(jù)基因序列設(shè)計用于擴增
<400>2
ctagctagca gaaggagata taccatggct atgttgtatg gaaaacac48
<210>3
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>根據(jù)基因序列設(shè)計用于擴增
<400>3
ccgaagcttt tagtgcgtga acccgtattt ttta3權(quán)利要求
1.一種Y-氨基丁酸的生產(chǎn)方法，是將谷氨酸脫羧酶基因?qū)氲焦劝彼嵘a(chǎn)菌中構(gòu)建基因工程菌，利用基因工程菌分泌的谷氨酸脫羧酶將其自身積累的谷氨酸脫去一個羧基合成Y-氨基丁酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述谷氨酸脫羧酶基因gadBl如％(1ID NO 1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述谷氨酸生產(chǎn)菌為谷氨酸棒桿菌 ATCC13032。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述質(zhì)粒采用大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭型誘導(dǎo)表達(dá)載體pDXW-8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，將谷氨酸脫羧酶基因gadBl導(dǎo)入到谷氨酸棒桿菌ATCC13032中得到基因工程菌pDXW8-gadBl/ATCC13032，利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)Y-氨基丁酸。
6.一種采用權(quán)利要求1方法構(gòu)建的基因工程菌，是將谷氨酸脫羧酶基因?qū)氲焦劝彼嵘a(chǎn)菌中構(gòu)建的基因工程菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述基因工程菌，其特征在于，該菌株為pDXW8-gadBl/ATCC13032。
8.—種權(quán)利要求6所述基因工程菌在Y-氨基丁酸發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種γ-氨基丁酸的生產(chǎn)方法及其生產(chǎn)菌株，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。是將谷氨酸脫羧酶基因?qū)氲焦劝彼嵘a(chǎn)菌中構(gòu)建基因工程菌，從而利用基因工程菌分泌的谷氨酸脫羧酶將其自身積累的谷氨酸脫去一個羧基合成出γ-氨基丁酸(GABA)。本發(fā)明不僅將谷氨酸的發(fā)酵和GABA的轉(zhuǎn)化合二為一，簡化了GABA生產(chǎn)步驟；而且以葡萄糖、尿素等為培養(yǎng)原料，相對于需要外源添加L-谷氨酸或L-谷氨酸鈉為前體物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化方法，生產(chǎn)成本明顯降低。
文檔編號C12N15/60GK102154393SQ20111002060
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月18日
發(fā)明者史鋒, 李佑新, 李永富, 王小元 申請人:江南大學(xué)