專利名稱：產(chǎn)2s-甲基丙二酰輔酶a的假單胞工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種產(chǎn)2S-甲基丙二酰輔酶A的假單胞工程菌。
背景技術(shù)：
來源于放線菌的次級代謝產(chǎn)物是臨床上藥物的重要來源，約70%的抗菌藥物屬于此類。由于這些次級代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，采用化學(xué)方法合成這些化合物成本高、操作繁瑣，不能滿足大量的商品化生產(chǎn)的需要。而采用原始菌進行次級代謝物的生產(chǎn)，往往菌體生長速度慢、產(chǎn)量低、難培養(yǎng)，遺傳背景不清晰，代謝產(chǎn)物不清晰，且很難進行遺傳操作，這些因素制約著對有價值的次級代謝產(chǎn)物的開發(fā)應(yīng)用。近年來，次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的異源表達成為提高化合物產(chǎn)量或有針對性地改造化合物的有效手段。在異源表達宿主的選擇中，由于假單胞菌與放線菌密碼子的使用相近，有翻譯后修飾，安全無毒(如模式菌株惡臭假單胞菌I3Seudomonas putida KTM40)，生長快速，次級代謝產(chǎn)物背景清晰等優(yōu)點，成為首選的宿主菌之一。P. putida KT2440表達異源產(chǎn)物已有成功的例子，如粘細菌Stigmatella aurantiaca DW4/3-1的全基因組序列分析后發(fā)現(xiàn)至少有八個PKS型，NRPS型或H(S/NRPS 雜合型的生物合成基因蔟，但常規(guī)的發(fā)酵和產(chǎn)物的分離純化只得到Myxothiazol —種化合物，對某“沉默基因蔟”敲除后所得變異株的分析發(fā)現(xiàn)，其HPLC圖譜比原株少一個特征峰。 RulfMuller研究組將此“沉默基因蔟”克隆后，轉(zhuǎn)化至P. putidaKT2440中，在苯甲酸誘導(dǎo)下，得到了 H(S/NRPS型化合物Myxochromide，發(fā)酵2天產(chǎn)量就達到了 40mg/mL，而原株發(fā)酵 7天的產(chǎn)量僅為8mg/mL。因此，可以通過基因工程方法大量地獲得新的、有潛在應(yīng)用價值的化合物，為進一步的藥效學(xué)研究提供充足的原料來源。但惡臭假單胞菌不能全面地提供復(fù)雜的次級代謝產(chǎn)物生物合成所需的小分子前體。如很多次級代謝產(chǎn)物需要以2S-甲基丙二酸輔酶A(2S-Methylmalonyl-CoA，2S-mmCoA) 作為延伸單位，而在惡臭假單胞菌中不能檢測到2S-甲基丙二酸輔酶A的存在。雖然已有報道可進行化學(xué)合成2S-甲基丙二酰輔酶A，但化學(xué)合成成本大，技術(shù)難度高，而且很難得到單一的光學(xué)異構(gòu)體產(chǎn)物，并且由于其不穩(wěn)定性很難直接供給微生物作為合成底物利用，而 2S-甲基丙二酰輔酶A在細胞內(nèi)生成可直接用于次級代謝產(chǎn)物的合成，可大大降低發(fā)酵成本。因此在異源表達宿主菌中合成2S-甲基丙二酰輔酶A是最佳選擇，構(gòu)建能夠產(chǎn)生2S-甲基丙二酸輔酶A的基因工程菌株，是異源表達需要以之作為前體物質(zhì)的次級代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)，有著廣泛的應(yīng)用價值。已知生物體內(nèi)有兩個2S-甲基丙二酸輔酶A的生物合成途徑。一是MCM途徑，即以三羧酸循環(huán)中的琥珀酰輔酶A為起始化合物，通過甲基丙二酰輔酶A變位酶(MCM)和甲基丙二酰輔酶A變位酶復(fù)合物保護蛋白(MeaB)的作用生成2R-甲基丙二酰輔酶A，再通過甲基丙二酰輔酶A異構(gòu)酶(Epi)的作用而生成2S-甲基丙二酸輔酶A。另外一條是PCC途徑，即首先從L-丙氨酸、L-異亮氨酸或L-甲硫氨酸生成(或以奇數(shù)位脂肪酸降解)而獲得丙酰輔酶A，繼而在ATP的參與下通過羧化酶的作用生成2S-甲基丙二酸輔酶A，參與該過程的基因包括丙酰-CoA羧化酶基因和羧化酶復(fù)合物A亞單位基因。為了異源表達需要以2S-甲基丙二酸輔酶A作為前體單元的myxothiazol，德國 Rolf MulIer研究組將粘細菌Sorangium cellulosumSoce56全基因組中成簇的mem、印i和 meaB三個基因通過同源重組整合至假單胞菌P. putida KT2440的基因組中，所得菌株發(fā)酵后，經(jīng)氣相色譜和質(zhì)譜連用(GC/MQ檢測表明可產(chǎn)生4. 68nmol/mL的2S-甲基丙二酸輔酶 A。然而，該菌株2S-甲基丙二酸輔酶A的產(chǎn)量較低，直接影響了最終次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)2S-甲基丙二酰輔酶A的假單胞工程菌。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種產(chǎn)2S-甲基丙二酰輔酶A的假單胞工程菌， 其是將來源于天藍色鏈霉菌(Sterptomyces coelicolor)的編碼丙酰-CoA羧化酶的pccB 基因和編碼羧化酶復(fù)合物A亞單位的accAl基因與篩選標(biāo)記基因一起整合至惡臭假單胞菌 O^eudomonasputidEOKTM^的基因組中而獲得。其中，所述篩選標(biāo)記基因為卡那霉素抗性基因或慶大霉素抗性基因。優(yōu)選地，前述的工程菌是將pccB基因和accAl基因與篩選標(biāo)記基因一起整合至惡臭假單胞菌KTM40基因組中rpe基因和trpE基因之間的區(qū)域而獲得。其中，rpe基因和 trpE基因分別編碼磷酸核酮糖3-異構(gòu)酶和鄰氨基苯甲酸合酶，rpe基因和trpE基因之間為編碼磷酸乙醇磷酸酶的gph基因。gph基因為非必須基因，即此基因的缺失不影響菌株的生理和生化功能。前述產(chǎn)2S-甲基丙二酰輔酶A的假單胞工程菌的培養(yǎng)方法為將所述工程菌接種于LB培養(yǎng)基中，在30°C下進行培養(yǎng)。本發(fā)明的目的還可以采用以下的技術(shù)措施來進一步實現(xiàn)。本發(fā)明提供一種產(chǎn)2S-甲基丙二酰輔酶A的惡臭假單胞菌O^seudomonas putida) Sino-PCC，保藏號CGMCC NO. 4517。其通過以下方法獲得將來源于天藍色鏈霉菌的編碼基因丙酰-CoA羧化酶的pccB基因和編碼羧化酶復(fù)合物A亞單位的accAl基因與卡那霉素抗性基因一起通過重組整合至惡臭假單胞菌KTM40的基因組中。卡那霉素抗性基因和pccB 基因及accAl基因連接在一起，作為基因整合菌株的篩選標(biāo)記。對惡臭假單胞菌Sino-PCC進行發(fā)酵，經(jīng)氣相色譜和質(zhì)譜連用(GC/MS)檢測表明 Sino-PCC可產(chǎn)生高達6. 24nmol/mL的2S-甲基丙二酸輔酶A，該產(chǎn)量高于文獻報道的產(chǎn)量。本發(fā)明通過基因工程的方法，將來源于天藍色鏈霉菌(Sterptomyces coelicolor)的編碼丙酰-CoA羧化酶的pccB基因和編碼羧化酶復(fù)合物A亞單位的accAl 基因與篩選標(biāo)記基因一起整合至惡臭假單胞菌O^seudomonas putida) KTM40的基因組中， 構(gòu)建得到產(chǎn)2S-甲基丙二酰輔酶A的假單胞工程菌，為異源表達需要以2S-甲基丙二酸輔酶A作為前體單元的次級代謝產(chǎn)物的合成提供了基礎(chǔ)，有著廣泛的應(yīng)用價值。


圖1是PCC途徑生物合成2S-甲基丙二酰輔酶A的相關(guān)基因整合至P. putida KT2440基因組中的示意圖，其中oriT是結(jié)合轉(zhuǎn)移片段，sacB是6-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因，bla是氨芐青霉素抗性基因，rpe是磷酸核酮糖3_異構(gòu)酶基因，Km是卡那霉素抗性基因， accAl是編碼丙?；o酶A羧化酶α亞單元的基因，pccB是編碼丙?；o酶A羧化酶的基因，trpE是鄰氨基苯甲酸合酶基因，gph是磷酸乙醇磷酸酶基因，pp_0414和pp_0418是 P. putida KT2440基因組中功能未明確的基因；ASU Li、L2、K2、AS2、RU R2和AS3為驗證 P. putida Sino-PCC菌株基因型所設(shè)計的PCR引物。圖2是P. putida Sino-PCC菌株基因型分析的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中 1. DL500DNA Marker ；2. DL2000DNA Marker ；3. ASl 和 L2 引物擴增的 1. 2kb ；4. Ll 和 K2 引物擴增的2. Ikb ；5. AS2和R2引物擴增的2. 6kb ；6. Rl和AS3引物擴增的1. 5kb。圖3是P. putida Sino-PCC產(chǎn)生2S_mmCoA的GC/MS分析結(jié)果圖，其中A是 P. putida KTM40發(fā)酵液(空白對照)的GC/MS分析結(jié)果圖；B是P. putida Sino-PCC發(fā)酵液的GC/MS結(jié)果圖，MSlOl為丙二酸的分子離子峰，MS104為內(nèi)標(biāo)氘代丙二酸的分子離子峰。圖4是P. putida Sino-PCC產(chǎn)生2S-甲基丙二酰輔酶A的時間-產(chǎn)量曲線圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實施例中使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。以下實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分的，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均與首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。以下實施例中使用的菌株和質(zhì)粒，均為已公開的菌株和質(zhì)粒1. Escherichia coli DHlOB 基因型 F—mcrA(mrr-hsdRMS—mcrBC)80dlacZ M151acX74deoR recAlaraD139 (ara，leu) 7697galU galK rpsL endAlnupG。 文獻 LifeTechnologies, Inc. Focus (1990) 12，19。購自美國 Invitrogen 公司。2.Ε.coli HB101/pRK2073 文 ^ =Marx CJ, Lidstrom ME. evelopment of improved versatile broad-host-range vectors for use inmethylotrophs and other Gram-negative bacteria, icrobiology. 2001,147 (Pt 8) :2065_75。由美國華盛頓大學(xué) Mary Lidstrom 教授提供。3. P. putida KT2440 文獻Nelson KE, Weinel C, Paulsen IT 等，Complete genome sequence and comparative analysis of themetabo1icalIy versatile Pseudomonas putida KT2440. Environ Microbiol2002，4 :799_808。___ The Institute for Genomic Research 的 KarenNelson 博士提供。4. S. coelicolor A3 (2)文獻Bentley SD, Chater KF, Cerdeno-Tarraga AM 等，Complete genome sequence of the modelactinomycete Streptomyces coelicolor A3 (2). Nature. 2002,417 :141-147。由英國 John Innes 研究所 Keith Chater 博士提供。5. pBluescript II KS(-) ^；^ :Alting-Mees MA, Short JM. pBluescript II: gene mapping vectors. Nucleic Acids Res, 1989,17 :9494。購自美國 Novagen 公司。6. pACYC177 文獻Chang AC, Cohen SN. Construction andcharacterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derivedfrom the P15A crypticminiplasmid. 1978，J Bacteriol，134，1141-1156。購自美國 NEB 公司。7. pEXlOOTlink 文獻Quenee L, Lamotte D, Polack B. CombinedsacB-based negative selection and cre-lox antibiotic marker recycling forefficient gene deletion in pseudomonas aeruginosa. Biotechniques. 2005, 38 (1) :63_7。由法國 Centre Hospitaller Universitaire 的 Benoit Polack 教授提供。8.惡臭假單胞菌KTM40基因組序列的Genbank接收號(Accession No.)為 NC_002947o實施例1構(gòu)建含以PCC途徑生物合成2S-甲基丙二酰輔酶A的相關(guān)基因的質(zhì)粒1.感受態(tài)大腸桿菌DHlOB的制備和DNA轉(zhuǎn)化自平板上接種新鮮劃線培養(yǎng)的單菌落至aiil LB液體培養(yǎng)基中37°C振蕩過夜，以 1/50體積轉(zhuǎn)至50ml LB中，振蕩培養(yǎng)至菌體0D600約為0. 6。將菌液倒入預(yù)冷的離心管中， 冰浴10分鐘，4°C，5000rpm離心5分鐘，棄上清。以10%的甘油洗滌沉淀兩次，最后懸浮于 200 μ 1的10%甘油中，每管分裝50 μ 1。將DNA連接產(chǎn)物加至50 μ 1冰上融化的DH10B的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞中，輕彈混勻。將混合液轉(zhuǎn)移至冰上預(yù)冷的Imm電轉(zhuǎn)杯中，電擊轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化條件1mm電轉(zhuǎn)杯，200 Ω， 1800V, Bio-Rad公司Gene PulserIIR電轉(zhuǎn)化儀。加Iml LB液體培養(yǎng)基至電轉(zhuǎn)杯，吹打混勻，將溶液轉(zhuǎn)移至一個無菌的1. 5ml印pendorf管中，37°C或30°C振蕩培養(yǎng)60分鐘后，轉(zhuǎn)化液涂布在相應(yīng)抗生素的抗性平板上，37°C或30°C培養(yǎng)。挑取單菌落，在含相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切和測序鑒定。LB培養(yǎng)基的組成(g/ml，% ):蛋白胨1，酵母提取物0. 5，氯化鈉1，固體培養(yǎng)時加 1. 5%的瓊脂，115°C滅菌 20min。2. Sterptomyces coelicolor A3 (2)基因組 DNA 的提取將在_70°C凍存的S. coelicolor A3 (2)劃線于ISPII固體平板上，30°C培養(yǎng)2天以上；從固體平板上挑取一塊菌塊到20mL ISPII液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，30°C 220rpm/min搖床培養(yǎng)約30小時；取1. Oml菌體到1. 5mL離心管，13200rpm離心，30秒，收集菌體；將菌體重懸于467L TE緩沖液，混勻，加入30mL 10 % SDS (十二烷基磺酸鈉)，加入3mL20mg/mL的蛋白酶K溶液，混勻，37°C保溫1小時；加入等體積苯酚氯仿抽提，混勻，13200rpm離心IOmin ； 取上清，重復(fù)上述步驟；取上清，加入等體積氯仿抽提，混勻，13200rpm離心IOmin ；取上清， 加入1/10倍體積的5M醋酸鈉，0. 6倍體積的異丙醇，混勻至有白色絮狀沉淀產(chǎn)生；用玻璃棒挑取絮狀沉淀，用70%乙醇洗滌；將絮狀沉淀溶于適量的TE緩沖液，50°C 30min ；置于 37 °C待DNA完全溶解。ISPII培養(yǎng)基的組成(g/ml，％)酵母提取物0. 3，麥芽提取物1，葡萄糖1，pH7. 3， 固體培養(yǎng)時加1. 5 %的瓊脂，115 °C滅菌20min。TE緩沖液的組成10mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，ImM 二胺四乙酸二鈉，pH 8.0。3.構(gòu)建含PCC途徑生物合成2S-甲基丙二酰輔酶A的相關(guān)基因的質(zhì)粒設(shè)計引物L(fēng)l 5' -GGGGAGCTCGGGAGCCCTGTTTGCCTTTGCC-3‘L2 5' -GGGGGATCCGCATGCCGATCTCGCGGATGTTGTTGAC-3‘分別在5'端引入Mcl位點，在3'端引入BamHI和SphI位點(以下劃線表示)。以P. putida KT2440基因組DNA為模板，Ll和L2為引物擴增出1. Okb的rpe基因區(qū)域，以 SacI和BamHI酶切后，克隆至pBluescript IIKS (-)的&icl和BamHI位點，獲得重組質(zhì)粒 pSino-100。設(shè)計引物Kl 5' -GGGGAGCTCGCA-3‘K2 5' -GGGGGATCCTTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3‘分別在5'端引入Mcl和SphI位點，在3'端引入BamHI位點(以下劃線表示)。 以pACYC177為模板，Kl和K2為引物擴增出1. Okb的Km基因，以SacI和BamHI酶切后，克隆至 pBluescript II KS (-)的 &icl 和 BamHI 位點，獲得重組質(zhì)粒 pSino_101。設(shè)計引物 ACl 5' -GGGTCTAGAAGATCTGTGCGCAAGGTGCTCATCGCC-3‘AC2 5' -GGGCTGCAGTCAGTCCTTGATCTCGCAGATG-3‘分別在5'端引入^CbaI和BglII位點，在3'端引入I^stI位點(以下劃線表示)。以S. coelicolor基因組DNA為模板，ACl和AC2為引物擴增出1. 8kb的accAl基因， XbaI和I3StI酶切后，克隆至pBluescript II KS (-)的XbaI和I^stI位點，獲得重組質(zhì)粒 pSino_102o設(shè)計引物PBl 5' -GGGCTGCAGATGTCCGAGCCGGAAGAGCAG-3‘PB2 5' -GGGCTCGAGTTACAGGGGGATGTTGCCGTG-3‘分別在5'端引入I3StI位點，在3'端引入BioI位點(以下劃線表示)，以 S. coelicolor基因組DNA為模板，PBl和PB2為引物擴增出1. 8kb的pccB基因，PstI和XhoI 酶切后，克隆至pBluescript II KS (-)的I3StI和XhoI位點，獲得重組質(zhì)粒pSino-103。設(shè)計引物Rl 5' -GGGCTCGAGCTGCGCCTGGCCGCTG-3‘R2 5' -GGGTCTAGAGTGCTCGGCAATTTCCTTGTCGTC-3'分別在5'端引入BioI位點，在3'端引入^CbaI位點(以下劃線表示)。以 P. putida KT2440基因組DNA為模板，Rl和R2為引物擴增出1. Okb的trpE基因區(qū)域，以 XhoI和XbaI酶切酶切后，克隆至pBluescript II KS (-)的BioI和)(bal酶切位點，獲得重組質(zhì)粒 pSino-104。以上質(zhì)粒的克隆宿主菌均為DH10B，所有均經(jīng)酶切和測序驗證其所克隆得序列的正確性。SacI 禾Π SphI 酶切 pSino-100 得到 1. Okb 的 rpe 基因片段，SphI 和 BamH 酶切 pSino-101得到l.Okb的Km基因片段，兩片段連接后克隆至pBluescript II KS㈠的^icI 和BamHI位點，得到重組質(zhì)粒pSino_105。PstI 和 XhoI 酶切 pSino-103 得到 1. 6kb 的 pccB 基因片段，XhoI-XbaI 酶切 pSino-104得到l.Okb的trpE基因片段，兩片段連接后克隆至pBluescript II KS㈠的 PstI和XbaI位點，得到重組質(zhì)粒pSino-106。SacI和BamHI酶切pSino-105得到2. Okb的插入片段，BglII和PstI酶切 pSino-102得到1. 8kb的accAl基因片段，PstI和XbaI酶切pSino—106得到2. 6kb的插入片段，三個片段連接后克隆至pBluescript II KS(-)的McI和)(baI位點，得到重組質(zhì)粒 pSino_107oSacI 和 XbaI 酶切 pSino-108 所得的 6. 4kb 片段克隆至 pEXlOOTlink 的 SacI 和 XbaI位點后，得到最終用于同源重組質(zhì)粒得pSino-108。以上50 μ 1 PCR反應(yīng)體系dd H2O38. 2 μ 110XPCR反應(yīng)緩沖液5 μ 1IOmMdNTP1. 3μ 1上游引物(終濃度0. 75mM)1. 5 μ 1下游引物(終濃度0. 75mM)1. 5 μ 1模板(質(zhì)粒約lOOng，基因組DNA約200ng) 2 μ 1pfu 聚合酶(5U/ μ 1)0· 5 μ 1PCR反應(yīng)條件95°C變性5分鐘，(95°C 45秒，60°C 1分鐘，72°C Ikb每分鐘)，共 34個循環(huán)，72°C延伸10分鐘。PCR儀購自Bio-rad公司，型號為PTC-200。反應(yīng)結(jié)束后，以加入20μ g/ml的溴化乙錠(EB)的1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。實施例2將上述所得質(zhì)粒通過三親接合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)化至P.putidaKT2440，在10%蔗糖的負篩選作用下，PCC途徑相關(guān)基因通過rpe基因和trpE基因得同源重組而整合至 P. putida KT2440的基因組，得到基因工程菌株Sino-PCC。1.三親本雜交法轉(zhuǎn)化P. putida KT2440從凍存管中分別劃線P. putida KT2440于LB平板，30°C，培養(yǎng)過夜；劃線E. coli HB101/pRK2073于含50μ g/mL鏈霉素的LB平板，37 °C，培養(yǎng)過夜；劃線E. coli DH10B/ pSino-108于含30 μ g/mL卡那霉素的LB平板，37°C，培養(yǎng)過夜。挑P. putida KT2440單菌落接種于2mL LB液體培養(yǎng)基中，30°C，220rpm，振蕩培養(yǎng)過夜；挑E. coliHB101/pRK2073單菌落接種于21^含5(^8/1^鏈霉素的1^液體培養(yǎng)基中，371，22011)111，振蕩培養(yǎng)過夜；挑單菌落E. coli DH10B/pSino-108于含30 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，振蕩培養(yǎng)過夜。分別取ImL 的 E. coli HB101/pRK2073、E. coli DH10B/pSino-108 和 1. 4mL P. putida KT2440的新鮮菌液，分別離心，棄去上清，用LB洗菌體兩次以去除殘留的抗生素，并分別用 ImL 的 LB 懸浮菌體。將 500 μ 1 Ε. coli HB101/pRK2073 和 500 μ 1 Ε. coli DH10B/pSino-108的懸浮菌液混合，37°C溫育30min，與ImL已懸浮的P. putida KT2440菌液混合，離心，100 μ 1 LB懸浮混合的菌體，并小面積涂布于LB平板上，置于30°C約15h。用ImL無菌水刮取LB平板上的菌苔，取20 μ 1菌懸液稀釋涂布于含50 μ g/mL氯霉素和30 μ g/mL卡那霉素的PMM的平板上，30°C培養(yǎng)約20h，挑取單菌落在ImL含50 μ g/mL 氯霉素和30 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取50 μ 1稀釋涂布于含50 μ g/ mL氯霉素和30 μ g/mL卡那霉素及10 %蔗糖的PMM平板上。PCC途徑生物合成2S-甲基丙二酰輔酶A的相關(guān)基因整合至P. putida KT2440基因組的示意圖如圖1所示。PMM培養(yǎng)基的組成(g/ml，% )磷酸氫二鉀0. 7，磷酸二氫鉀0. 3，檸檬酸鈉0. 05，七水硫酸鎂0. 1，硫酸銨0. 1，葡萄糖0.4，瓊脂1.5，pH7.3，115°C滅菌20min。2.基因工程菌株Sino-PCC的獲得pSino-108中的sacB基因編碼6_果糖基轉(zhuǎn)移酶，該酶催化蔗糖為對假單胞菌有毒害作用的果聚糖，因此含有pSino-108的菌株不能在含有蔗糖的培養(yǎng)基上生長。在卡那霉素抗性的篩選之下，pSino-108上的rpe基因和trpE基因及P. putida KT2440的同源片段發(fā)生同源重組，Km-accAl-pccB基因整合至P. putida KT2440基因組，基因組上rpe基因和 trpE基因之間gph基因被去除。將所得單菌落接種于含30 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，提取基因組，進行PCR驗證。引物設(shè)計如下AS1 :5' -ATCTCGCCCATGGTGGTGCCG-3 ‘，為針對pp 0414基因序列設(shè)計的引物；L2為擴增rpe基因的下游引物；Ll為擴增rpe基因的上游引物； K2 為擴增 km 基因的下游引物；AS2 5 ‘ -GTGCTCGGCAATTTCCTTGTCGTC-3 ‘，為擴增 accAl 基因的下游引物；R2為擴增trpE基因的下游引物；Rl為擴增trpE基因的上游引物；AS3 5' -CTGCGCCTGGCCGCTGCCGGC-3‘，為針對pp_0418基因中間序列設(shè)計的引物。共獲得四株基因型正確的轉(zhuǎn)基因工程菌，任取一株命名為P. putida Sino-PCC，現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)大屯路中科院微生物研究所，保藏編號CGMCC NO. 4517，保藏日期2010年12月觀日。P. putida Sino-PCC菌株基因型分析的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖2所示。實施例3發(fā)酵培養(yǎng)P. putida Sino-PCC，通過GC/MS測定不同發(fā)酵時間細胞內(nèi)mmCoA的含量。1.轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵培養(yǎng)將雙交換的轉(zhuǎn)化子單克隆挑取到2mL含30 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 30°C，180rpm，振蕩培養(yǎng)過夜；以1 1000的比例稀釋到IOOmL含30 μ g/mL卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，30°C，180rpm，振蕩培養(yǎng)，分別在10h、20h、40h、60h、80h、IOOh取樣，同時以 P. putidaKT2440原株培養(yǎng)作為對照。取樣后測定OD6tltl,剩余菌液7000rpm離心5min收集菌體。2.胞內(nèi)2S-甲基丙二酰輔酶A的提取向菌體中加入3mL pH7. 050mM磷酸鹽緩沖液，混勻；將菌體超聲破碎，至菌液變清；加入50mL甲醇，ISOrpm振蕩搖勻1小時；將甲醇溶液用漏斗過濾；將過濾得到的液體在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上45°C蒸干，蒸干后加入Iml甲醇溶解，得到提取物。3. 2S-甲基丙二酰輔酶A和內(nèi)標(biāo)物的衍生化處理取300 μ 1提取物，加入內(nèi)標(biāo)物IOnmol甲基氘代丙二酸，混勻，真空抽干；加入 400 μ 1環(huán)己烷，100 μ 1酸性正丁醇，混勻；在樣品瓶內(nèi)80°C，反應(yīng)2h，冷卻至室溫；加入 500 μ 1 6%的Na2CO3溶液，混勻，離心，兩相分離；取上層有機相。4. P. putida Sino-PCC 產(chǎn) 2S_mmCoA 的 GC/MS 分析甲基丙二酸鹽及2S-甲基丙二酰輔酶A在酸性條件下與正丁醇反應(yīng)后生成可用于GC/MS分析的甲基丙二酸的二丁基酯。選用氘代甲基丙二酸作為內(nèi)標(biāo)物，在質(zhì)譜圖上， 2S-甲基丙二酰輔酶A衍生化的分子離子峰為MS101，內(nèi)標(biāo)物氘代甲基丙二酸衍生化的分子離子峰為MS104，二者之間無干擾，且在這個質(zhì)量范圍內(nèi)無其它碎片干擾。
GC/MS分析條件如下采用美國安捷倫公司的7000A型氣質(zhì)分析儀。色譜條件 色譜柱:DB5MS(30ymX250ymX0. 25 μ m)；進樣方式脈沖不分流，脈沖壓力14psi，脈沖時間0. 5min ；載氣氦氣；柱流量lmL/min ；進樣口溫度300°C。升溫程序起始溫度 700C (5°C ) ；5°C /min 升至 170°C;30°C /min 升至 300°C，保持 5min ；30°C /min 冷卻至 70°C。 質(zhì)譜條件溶劑延遲:3min ；EM電壓1094V ；質(zhì)量范圍50-550 ；離子源溫度230°C ；四極桿溫度150 0C ；進樣量1.0 μ 1。根據(jù)MSlOl和MS104積分面積的比值，即可計算出2S-甲基丙二酰輔酶A的含量。 實驗發(fā)現(xiàn)P. PUtida Sino-PCC發(fā)酵樣品檢出MSlOl離子峰，其碎片峰型與預(yù)期一致，而原株未檢出MSlOl離子峰，說明基因工程菌株發(fā)酵產(chǎn)生了 2S-mmCoA。P. putida Sino-PCC產(chǎn)生 2S-甲基丙二酰輔酶的GC/MS分析結(jié)果如圖3所示。由此可見，P. putida Sino-PCC發(fā)酵產(chǎn)生了 2S-甲基丙二酰輔酶A，而原株P(guān). putida KT2440未能檢測出2S-甲基丙二酰輔酶A。P. putida Sino-PCC產(chǎn)生2S-甲基丙二酰輔酶A的時間-產(chǎn)量曲線圖如圖4所示， 圖4表明在40個小時胞內(nèi)2S-甲基丙二酰輔酶A的含量最高，達6. 2^mol/mL。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)2S-甲基丙二酰輔酶A的假單胞工程菌，其特征在于，其是將來源于天藍色鏈霉菌(Sterptomyces coelicolor)的編碼丙酰-CoA羧化酶的pccB基因和編碼羧化酶復(fù)合物 A亞單位的accAl基因與篩選標(biāo)記基因一起整合至惡臭假單胞菌O^seudomonas putida) KT2440的基因組中而獲得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述篩選標(biāo)記基因為卡那霉素抗性基因或慶大霉素抗性基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的工程菌，其特征在于，其是將pccB基因和accAl基因與篩選標(biāo)記基因一起整合至惡臭假單胞菌KTM40基因組中rpe基因和trpE基因之間的區(qū)域而獲得。
4.權(quán)利要求3所述工程菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，將所述工程菌接種于LB培養(yǎng)基中， 在30°C下進行培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的工程菌，其特征在于，其是將pccB基因和accAl基因與卡那霉素抗性基因一起整合至惡臭假單胞菌KTM40基因組中rpe基因和trpE基因之間的區(qū)域而獲得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的工程菌，其特征在于，其為惡臭假單胞菌O^eudomonas putida)Sino-PCC，保藏號 CGMCC NO. 4517。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種產(chǎn)2S-甲基丙二酰輔酶A的假單胞工程菌，其是將來源于天藍色鏈霉菌(Sterptomyces coelicolor)的編碼丙酰-CoA羧化酶的pccB基因和編碼羧化酶復(fù)合物A亞單位的accA1基因與篩選標(biāo)記基因一起整合至惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)KT2440的基因組中構(gòu)建得到的。為異源表達需要以2S-甲基丙二酸輔酶A作為前體單元的次級代謝產(chǎn)物的合成提供了基礎(chǔ)，有著廣泛的應(yīng)用價值。
文檔編號C12P19/40GK102154191SQ20111000685
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月13日
發(fā)明者廖志勇, 楊小芳 申請人:北京賽諾百奧生物技術(shù)有限公司